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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610190022.8 (22)申请日 2016.03.30 C07K 7/16(2006.01) C07K 1/20(2006.01) (71)申请人 吉尔生化 （上海） 有限公司 地址 200241 上海市闵行区紫月路 519 号 (72)发明人 徐红岩 闫凤 (74)专利代理机构 上海浦东良风专利代理有限 责任公司 31113 代理人 张劲风 (54) 发明名称 一种纯化卡贝缩宫素的方法 (57) 摘要 本发明公开了一种利用反相高效液相色谱法 纯化卡贝缩宫素的方法， 主要解决现有技术分离 得到卡贝缩宫素成本高， 操作麻烦， 收。
2、率较低的技 术问题。本发明包括如下步骤 ： 1） 将固体合成所 得粗肽用去离子水溶解， 用固定相为十八烷基键 合硅胶的反相硅胶柱， 流动相含 0.1% 的 TFA 水溶 液为 A 相， 含 0.1% 的 TFA 乙腈溶液为 B 相， 进行 梯度洗脱纯化， 收集目的峰值的肽溶液 ； 2） 利用 HPLC 转盐法交换转成醋酸盐 ； 3） 将最终的高纯度 肽溶液减压旋蒸浓缩冷冻干燥， 得粉末状成品肽。 本发明提出了一条适合产业化纯化卡贝缩宫素的 工艺方法， 达到操作简单易得， 安全且成本低的要 求。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 。
3、说明书3页 附图2页 CN 105646669 A 2016.06.08 CN 105646669 A 1.一种纯化卡贝缩宫素的方法， 采用反相高效液相色谱法， 其特征是包括如下步骤： 1） 将固相合成所得粗肽用去离子水溶解， 固定相为反相硅胶柱， 流动相有两相， 含 0.1%质量百分浓度的三氟乙酸水溶液为A相， 含0.1%质量百分浓度的三氟乙酸乙腈溶液为B 相， 进行梯度洗脱纯化， 收集目的峰值的肽溶液； 2)将纯化后的高纯度肽溶液采用HPLC转盐法交换转成醋酸盐； 3） 将最终的高纯度肽溶液减压旋蒸浓缩冷冻干燥， 得粉末状成品。 2.根据权利要求1所述纯化卡贝缩宫素的方法， 其特征是： 所。
4、述梯度洗脱， 质量百分浓 度的范围值B%=15-65%， 检测波长为220nm。 3.根据权利要求1所述纯化卡贝缩宫素的方法， 其特征是： 所述的反相硅胶柱为十八烷 基硅烷键合硅胶。 4.根据权利要求1所述纯化卡贝缩宫素的方法， 其特征是： 所述的HPLC转盐法， pH为 3.05.0的醋酸水溶液和色谱纯乙腈的两相溶液， 色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶的反相 硅胶柱。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105646669 A 2 一种纯化卡贝缩宫素的方法 技术领域 0001 本发明属于反相HPLC技术领域， 尤其是涉及一种批量化产业化纯化卡贝缩宫素的 方法。 背景技术 0002 卡贝缩宫素是一种。
5、合成的具有激动剂性质的长效催产素九肽类似物。 硬膜外或腰 麻下剖腹产术后可以立即单剂量静脉给药， 以预防子宫张力不足和产后出血。 卡贝缩宫素 的临床和药理特性与天然产生的催产素类似。 像催产素一样， 卡贝缩宫素与子宫平滑肌的 催产素受体结合， 引起子宫的节律性收缩， 在原有的收缩基础上， 增加其频率和增加子宫张 力。 在非妊娠状态下， 子宫的催产素受体含量很低， 在妊娠期间增加， 分娩时达高峰。 因此卡 贝缩宫素对非妊娠的子宫没有作用， 但是对妊娠的子宫和刚生产的子宫具有有效的子宫收 缩作用。 0003 相对于催产素， 卡贝缩宫素的作用时间长， 由此而产生的子宫收缩就不能简单地 通过终止给药而。
6、停止。 所以在婴儿娩出前， 不论任何原因都不能给予卡贝缩宫素， 包括选择 性或药物诱导的生产。 不论是静脉注射还是肌肉注射卡贝缩宫素后， 子宫迅速收缩， 可在2 分钟内达到一个明确强度。 单剂量静脉注射卡贝缩宫素对子宫的活性作用可持续大约1个 小时， 因此足以预防刚生产后的产后出血。 产后给予卡贝缩宫素后， 在收缩的频率与幅度方 面都比催产素为长。 0004 研究表明， 当硬膜外或腰麻下剖腹产术后立即单剂量静脉给予卡贝缩宫素100微 克， 在预防子宫张力不足和减少产后出血方面， 卡贝缩宫素明显优于安慰剂。 在产后的早期 给予卡贝缩宫素也可以促进子宫的复旧。 0005 产后出血是产科临床常见的严。
7、重并发症之一， 是当前我国孕产妇死亡的首要原 因。 在产后出血的四大原因中， 子宫收缩力性出血占首位。 因此， 积极防治子宫收缩乏力性 出血， 是降低孕产妇死亡率的关键。 目前中国仅仅只有2家药厂生产卡贝缩宫素的药剂， 生 产药剂之前首先要确保有可以产业化生产卡贝缩宫素的原料药。 基于卡贝缩宫素在临床上 也具体非常大的应用前景， 具有很高的开发价值， 因此能够产业化的得到高纯度的卡贝缩 宫素精品就变得十分的重要。 0006 申请人去年曾提交1件纯化卡贝缩宫素专利申请， 专利申请号是201510107759.4， 该申请虽然得率较高， 但是在纯化过程中引入不少的无机钠盐， 由于其存储时间短， 纯。
8、化完 毕之后如果没有及时冲洗色谱柱会有很多的无机盐的沉积， 造成色谱柱子的损伤， 需要经 常更换， 进而也增加了纯化的成本。 而经常冲洗色谱柱， 又会延长了大大纯化时间。 因此在 一定收率的基础上如何更好地降低生产成本就是本发明需要研究的课题。 发明内容 0007 本发明的目的在于提供一条适于产业化纯化卡贝缩宫素的方法， 主要解决现有技 术分离得到卡贝缩宫素成本高， 操作麻烦的技术问题。 说明书 1/3 页 3 CN 105646669 A 3 0008 为实现上述目的， 本发明的技术方案如下： 一种纯化卡贝缩宫素的方法， 包括如下步骤： 1） 将固相合成所得粗肽用去离子水溶解， 固定相为反相。
9、硅胶柱， 流动相为： 含0.1%质 量百分浓度的TFA （三氟乙酸） 水溶液为A相， 含0.1%质量百分浓度的TFA乙腈溶液为B相， 进 行梯度洗脱纯化， 收集目的峰值的肽溶液； 2)将纯化后的高纯度肽溶液采用HPLC转盐法交换转成醋酸盐； 3） 将最终的高纯度肽溶液减压旋蒸浓缩冷冻干燥， 得粉末状成品。 0009 更为优选的方案是： 梯度B%： 15-65%， 检测波长为220nm。 0010 更为优选的方案是： 所述的反相硅胶柱为十八烷基键合硅胶的反相硅胶。 0011 更为优选的方案是： 所述的HPLC转盐法， pH为3.05.0的醋酸水溶液和色谱纯乙腈 的两相溶液， 色谱柱为十八烷基键合。
10、硅胶的反相硅胶柱。 0012 本发明的有益效果是： 本发明的提出的一条适于产业化纯化卡贝缩宫素的工艺方 法， 使用反相高效液相色谱法纯化卡贝缩宫素， 并用HPLC转盐法交换转盐， 不仅能得到HPLC 纯度大于98.5%的精肽， 而且可以批量化生产， 在一定收率基础上达到纯度高， 成本低的要 求。 附图说明 0013 图1为实施例1产品色谱图。 0014 图2为实施例2产品色谱图。 0015 图3为实施例3产品色谱图。 具体实施方式 0016 实施例1 1 样品处理： 将合成所得的卡贝缩宫素用去离子水溶解 （溶解浓度约为500mg/ml） ， 用 孔径为0.45um滤膜过滤后收集滤液备用； 2 。
11、纯化 纯化条件： 色谱柱： 以十八烷基硅胶键合硅胶为固定相的色谱柱， 柱子直径和长度为： 10cm30cm.流动相： A相： 含0.05%质量百分浓度的TFA水溶液； B相： 含0.05%质量百分浓度 的TFA乙腈溶液。 流速： 100-120ml/min。 检测波长： 220nm。 梯度： B%： 20-60%， 80-100min。 进样 量为5.1-10.8g； 纯化过程： 将色谱柱用质量百分浓度80%以上的乙腈冲洗干净后上样， 上样量为样品溶 液。 线性梯度洗脱， 收集目的峰， 将收集好的肽溶液放置收集瓶中备用； 3 转盐： 用质量百分浓度90%以上的去离子水冲洗固定相为十八烷基键合硅。
12、胶的反相 硅胶柱， 冲洗干净后 （基本中性） 再用配置好的pH为3.04.5醋酸盐水溶液和色谱纯乙腈两 相溶液平衡色谱柱， 待色谱柱平衡彻底后开始上样转盐， 上样量为已经收集好的目的肽溶 液， 线性梯度洗脱： 先用15-30min质量百分浓度80-90%的醋酸盐水溶液， 再经30-60min质量 百分浓度20-65%的乙腈溶液， 收集全部的目标峰； 4 将转盐后所得的所有肽溶液， 进行减压浓缩至1g/200ml， 浓缩温度不超过37,然后 冷冻干燥得纯度大于98.5%的卡贝缩宫素， 纯化收率可得60%以上。 参见图1。 说明书 2/3 页 4 CN 105646669 A 4 0017 实施例。
13、2 1 样品处理： 将合成所得的卡贝缩宫素用去离子水溶解 （溶解浓度约为500mg/ml） ， 用 孔径为0.45um滤膜过滤后收集滤液备用； 2 纯化 纯化条件： 色谱柱： 以十八烷基硅胶键合硅胶为固定相的色谱柱， 柱子直径和长度为： 10cm30cm.流动相： A相： 含0.1%质量百分浓度的TFA水溶液； B相： 含0.1%质量百分浓度的 TFA乙腈溶液。 流速： 100-120ml/min。 检测波长： 220nm。 梯度： B%： 15-55%， 80-100min。 进样量 为9.0-11.7g； 纯化过程： 将色谱柱用质量百分浓度80%以上的乙腈冲洗干净后上样， 上样量为样品溶 。
14、液。 线性梯度洗脱， 收集目的峰， 将收集好的肽溶液放置收集瓶中备用； 3 转盐： 用质量百分浓度90%以上的去离子水冲洗固定相为十八烷基键合硅胶的反相 硅胶柱， 冲洗干净后 （基本中性） 再用配置好的pH为3.55.0醋酸盐水溶液和色谱纯乙腈两 相溶液平衡色谱柱， 待色谱柱平衡彻底后开始上样转盐， 上样量为已经收集好的目的肽溶 液， 线性梯度洗脱： 先用15-30min质量百分浓度80-90%的醋酸盐水溶液， 再经30-70min质量 百分浓度15-60%的乙腈溶液， 收集全部的目标峰； 4 将转盐后所得的所有肽溶液， 进行减压浓缩至1g/200ml， 浓缩温度不超过37,然后 冷冻干燥得纯。
15、度大于98.5%的卡贝缩宫素， 纯化收率可得70%以上。 参见图2。 0018 实施例3 1 样品处理： 将合成所得的卡贝缩宫素用去离子水溶解 （溶解浓度约为1000mg/ml） ， 用 孔径为0.45um滤膜过滤后收集滤液备用； 2 纯化 纯化条件： 色谱柱： 以十八烷基硅胶键合硅胶为固定相的色谱柱， 柱子直径和长度为： 15cm50cm.流动相： A相： 含0.15%质量百分浓度的TFA水溶液； B相： 含0.15%质量百分浓度 的TFA乙腈溶液。 流速： 150-180ml/min。 检测波长： 220nm。 梯度： B%： 15-65%， 100-120min。 进 样量为18.0-2。
16、0.0g； 纯化过程： 将色谱柱用质量百分浓度80%以上的乙腈冲洗干净后上样， 上样量为样品溶 液。 线性梯度洗脱， 收集目的峰， 将收集好的肽溶液放置收集瓶中备用； 3 转盐： 用质量百分浓度90%以上的去离子水冲洗固定相为十八烷基键合硅胶的反相 硅胶柱， 冲洗干净后 （基本中性） 再用配置好的pH为3.55.5醋酸盐水溶液和色谱纯乙腈两 相溶液平衡色谱柱， 待色谱柱平衡彻底后开始上样转盐， 上样量为已经收集好的目的肽溶 液， 线性梯度洗脱： 先用10-30min质量百分浓度60-80%的醋酸盐水溶液， 再经50-100min质 量百分浓度15-65%的乙腈溶液， 收集全部的目标峰； 4 将。
17、转盐后所得的所有肽溶液， 进行减压浓缩至1g/200ml， 浓缩温度不超过37,然后 冷冻干燥得纯度大于98.5%的卡贝缩宫素， 纯化收率可得75%以上。 参见图3。 0019 综上所述， 用该方法纯化卡贝缩宫素成本低， 操作简单易行， 对于工业化纯化卡贝 缩宫素来说， 安全系数高， 方法简单易得的同时又可以得到高纯度的精品， 确实是一个不错 的纯化方法， 另外在本专利的基础上适当的改进都将需要得到保护。 说明书 3/3 页 5 CN 105646669 A 5 图1 图2 说明书附图 1/2 页 6 CN 105646669 A 6 图3 说明书附图 2/2 页 7 CN 105646669 A 7 。