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1、(10)申请公布号 CN 103981169 A (43)申请公布日 2014.08.13 CN 103981169 A (21)申请号 201410196061.X (22)申请日 2014.05.09 C12N 11/10(2006.01) C12N 11/04(2006.01) A23C 9/12(2006.01) (71)申请人 陕西科技大学 地址 710021 陕西省西安市未央区大学园 1 号 (72)发明人 陈合 宋雅娟 舒国伟 刘妮娜 (74)专利代理机构 西安通大专利代理有限责任 公司 61200 代理人 蔡和平 (54) 发明名称 一种利用黄原胶壳聚糖黄原胶制备双歧 杆菌微胶。
2、囊的方法及应用 (57) 摘要 一种利用黄原胶壳聚糖黄原胶制备双歧 杆菌微胶囊的方法及应用， 通过将双歧杆菌冻干 菌粉接种于 MRS 肉汤中， 活化三次后收集菌体得 菌泥， 将菌泥与配制成菌悬液 ； 将菌悬液和黄原 胶溶液混合后加入除氧剂溶液， 混匀后得到双歧 杆菌菌胶液， 将双歧杆菌菌胶液加入壳聚糖溶液 中搅拌获得微胶囊 ； 待微胶囊完全交联后过滤， 与黄原胶溶液再次混合搅拌， 后过滤洗涤， 最终 得到双层的双歧杆菌微胶囊， 微胶囊的活菌数为 3.0 4.5109CFU/g。将制备出的双歧杆菌微胶 囊加入自制酸奶中， 贮存 4 周后， 其活菌数仍大于 106CFU/g， 且酸奶的酸度和pH变。
3、化不大， 从而对酸 奶的品质不会造成影响， 饮用后可有效的发挥其 益生作用。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 (10)申请公布号 CN 103981169 A CN 103981169 A 1/1 页 2 1. 一种利用黄原胶壳聚糖黄原胶制备双歧杆菌微胶囊的方法， 其特征在于 ： 包括 以下步骤 ： 1) 将双歧杆菌冻干菌粉接种于 MRS 肉汤中， 在 37培养条件下 MRS 活化三次， 前两次 以 3 5的接种量转接， 并在 37的条件下培养 22 24h， 第三次按照 2 3。
4、的接种量 转接， 并在 37的条件下培养 18h， 后进行离心处理并收集菌体， 弃去上清液得菌泥， 将菌 泥与浓度为 0.85 0.9的无菌生理盐水混合配制成 1.2 1.3109CFU/mL 的菌悬液备 用 ； 2) 取浓度为 0.5 1.1和 0.1的黄原胶溶液， 灭菌和离心除气处理后备用 ； 3) 取浓度为 0.4 1.3壳聚糖溶液， 调节 pH 至 5 5.9 备用 ； 4) 配制除氧剂溶液， 除氧剂为异抗坏血酸钠或半胱氨酸盐酸盐， 过滤除菌以备使用 ； 5) 将步骤 1) 制备的菌悬液和步骤 2) 制备的浓度为 0.5 1.1的黄原胶溶液按照 1:(310)的质量比例混合后加入步骤4。
5、)制得的除氧剂溶液中， 充分混匀后得到双歧杆菌 菌胶液， 除氧剂的添加量按照菌胶液总量的 0.03 0.07加入， 将双歧杆菌菌胶液加入磁 力搅拌器上的步骤3)制备的壳聚糖溶液中搅拌， 菌胶液与壳聚糖比例为1:(36)， 加入后 搅拌， 获得微胶囊 ； 6)待微胶囊完全交联后过滤， 将过滤后的微胶囊与步骤2)制备的0.1的黄原胶溶液 以 1g:(20 40mL) 混合搅拌， 后将微胶囊过滤， 并洗涤， 最终得到双层的双歧杆菌微胶囊， 微胶囊的活菌数为 3.0 4.5109CFU/g。 2. 根据权利要求 1 所述的一种利用黄原胶壳聚糖黄原胶制备双歧杆菌微胶囊的 方法， 其特征在于 ： 所述的步。
6、骤1)中离心时的转速为700010000r/min， 离心时间为10 15min。 3. 根据权利要求 1 所述的一种利用黄原胶壳聚糖黄原胶制备双歧杆菌微胶囊的 方法， 其特征在于 ： 所述的步骤 2) 中灭菌处理的温度为 ： 80 110， 时间为 10 15min ； 离心除气处理的转速为 ： 5000 7000r/min， 时间为 10 15min。 4. 根据权利要求 1 所述的一种利用黄原胶壳聚糖黄原胶制备双歧杆菌微胶囊的 方法， 其特征在于 ： 所述的步骤 3) 中， 调节 pH 值时使用的试剂为浓度为 1N 的 NaOH 溶液。 5. 根据权利要求 1 所述的一种利用黄原胶壳聚糖。
7、黄原胶制备双歧杆菌微胶囊的 方法， 其特征在于 ： 所述的步骤 5) 中， 将双歧杆菌菌胶液加入磁力搅拌器上的壳聚糖溶液 中的方式为 ： 使用针头规格为0.450.7mm的无菌注射器将双歧杆菌菌胶液以一滴一滴地 方式挤压入磁力搅拌器上的壳聚糖溶液中 ； 且搅拌时间为 30 60min， 菌胶液与壳聚糖比 例为 1:(3 6)。 6. 根据权利要求 1 所述的一种利用黄原胶壳聚糖黄原胶制备双歧杆菌微胶囊的 方法， 其特征在于 ： 所述的步骤 6) 中， 过滤时使用 160 200 目的纱布过滤 ； 洗涤时使用生 理盐水洗涤若干次 ； 搅拌时间为 20 40min。 7. 一种利用黄原胶壳聚糖黄原。
8、胶制备双歧杆菌微胶囊的应用， 其特征在于 ： 在酸 奶中， 以 0.5 1 (w/w) 的加入量将制备的双歧杆菌胶囊加入， 获得含益生菌微胶囊的 液态酸奶。 权 利 要 求 书 CN 103981169 A 2 1/5 页 3 一种利用黄原胶壳聚糖黄原胶制备双歧杆菌微胶囊的 方法及应用 技术领域 0001 本发明属于益生菌制品制备技术领域， 具体涉及一种利用黄原胶壳聚糖黄原 胶制备双歧杆菌微胶囊的方法及应用。 背景技术 0002 双歧杆菌(Bifidobacteria)是由法国Tisser博士从母乳喂养婴儿的粪便中分离 出的一种厌氧菌。 经研究发现， 双歧杆菌是人体肠道中的一种重要的益生菌， 。
9、其在肠道中定 殖的数量往往与人的健康状况存在着关系。双歧杆菌作为一种典型的益生菌， 可通过改善 肠道微生物菌群的平衡而发挥保健功能， 例如具有双向调理胃肠的功能， 抗癌作用， 免疫调 节功能等。但其对氧极为敏感， 对低 pH 值的抵抗力差， 活性保持较为困难。 0003 微胶囊技术具有防止外界环境因素破坏芯材、 有效地控制芯材的释放、 掩盖芯材 的异味、 改变芯材的物理和化学性质， 使其便于贮藏和运输等作用。 可利用微胶囊及技术对 益生菌进行双层包埋， 以便对益生菌起到更强的保护作用。 0004 目前， 利用微胶囊包埋技术保护双歧杆菌的报道很多， 大多数都是利用海藻酸盐 等材料作为包埋壁材对菌。
10、体进行单层或双层包埋。例如， CN1969889A 中公开了一种益生菌 的微胶囊， 该微胶囊是以海藻酸钠和氯化钙为壁材进行单层包埋， 然后用壳聚糖在海藻酸 钙上进行二次包被 ； CN10275589A 中公开的双歧杆菌包埋方法中提到， 先利用果胶对菌体 进行单层包埋， 再利用海藻酸钠进行双层包埋 ； CN1884513A 中也公开一种双层双歧杆菌微 胶囊的制备方法， 该微胶囊用变性淀粉、 阿拉伯胶、 聚乙二醇、 海藻酸钠、 壳聚糖、 氯化钙构 成的壁材进行双层包埋 ； 文献 “双歧杆菌微胶囊的制备和稳定性研究” 公开了一种双层双歧 杆菌微胶囊的制备方法， 它先以明胶、 黄原胶、 果胶等复合胶类。
11、物质包裹双歧杆菌菌体形成 耐酸的保护层， 再以海藻酸钠和壳聚糖交联形成耐酸性能更好的双层微胶囊。 0005 除以上提到的包埋材料之外， 还可以利用壳聚糖与黄原胶的聚电解质络合作用形 成的共混凝胶先对双歧杆菌进行包埋， 再在黄原胶中进行二次成膜， 得到双层包埋的双歧 杆菌微胶囊。此法得到的益生菌微胶囊可应用与果粒橙等液态饮料中， 开发出新型的液态 食品。壳聚糖和和黄原胶都是天然的生物大分子， 生物相容性好， 无毒副作用。壳聚糖溶于 酸性水溶液中带正电荷， 可与带负电荷的阴离子多糖黄原胶通过聚电解质络合作用形成共 凝胶， 从而作为包埋壁材使用。目前还没有利用黄原胶壳聚糖黄原胶双歧杆菌微胶囊 的制备。
12、和应用的发明专利， 为此， 提供一种黄原胶壳聚糖黄原胶制备双歧杆菌微胶囊 及应用的方法是很有必要的。 发明内容 0006 本发明的目的在于克服上述现有技术中存在的缺点， 提供一种利用黄原胶壳聚 糖黄原胶制备双歧杆菌微胶囊的方法及应用， 具有能够提高菌体的包埋产率以及包埋活 菌数， 将制备出的双歧杆菌微胶囊加入果粒橙等饮料中， 可获得新型液态食品的优点。 说 明 书 CN 103981169 A 3 2/5 页 4 0007 为实现上述目的， 一种利用黄原胶壳聚糖黄原胶制备双歧杆菌微胶囊的方 法， 包括以下步骤 ： 0008 1) 将双歧杆菌冻干菌粉接种于 MRS 肉汤中， 在 37培养条件下 。
13、MRS 活化三次， 前 两次以 3 5的接种量转接， 并在 37的条件下培养 22 24h， 第三次按照 2 3的接 种量转接， 并在 37的条件下培养 18h， 后进行离心处理并收集菌体， 弃去上清液得菌泥， 将菌泥与浓度为 0.85 0.9的无菌生理盐水混合配制成 1.2 1.3109CFU/mL 的菌悬 液备用 ； 0009 2) 取浓度为 0.5 1.1和 0.1的黄原胶溶液， 灭菌和离心除气处理后备用 ； 0010 3) 取浓度为 0.4 1.3壳聚糖溶液， 调节 pH 至 5 5.9 备用 ； 0011 4) 配制除氧剂溶液， 除氧剂为异抗坏血酸钠或半胱氨酸盐酸盐， 过滤除菌以备使。
14、 用 ； 0012 5) 将步骤 1) 制备的菌悬液和步骤 2) 制备的浓度为 0.5 1.1的黄原胶溶液按 照 1:(3 10) 的质量比例混合后加入步骤 4) 制得的除氧剂溶液， 充分混匀后得到双歧杆 菌菌胶液， 除氧剂的添加量按照菌胶液总量的 0.03 0.07加入， 将双歧杆菌菌胶液加入 磁力搅拌器上的步骤3)制备的壳聚糖溶液中搅拌， 菌胶液与壳聚糖比例为1:(36)， 加入 后搅拌， 获得微胶囊 ； 0013 6)待微胶囊完全交联后过滤， 将过滤后的微胶囊与步骤2)制备的0.1的黄原胶 溶液以1g:(2040mL)混合搅拌， 后将微胶囊过滤， 并洗涤， 最终得到双层的双歧杆菌微胶 囊。
15、， 微胶囊的活菌数为 3.0 4.5109CFU/g。 0014 所述的步骤 1) 中离心时的转速为 7000 10000r/min， 离心时间为 10 15min。 0015 所述的步骤 2) 中灭菌处理的温度为 ： 80 110， 时间为 10 15min ； 离心除气 处理的转速为 ： 5000 7000r/min， 时间为 10 15min。 0016 所述的步骤 3) 中， 调节 pH 值时使用的试剂为浓度为 1N 的 NaOH 溶液。 0017 所述的步骤 5) 中， 将双歧杆菌菌胶液加入磁力搅拌器上的壳聚糖溶液中的方式 为 ： 使用针头规格为0.450.7mm的无菌注射器将双歧杆。
16、菌菌胶液以一滴一滴地方式挤压 入磁力搅拌器上的壳聚糖溶液中 ； 且搅拌时间为 30 60min。 0018 所述的步骤 6) 中， 过滤时使用 160 200 目的纱布过滤 ； 洗涤时使用生理盐水洗 涤若干次 ； 搅拌时间为 20 40min。 0019 一种利用黄原胶壳聚糖黄原胶制备双歧杆菌微胶囊的应用， 在酸奶中， 以 0.5 1 (w/w) 的加入量将制备的双歧杆菌胶囊加入， 获得含益生菌微胶囊的液态酸 奶。 0020 本发明具有以下的有益效果 ： 相比较现有技术， 大多数的微胶囊包埋壁材是使用 海藻酸盐， 而海藻酸盐在有磷酸、 乳酸等离子存在的环境中， 凝胶中的钙离子被取代下来， 会导。
17、致了凝胶的不稳定， 这就限制其在发酵食品中的应用。另外， 海藻酸盐等食用胶材料， 长期服用会对人体产生一定的副作用。 本发明利用黄原胶壳聚糖黄原胶对双歧杆菌进 行双层包埋， 这就提高了益生菌的包埋率和活菌数， 此方法简单， 操作性强。壳聚糖和和黄 原胶都是天然的生物大分子， 生物相容性好， 无毒副作用。 壳聚糖溶于酸性水溶液中带正电 荷， 可与带负电荷的阴离子多糖黄原胶通过聚电解质络合作用形成共凝胶， 从而作为包埋 壁材使用。另外， 将制备出的双歧杆菌微胶囊加入自制酸奶中， 贮存 4 周后， 其活菌数仍大 说 明 书 CN 103981169 A 4 3/5 页 5 于106CFU/g， 且酸。
18、奶的酸度和pH变化不大， 从而对酸奶的品质不会造成影响， 饮用后可有效 的发挥其益生作用。 具体实施方式 0021 下面结合具体实施方式， 对本发明作详细说明。 0022 一种利用黄原胶壳聚糖黄原胶制备双歧杆菌微胶囊的方法， 包括以下步骤 ： 0023 1) 将双歧杆菌冻干菌粉接种于 MRS 肉汤中， 在 37培养条件下 MRS 活化三次， 前 两次以 3 5的接种量转接， 并在 37的条件下培养 22 24h， 第三次按照 2 3的接 种量转接， 并在 37的条件下培养 18h， 后进行离心处理， 离心转速为 7000 10000r/min， 离心时间 10 15min， 后收集菌体， 弃去。
19、上清液得菌泥， 将菌泥与浓度为 0.85 0.9的无 菌生理盐水混合配制成 1.2 1.3109CFU/mL 的菌悬液备用 ； 0024 2) 取浓度为 0.5 1.1和 0.1的黄原胶溶液， 在 80 110下灭菌 10 15mim， 将灭菌后的黄原胶溶液进行离心除气， 离心转速 5000 7000r/min， 离心时间 10 15min， 后备用 ； 0025 3) 取浓度为 0.4 1.3壳聚糖溶液， 用 1N NaOH 溶液将壳聚糖溶液 pH 调节至 5 5.9， 以备使用 ； 0026 4) 配制除氧剂溶液， 除氧剂为异抗坏血酸钠或半胱氨酸盐酸盐， 过滤除菌以备使 用 ； 0027 。
20、5) 将步骤 1) 制备的菌悬液和步骤 2) 制备的浓度为 0.5 1.1的黄原胶溶液按 照 1:(3 10) 的质量比例混合后加入步骤 4) 制得的除氧剂溶液， 充分混匀后得到双歧杆 菌菌胶液， 除氧剂的添加量按照菌胶液总量的 0.03 0.07加入， 将双歧杆菌菌胶液以一 滴一滴地方式挤压入磁力搅拌器上的步骤3)制备的壳聚糖溶液中搅拌3060min， 菌胶液 与壳聚糖比例为 1:(3 6)， 加入后搅拌， 获得微胶囊 ； 0028 6) 待微胶囊完全交联后用 160 200 目的纱布过滤， 将过滤后的微胶囊与步骤 2) 制备的 0.1的黄原胶溶液以 1g:(20 40mL) 混合搅拌， 搅。
21、拌 20 40min， 后用 160 200 目的纱布将微胶囊过滤， 并用生理盐水洗涤若干次， 最终得到双层的双歧杆菌微胶囊， 微胶 囊的活菌数为 3.0 4.5109CFU/g。 0029 一种利用黄原胶壳聚糖黄原胶制备双歧杆菌微胶囊的应用， 在酸奶中， 以 0.5 1 (w/w) 的加入量将制备的双歧杆菌胶囊加入， 获得含益生菌微胶囊的液态酸 奶。 0030 步骤1)制备过程中所使用的MRS肉汤来自青岛高科技园海博生物技术有限公司。 0031 具体实施例 ： 0032 实施例 1 ： 0033 (1) 将双歧杆菌冻干菌粉接种于 MRS 肉汤中， 在 37培养条件下采用此 MRS 液 体培养。
22、基活化三次， 其中前两次以 3的接种量转接， 并在 37的条件下培养 22h， 第三次 按照 2的接种量转接， 并在 37的条件下培养 18h， 然后离心， 离心转速 7000r/min， 离 心时间 15min， 后弃去上清液得菌泥， 将菌泥与 0.85 0.9的无菌生理盐水混合配制成 1.2109CFU/mL 的菌悬液以备使用 ； 0034 (2) 配制浓度为 0.5和 0.1的黄原胶溶液， 80， 灭菌 15mim。将灭菌后的黄原 说 明 书 CN 103981169 A 5 4/5 页 6 胶溶液进行离心除气， 离心转速 5000r/min， 离心时间 15min， 后备用 ； 003。
23、5 (3) 配制浓度为 0.4壳聚糖溶液， 用 1N NaOH 溶液将壳聚糖溶液 pH 调节至 5， 以 备使用 ； 0036 (4) 制备为异抗坏血酸钠溶液的除氧剂， 过滤除菌 ； 0037 (5)将菌悬液与0.5的黄原胶溶液按照1:3的比例混合， 除氧剂以菌胶液总量的 0.03的添加量加入， 之后摇匀 ； 0038 (6)用针头规格为0.45mm的无菌注射器， 将步骤5)制得的混合液一滴一滴以挤压 方式加入至磁力搅拌器上的步骤 3) 制备的壳聚糖溶液中， 并持续搅拌 30min， 菌胶液与壳 聚糖比例为 1:3， 之后用 160 目的纱布进行过滤得湿胶囊 ； 0039 (7) 将制备好的微。
24、胶囊与 0.1的黄原胶以 1g:20mL 的比例混合， 并不断搅拌 20min， 之后将微胶囊用160目的纱布进行过滤， 并用生理盐水冲洗3次， 得双层双歧杆菌微 胶囊， 微胶囊的活菌数为 3.0109CFU/g ； 0040 (8) 在自制的酸奶中， 以 0.5 (w/w) 的加入量将制备的双歧杆菌微胶囊加入， 获 得含益生菌微胶囊的液态酸奶。 0041 实施例 2 ： 0042 (1) 将双歧杆菌冻干菌粉接种于 MRS 肉汤中， 在 37培养条件下采用此 MRS 液体 培养基活化三次， 其中前两次以 4的接种量转接， 并在 37的条件下培养 23h， 第三次按 照 2.5的接种量转接， 并。
25、在 37的条件下培养 18h， 然后离心， 离心转速 8000r/min， 离 心时间 13min， 后弃去上清液得菌泥， 将菌泥与 0.85 0.9的无菌生理盐水混合配制成 1.25109CFU/mL 的菌悬液以备使用 ； 0043 (2) 配制浓度为 0.7和 0.1的黄原胶溶液， 100， 灭菌 13mim。将灭菌后的黄 原胶溶液进行离心除气， 离心转速 6000r/min， 离心时间 13min， 后备用 ； 0044 (3) 配制浓度为 1壳聚糖溶液， 用 1N NaOH 溶液将壳聚糖溶液 pH 调节至 5.5， 以 备使用 ； 0045 (4) 制备为异抗坏血酸钠溶液的除氧剂， 过。
26、滤除菌 ； 0046 (5)将菌悬液与0.7的黄原胶溶液按照1:7的比例混合， 除氧剂以菌胶液总量的 0.05的添加量加入， 之后摇匀 ； 0047 (6) 用针头规格为 0.6mm 的无菌注射器， 将步骤 5) 制得的混合液一滴一滴以挤压 方式加入至磁力搅拌器上的步骤 3) 制备的壳聚糖溶液中， 并持续搅拌 40min， 菌胶液与壳 聚糖比例为 1:5， 之后用 180 目的纱布进行过滤得湿胶囊 ； 0048 (7) 将制备好的微胶囊与 0.1的黄原胶以 1g:30mL 的比例混合， 并不断搅拌 30min， 之后将微胶囊用180目的纱布进行过滤， 并用生理盐水冲洗4次， 得双层双歧杆菌微 。
27、胶囊， 微胶囊的活菌数为 3.6109CFU/g ； 0049 (8) 在自制的酸奶中， 以 0.7 (w/w) 的加入量将制备的双歧杆菌微胶囊加入， 获 得含益生菌微胶囊的液态酸奶。 0050 实施例 3 ： 0051 (1) 将双歧杆菌冻干菌粉接种于 MRS 肉汤中， 在 37培养条件下采用此 MRS 液体 培养基活化三次， 其中前两次以 5的接种量转接， 并在 37的条件下培养 24h， 第三次按 照 3的接种量转接， 并在 37的条件下培养 18h， 然后离心。离心转速 10000r/min， 离 说 明 书 CN 103981169 A 6 5/5 页 7 心时间 10min， 后弃。
28、去上清液得菌泥， 将菌泥与 0.85 0.9的无菌生理盐水混合配制成 1.3109CFU/mL 的菌悬液以备使用 ； 0052 (2)配制浓度为1.1和0.1的黄原胶溶液， 110， 灭菌10mim， 将灭菌后的黄原 胶溶液进行离心除气， 离心转速 7000r/min， 离心时间 10min， 后备用 ； 0053 (3) 配制浓度为 1.3壳聚糖溶液， 用 1N NaOH 溶液将壳聚糖溶液 pH 调节至 5.9， 以备使用 ； 0054 (4) 制备为半胱氨酸盐酸盐溶液的除氧剂， 过滤除菌 ； 0055 (5) 将菌悬液与 1.1的黄原胶溶液按照 1:10 的比例混合， 除氧剂以菌胶液总量 。
29、的 0.07的添加量加入， 之后摇匀 ； 0056 (6) 用针头规格为 0.7mm 的无菌注射器， 将步骤 5) 制得的混合液一滴一滴地挤压 方式加入至磁力搅拌器上的步骤 3) 制备的壳聚糖溶液中， 并持续搅拌 60min， 菌胶液与壳 聚糖比例为 1:6。之后用 200 目的纱布进行过滤得湿胶囊。 0057 (7) 将制备好的微胶囊与 0.1的黄原胶以 1g:40mL 的比例混合， 并不断搅拌 40min， 之后将微胶囊用200目的纱布进行过滤， 并用生理盐水冲洗5次， 得双层双歧杆菌微 胶囊， 微胶囊的活菌数为 4.0109CFU/g ； 0058 (8) 在自制的酸奶中， 以 1 (w。
30、/w) 的加入量将制备的双歧杆菌微胶囊加入， 获得 含益生菌微胶囊的液态酸奶。 0059 在自制的酸奶中， 以 0.5 1 (w/w) 的加入量将制备的双歧杆菌微胶囊加入， 在 4的条件下贮存， 并以含 107 108CFU/mL 的游离双歧杆菌的酸奶作为对照。存贮 4 周 后， 发现加有微胶囊的酸奶中活菌数虽有不同程度的下降， 但其活菌数仍大于 106CFU/g， 且 酸奶的酸度和 pH 变化不大， 从而对酸奶的品质不会造成影响。未包埋的双歧杆菌活菌数剧 烈下降， 其活菌数小于 105CFU/mL， 未达到益生菌食品要求达到的活菌数标准， 且酸奶的酸 度和 pH 变化较大。所以， 利用黄原胶壳聚糖黄原胶制备的双歧杆菌微胶囊可增强菌体 的抗酸性， 发挥其有益人体健康的作用。 说 明 书 CN 103981169 A 7 。