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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810392901.8 (22)申请日 2018.04.27 (71)申请人 中国肉类食品综合研究中心 地址 100068 北京市丰台区洋桥70号 (72)发明人 邹昊李家鹏田寒友刘飞 白京李文采张振琪王辉 乔晓玲王守伟 (74)专利代理机构 北京路浩知识产权代理有限 公司 11002 代理人 王文君陈征 (51)Int.Cl. C12N 1/02(2006.01) (54)发明名称 一种简单快速的芽孢分离纯化方法 (57)摘要 本发明提供一种简单快速的芽孢分离纯化 方法，。
2、 通过对芽孢和细菌菌体的混悬液进行分 散、 分层沉淀、 选择性悬浮细菌菌体和分离细菌 菌体悬浮液与芽孢沉淀层来达到从混悬液中分 离纯化芽孢的目的。 本方法与现有芽孢分离纯化 方法相比， 操作更简单， 分离纯化的速度更快， 不 使用任何化学试剂、 酶和超声等复杂或可能对芽 孢质量造成影响的操作， 制备的芽孢悬浮液纯度 可达到99以上。 权利要求书1页 说明书4页 附图3页 CN 108485977 A 2018.09.04 CN 108485977 A 1.一种简单快速的芽孢分离纯化方法， 其特征在于， 包括以下步骤： 1)将含芽孢和细菌菌体的混悬液收集到无菌的离心容器中； 2)分散粘连在一起的。
3、细菌菌体和芽孢并使其悬浮于混悬液中； 使芽孢和细菌菌体沉淀 于所述离心容器底部， 分别形成芽孢沉淀层和细菌菌体沉淀层； 移除上清液； 3)再缓慢加入适量的悬浮介质， 以不破坏所述芽孢沉淀层为准； 使细菌菌体重新悬浮 于所述悬浮介质中而芽孢沉淀层保持完整； 移除上层含细菌菌体的悬浮液； 4)向所述离心容器内重新加入适量的悬浮介质； 5)重复步骤2)-4)， 直至所述芽孢沉淀层中芽孢纯度满足要求。 2.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 步骤2)采用振荡的方法分散粘连在一起的 细菌菌体和芽孢并使其悬浮于混悬液中； 振荡速度优选为0-200rpm， 更优选为150-200rpm。 3.根据权利。
4、要求1或2所述的方法， 其特征在于， 步骤2)采用离心方法使芽孢和细菌菌 体沉淀于离心容器底部， 由下到上分别形成芽孢沉淀层和细菌菌体沉淀层； 优选地， 离心转 速为0-60000g， 更优选为700-24000g。 4.根据权利要求1-3任一项所述的方法， 其特征在于， 所述悬浮介质包括水、 悬凝剂溶 液、 密度梯度分离液或其他任何可以将细菌菌体悬浮于其中的介质； 优选为0-4无菌蒸馏 水。 5.根据权利要求1-4任一项所述的方法， 其特征在于， 采用振荡或磁力搅拌的方法， 使 离心容器中的悬浮介质形成涡旋， 冲刷细菌菌体沉淀层， 使细菌菌体剥离并悬浮于悬浮介 质中； 优选地， 当芽孢沉淀层。
5、开始裸露时， 立即停止振荡或磁力搅拌， 以保持芽孢沉淀层的 完整性； 更优选地， 所述振荡或磁力搅拌转速为0-10000rpm， 更佳为50-1500rpm。 6.根据权利要求1-5任一项所述的方法， 其特征在于， 包括以下步骤： 1)将含芽孢和细菌菌体的混悬液收集到无菌的离心容器中， 置于振荡培养箱中振荡； 2)分散粘连在一起的细菌菌体和芽孢并使其悬浮于混悬液中； 振荡条件： 振荡速度： 0- 200rpm， 振荡时间0-90min， 温度： 0-4； 然后离心， 使芽孢和细菌菌体沉淀于离心容器底部， 分别形成芽孢沉淀层和细菌菌体 沉淀层； 移除上清液； 离心条件： 离心转速： 0-6000。
6、0g， 离心时间0-200min， 温度： 0-4； 3)再缓慢加入适量的悬浮介质， 以不破坏所述芽孢沉淀层为准； 振荡或磁力搅拌， 使离 心容器中的悬浮介质形成涡漩， 冲刷细菌菌体沉淀层， 使细菌菌体逐渐剥离并悬浮于悬浮 介质中， 当芽孢沉淀层开始裸露时， 立即停止振荡或磁力搅拌， 使细菌菌体重新悬浮于所述 悬浮介质中而芽孢沉淀层保持完整； 移除上层含细菌菌体的悬浮液； 所述振荡或磁力搅拌 速度为0-10000rpm； 4)向所述离心容器内重新加入适量的悬浮介质； 5)重复步骤2)-4)， 直至所述芽孢沉淀层中芽孢纯度满足要求。 7.根据权利要求1-6任一项所述的方法， 其特征在于， 所制备。
7、的芽孢悬浮液， 芽孢纯度 达到99以上。 8.根据权利要求1-7任一项所述的方法， 其特征在于， 所用微生物包括枯草芽孢杆菌、 嗜热脂肪地芽孢杆菌以及其他产芽孢的细菌。 权利要求书 1/1 页 2 CN 108485977 A 2 一种简单快速的芽孢分离纯化方法 技术领域 0001 本发明涉及微生物学技术领域， 具体涉及一种简单快速的芽孢分离纯化方法。 背景技术 0002 芽孢是某些细菌(芽孢杆菌， 梭状芽孢杆菌， 少数球菌等)在其生长发育后期， 在细 胞内形成的一个圆形或椭圆形， 厚壁， 含水量低， 抗逆性强的休眠体构造。 芽孢的诸多特性 吸引了越来越多的学者对其进行研究。 而进行芽孢相关研。
8、究的第一步就是制备纯净的芽孢 悬浮液。 0003 很多学者在其研究芽孢的文章里介绍了自己制备芽孢悬浮液的方法。 可分为两 类， 第一类是将细菌菌体和芽孢悬浮于无菌蒸馏水中， 细菌菌体在蒸馏水中无法进行正常 的生理代谢活动从而自然死亡解体成菌体碎片， 再通过离心并倾倒上清液的方法将菌体碎 片从混悬液中去除从而得到纯净的芽孢。 取决于细菌菌体数量、 死亡解体的速度和程度， 此 方法通常需要对混悬液进行几次至几十次的离心， 耗时几天到十几天。 且根据文章所述， 此 方法并不能制得很纯净的芽孢悬浮液。 所以该方法不仅费时费力， 所制的芽孢悬液纯度还 不高。 第二类方法是先将芽孢和细菌菌体悬浮于溶菌酶溶。
9、液或溶菌酶和胰蛋白酶的混合溶 液中， 通过酶解作用将细菌菌体破裂成菌体碎片， 再通过离心并倾倒上清液的方法将菌体 碎片从混悬液中去除从而得到纯净的芽孢。 取决于细菌菌体的数量、 酶解液的浓度和酶解 温度， 此方法通常需要先酶解几十分钟到几个小时， 然后再进行若干次离心才能制得较纯 净的芽孢， 耗时几个小时到十几个小时， 而且此方法步骤繁多且操作复杂。 同时一些学者的 研究表明溶菌酶， 在低浓度下(10mg/L)， 会导致芽孢萌发； 在高浓度下(100mg/L)， 不仅会水 解皮层， 还会快速水解芽孢壁， 引起芽孢内膜破裂， 造成胞内物质直接泄漏。 本研究组在进 行相关实验时也发现， 在制备芽孢。
10、悬浮液的过程中如果使用溶菌酶对细菌菌体进行酶解， 制得的芽孢在后续的诱导萌发生长过程中， 只萌发但不生长。 此方法通过酶解作用破裂菌 体细胞， 大大缩短了细菌菌体破裂成菌体碎片的时间， 且制得的芽孢悬液纯度较高。 但是溶 菌酶可能会对芽孢的质量造成影响。 发明内容 0004 本发明的目的是提供一种简单快速的高质量芽孢分离纯化方法。 本发明提供的芽 孢分离纯化方法， 是利用芽孢和细菌菌体因密度不同， 导致离心后会分层沉淀的原理， 经振 荡和离心分层沉淀后， 再选择性将沉淀层中的细菌菌体重新悬浮于蒸馏水中而保持芽孢沉 淀层完整， 从而达到对芽孢进行分离纯化的目的。 此方法通常需要对混悬液进行三到五。
11、次 离心， 耗时四到六小时。 与现有方法相比， 不仅操作更简单， 分离纯化的速度更快， 耗时更 短， 不使用任何化学试剂、 超声等复杂处理或可能对芽孢质量造成影响的操作， 分离纯化的 芽孢质量不受影响且纯度较高。 0005 本发明技术方案如下： 0006 一种简单快速的芽孢分离纯化方法， 包括以下步骤： 说明书 1/4 页 3 CN 108485977 A 3 0007 1)将含芽孢和细菌菌体的混悬液收集到无菌的离心容器中； 0008 2)分散粘连在一起的细菌菌体和芽孢并使其悬浮于混悬液中； 使芽孢和细菌菌体 沉淀于所述离心容器底部， 分别形成芽孢沉淀层和细菌菌体沉淀层； 移除上清液； 000。
12、9 3)再缓慢加入适量的悬浮介质， 以不破坏所述芽孢沉淀层为准； 使细菌菌体重新 悬浮于所述悬浮介质中而芽孢沉淀层保持完整； 移除上层含细菌菌体的悬浮液； 0010 4)向所述离心容器内重新加入适量的悬浮介质； 0011 5)重复步骤2)-4)， 直至所述芽孢沉淀层中芽孢纯度满足要求。 0012 如果芽孢的纯度满足要求， 则可加入少量0-4的无菌蒸馏水制成芽孢悬浮液进 行低温保藏。 0013 本发明方法可用于分离纯化任意细菌菌株形成的芽孢。 例如枯草芽孢杆菌、 嗜热 脂肪地芽孢杆菌以及其他产芽孢的细菌。 0014 本发明所提及的微生物均为已知菌株， 均可市售购得。 0015 进一步地， 离心容。
13、器包括离心管、 离心瓶或其他可以用于振荡和离心的容器。 0016 进一步地， 可采用本领域常规方法分散粘连在一起的细菌菌体和芽孢并使其悬浮 于混悬液中， 包括物理方法(例如振荡)、 化学方法(例如使用单一或混合几种表面活性剂) 和生物方法(例如使用单一或混合几种酶溶液)。 优选采用振荡的方法， 振荡速度为0- 200rpm， 更优选为150-200rpm； 振荡时间为0-90min， 在温度0-4条件下进行(例如振荡培 养箱中)。 实验证明， 采用采用振荡的方法更有利于将混悬液中的细菌菌体和芽孢分散， 方 便快捷。 0017 进一步地， 可采用本领域常规方法使芽孢和细菌菌体沉淀于离心容器底部，。
14、 例如 通过离心、 自然沉降或其他沉淀方法细菌菌体和芽孢根据其密度的大小进行分层沉淀， 由 下到上分别形成芽孢沉淀层和细菌菌体沉淀层。 优选地， 采用离心的方法， 离心转速为0- 60000g(更优选为700-24000g， 离心时间为0-200min， 在温度0-4条件下进行。 实验证明， 采用采用离心的方法更有利于将混悬液中的细菌菌体碎片、 来源于培养基等中的营养物质 和其他小颗粒杂质等物质分离， 更好地形成芽孢沉淀层和细菌菌体沉淀层， 且在后续步骤 用悬浮介质重悬时更有利于保持芽孢沉淀层的完整。 0018 进一步地， 可采用本领域常规方法移除步骤1)所得上清液， 例如通过倾倒、 使用液 。
15、体量取工具进行吸取或其他液体移除方式。 0019 进一步地， 所述悬浮介质包括水(蒸馏水)、 悬凝剂溶液、 密度梯度分离液或其他任 何可以将细菌菌体悬浮于其中的介质； 优选为0-4无菌蒸馏水。 0020 进一步地， 可采用本领域常规方法将悬浮介质加入到步骤1)移除上清液的离心容 器中， 例如通过倾倒、 使用液体量取工具或其他液体添加方式； 以不破坏所述芽孢沉淀层为 准。 0021 进一步地， 可采用本领域常规方法使细菌菌体重新悬浮于所述悬浮介质中而芽孢 沉淀层保持完整， 包括物理方法(例如振荡)、 化学方法(例如使用单一或混合几种表面活性 剂)和生物方法(例如使用单一或混合几种酶溶液)。 优选。
16、采用振荡或磁力搅拌的方法， 使离 心容器中的悬浮介质形成涡旋， 冲刷细菌菌体沉淀层， 使细菌菌体(逐渐)剥离并悬浮于悬 浮介质中； 进一步地， 当芽孢沉淀层开始裸露时， 立即停止振荡或磁力搅拌， 以保持芽孢沉 淀层的完整性。 振荡或磁力搅拌转速优选为0-10000rpm， 更优选为50-1500rpm。 说明书 2/4 页 4 CN 108485977 A 4 0022 进一步地， 可采用本领域常规方法移除步骤2)所得上层含细菌菌体的悬浮液， 例 如通过倾倒、 使用液体量取工具进行吸取或其他液体移除方式。 0023 进一步地， 可采用本领域常规方法例如通过镜检、 染色或其他检验芽孢纯度的方 法。
17、检验芽孢沉淀层中的芽孢纯度是否满足要求， 以此判断是否需要重复步骤2)-4)， 对芽孢 进行进一步纯化。 0024 进一步地， 除振荡、 离心和镜检步骤外， 其他步骤均在无菌环境下进行操作。 0025 本发明所用原料均可市售购得， 或按本领域常规方法制备。 0026 在符合本领域常识的基础上， 上述各优选条件， 可以相互组合， 即得本发明各较佳 实例。 0027 具体地， 上述简单快速的芽孢分离纯化方法， 包括以下步骤： 0028 1)将含芽孢和细菌菌体的混悬液收集到无菌的离心容器中， 置于振荡培养箱中振 荡； 0029 2)分散粘连在一起的细菌菌体和芽孢并使其悬浮于混悬液中； 振荡条件： 振。
18、荡速 度： 0-200rpm， 振荡时间0-90min， 温度： 0-4； 0030 然后离心， 使芽孢和细菌菌体沉淀于离心容器底部， 分别形成芽孢沉淀层和细菌 菌体沉淀层； 移除上清液； 离心条件： 离心转速： 0-60000g， 离心时间0-200min， 温度： 0-4； 0031 3)再缓慢加入适量的悬浮介质， 以不破坏所述芽孢沉淀层为准； 振荡或磁力搅拌， 使离心容器中的悬浮介质形成涡漩， 冲刷细菌菌体沉淀层， 使细菌菌体逐渐剥离并悬浮于 悬浮介质中， 当芽孢沉淀层开始裸露时， 立即停止振荡或磁力搅拌， 使细菌菌体重新悬浮于 所述悬浮介质中而芽孢沉淀层保持完整； 移除上层含细菌菌体的。
19、悬浮液； 所述振荡或磁力 搅拌速度为0-10000rpm； 0032 4)向所述离心容器内重新加入适量的悬浮介质； 0033 5)重复步骤2)-4)， 直至所述芽孢沉淀层中芽孢纯度满足要求。 0034 本发明方法所制备的芽孢悬浮液， 芽孢纯度可达到99以上， 且芽孢始终保持休 眠状态， 活性好。 附图说明 0035 图1为本发明一种简单快速的芽孢分离纯化方法的流程图。 0036 图2为本发明实施例1中芽孢和细菌菌体混悬液的镜检图。 0037 图3为本发明实施例1中细菌菌体悬浮液的镜检图。 0038 图4为本发明实施例1中经分离纯化后芽孢悬浮液的镜检图。 0039 图5为本发明实施例2中经分离纯。
20、化后芽孢悬浮液的镜检图。 具体实施方式 0040 以下实施例用于说明本发明， 但不用来限制本发明的范围。 若未特别指明， 实施例 中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段， 所用原料均为市售商品。 0041 实施例1 0042 应 用 本 发 明 提 供 的 方 法 对 嗜 热 脂 肪 地 芽 孢 杆 菌 ( G e o b a c i l l u s stearothermophilus CICC10392， 可购自中国工业微生物菌种保藏管理中心)的芽孢进行 说明书 3/4 页 5 CN 108485977 A 5 分离纯化， 方法如图1所示， 具体步骤如下： 0043 1)将芽孢和。
21、细菌菌体的混悬液收集到无菌的离心管中。 0044 2)将步骤1)中的离心管置于振荡培养箱中振荡0-90min， 打散粘连在一起的细菌 菌体和芽孢。 振荡速度： 0-200rpm， 温度： 0-4。 0045 3)将步骤2)中的离心管置于离心机中离心0-200min， 离心转速： 0-60000g， 温度： 0-4。 0046 4)将步骤3)中离心管中的上清液倾倒干净。 0047 5)将步骤4)中的离心管倾斜， 并缓慢加入适量0-4的无菌蒸馏水。 0048 6)轻轻摇动步骤5)中的离心管(如果使用离心瓶， 可向离心瓶中加入磁力转子， 使 用磁力搅拌的方式， 转速0-10000rpm)使离心管中的。
22、蒸馏水形成漩涡， 冲刷细菌菌体沉淀 层， 使细菌菌体逐渐剥离并悬浮于蒸馏水中。 当芽孢沉淀层开始裸露时， 立即停止摇动， 保 持芽孢沉淀层完整。 0049 7)将步骤6)中离心管中的细菌菌体悬浮液倾倒干净。 0050 8)对步骤7)中芽孢沉淀层进行镜检。 如果芽孢的纯度不满足要求， 则加入适量0-4 的无菌蒸馏水， 振荡分散粘连在一起的细菌菌体和芽孢并使其悬浮于蒸馏水中， 重复步 骤3)-7)。 如果芽孢的纯度满足要求， 则加入少量0-4的无菌蒸馏水制成芽孢悬浮液进行 低温保藏。 0051 结果见图2-图4： 如图2所示， 分离纯化前， 混悬液中含有大量的细菌菌体， 菌体碎 片和小颗粒杂质。 。
23、混悬液经分离纯化后， 分离出来的细菌菌体悬浮液； 如图3所示， 主要包括 细菌菌体， 菌体碎片和其他小颗粒物质等杂质， 只有极个别的芽孢悬浮于其中。 重复对混悬 液进行分离纯化4次， 耗时5个小时； 所得芽孢悬浮液如图4所示， 芽孢悬浮液的纯度较高， 只 有极个别的菌体碎片残留在芽孢悬浮液中。 这些菌体碎片可通过再次分离纯化而去除。 0052 实施例2 0053 应 用 本 发 明 提 供 的 方 法 对 嗜 热 脂 肪 地 芽 孢 杆 菌 ( G e o b a c i l l u s stearothermophilus CICC10425， 可购自中国工业微生物菌种保藏管理中心)的芽孢进。
24、行 分离纯化， 方法如图1所示， 具体步骤与实施例1基本相同。 重复对混悬液进行分离纯化4次， 所得芽孢悬浮液如图5所示， 芽孢悬浮液的纯度较高， 只有极个别的菌体碎片残留在芽孢悬 浮液中。 0054 虽然， 上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述， 但在 本发明基础上， 可以对之作一些修改或改进， 这对本领域技术人员而言是显而易见的。 因 此， 在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进， 均属于本发明要求保护的范围。 说明书 4/4 页 6 CN 108485977 A 6 图1 图2 说明书附图 1/3 页 7 CN 108485977 A 7 图3 图4 说明书附图 2/3 页 8 CN 108485977 A 8 图5 说明书附图 3/3 页 9 CN 108485977 A 9 。