本发明涉及至少一种硝基氧烷酸和/或其衍生物在减少反刍动物消化活动中 产生的甲烷的形成，和/或提高反刍动物的性能中的用途。
本发明还涉及包括上述这些化合物的动物饲料或动物饲料组合物和饲料添 加剂。术语饲料或饲料组合物是指适合或用于动物摄入的任何化合物、配制品、 混合物、或组分。
在本文中，反刍动物是通过在被称为瘤胃的动物的第一个胃中初步软化， 然后反刍半消化团块(称为倒嚼物)，并再次咀嚼来消化植物基食品的偶蹄目哺 乳动物。再次咀嚼倒嚼物以进一步打破植物物质并刺激消化的过程被称为“反 刍”。反刍哺乳动物包括：牛，山羊，绵羊，长颈鹿，美洲野牛，欧洲野牛，牦 牛，水牛，鹿，骆驼，羊驼，美洲驼，牛羚，羚羊，叉角羚，和蓝牛。
本发明的所有实施方式中，国内的牛，绵羊和山羊为更优选的品种。对于 本发明的目的来说，最优选的品种是国内牛。该术语包括国内牛的所有种族， 和所有产品种类的牛，特别是奶牛和肉牛。
瘤胃发酵带来了一些缺点。甲烷作为厌氧发酵的自然结果，它代表着宿主 动物的能量损失。碳水化合物组成典型奶牛口粮干物质的70％-80％，尽管如此， 碳水化合物在胃肠道中的吸收通常非常有限。其原因是瘤胃中碳水化合物的广 泛发酵导致了作为主要产物的乙酸酯、丙酸酯和丁酸酯的产生。这些产物是所 谓挥发性脂肪酸(VFA)的一部分。
除了能量损失，甲烷还是比二氧化碳强许多倍的一种温室气体。上世纪其 在大气中的浓度增加了一倍，并继续以惊人的速度增加。反刍动物是生物甲烷 形成的主要贡献者，据估计，阻止反刍动物的甲烷形成几乎能稳定大气中的甲 烷浓度。
而且，《京都议定书》的评估增加了减少甲烷排放量作为多气体战略一部分 的优先级。目前减少甲烷形成的最有效的添加剂含有可减少为甲烷生成提供氢 (H2)的微生物繁殖的抗生素。然而，由于快速适应的微生物和/或耐药性的发展 导致短时间内(2至3周)预期效果完全丧失，抗生素对甲烷形成的作用具有一 些缺点。
最近几年出现了关于在动物饲料中使用抗生素的激烈辩论，并且许多国家 都在考虑或已经实施对添加这种类型的饲料添加剂的禁令。
最近已经公开了(WO2010072584)使用体外瘤胃模拟模型测试时非抗生素 产品(胆汁酸衍生物)会减少甲烷排放。然而，产生甲烷排放量适度减少所需 的金额无法与反刍动物饲料行业的成本约束相协调。此外，科学文献中已经描 述了大量天然植物提取物(大蒜WO2009150264，丝兰，肉桂，大黄等)作为 基于体外实验的减少反刍动物甲烷排放的强有力的解决方案。然而，由于副作 用(牛奶中的残留物)，或在体内测试时缺乏有效性，这些没有成为商业化的产 品。
在这种情况下，有必要开发新的物质，其减少甲烷的形成，与符合可靠的 且被普遍接受的实践，并具有非药用性质。除减少甲烷排放量外，这种物质也 可能有助于提高反刍动物的性能，这通过提高饲料转化率、减少摄食量、提高 增重、和/或改善躯体、或牛奶产量来实现。
本发明人惊讶地发现，后文限定的化合物具有在动物饲料中使用的巨大潜 力，以根本上减少甲烷的形成，而不会以不利于宿主动物的方式影响微生物发 酵。此外，本发明的化合物对以饲料转化率、摄食量、增重、躯体产量、牛奶 产量计算的动物的整体性能表现具有巨大的益处。所述化合物也比现有技术中 所公开的那些更稳定，对动物和人类更安全，产生持久的甲烷减排效果，它们 不影响适口性，可以以与动物营养行业兼容的成本工业规模生产，并且最重要 的是，它们不会引起任何代谢产物在所使用动物的乳或肉中的积累。
特别是，已经发现在体外实验中，加入本发明的至少一种硝基氧烷酸和/或 其衍生物，对减少甲烷体外形成和降低体内的总甲烷产量非常有效而不会影响 总VFA的生产。
因此，本发明提供如式(I)所定义的至少一种硝基氧烷酸和/或其衍生物作 为活性化合物在动物饲料中减少反刍动物消化活动中产生的甲烷的形成和/或改 善反刍动物性能的用途。
本发明还提供了一种减少反刍动物消化活动中产生的甲烷的形成和/或改善 反刍动物性能的方法，包括给动物口服足够量的至少一种式(I)所定义的硝基 氧烷酸和/或其衍生物。
在本发明的所有实施方式中，硝基氧烷酸和/或其衍生物由下面的通式(I) 定义，
其中
n包括在0-23之间，优选为0-9，其中，如果n≠0，则碳链是可以为单或多 不饱和的和任意异构形式的线型、环状、或支化的线型或环状的脂肪族碳链，
X独立地是O，NH，或N-R3，其中，如果R1≠H，则X-R1-代表酯或仲酰 胺衍生物，
R1独立地是氢或含有1-10个碳原子，优选1-5个碳原子的直链、环链或支 链的饱和烷基或烯基，
R2独立地是氢或含有1-23个碳原子，优选1-9个碳原子的直链或支链的饱 和烷基或烯基，
R3独立地是氢或含有1-10个碳原子，优选1-5个碳原子的直链、环链或支 链的饱和烷基或烯基。
需要理解，上述通式(I)定义的化合物中当n＞2时，碳链可以是线型的或 在碳链任何位置上支化的。而且，所述碳链可以由在沿碳链的不同位置上的多 个支链支化。此外，当n＞4时，脂肪碳链可能会形成一个环基。环烷基羧酸基 团可以在第2、3、4位上携带硝基氧基团，也可以在多个位置上被任何脂族基 团支化。支化的脂族基团优选为甲基、乙基或丙基。
上述通式(I)中定义的衍生物中，烷基优选为甲基，乙基，丙基，异丙基， 丁基，仲丁基，异丁基，戊基，新戊基，己基，环己基，和2-乙基己基和辛基。 而且，包含3个或更多碳原子的任意烷基或烯基可为直链、支链或环链。除直 链或支化C2-C10-亚链烯基基团外，其应当理解为包含一个或更多(从C4开始) 双键的亚链烯基基团；这种亚链烯基基团的例子为具有通式-CH＝CH-， -CH＝CH-CH2-，-CH＝CH-(CH2)3-和-(CH＝CH)2-的那些。
在一个特定实施方式中，根据本发明的酯优选为甲基、乙基、丙基、异丙 基、丁基、仲丁基、异丁基、戊基、新戊基、己基、2-乙基己基和辛基酯。而且， 优选的酰胺衍生物为甲基酰胺、乙基酰胺、丙基酰胺、丁基酰胺、戊基酰胺、 二甲基酰胺、二乙基酰胺、甲基乙基酰胺。
在另一个实施方式中，更优选通式(I)的衍生物为如下衍生物，其中：
n包括在0-23之间，优选为0-9，其中，如果n≠0，则碳链是可以为单或多 不饱和的和任意异构形式的线型、环状、或支化的线型或环状的脂肪族碳链，
X独立地是O，NH，或N-R3，其中，如果R1≠H，则X-R1-代表酯或仲酰胺 衍生物，
R1、R2、R3都独立地是氢、甲基或乙基。
在另一个实施方式中，更优选的化合物为如下衍生物，其中：
n包括在0-23之间，优选为0-9，其中，如果n≠0，则碳链是可以为单或多 不饱和的和任意异构形式的线型、环状、或支化的线型或环状的脂肪族碳链，
X独立地是O，NH，或N-R3，其中，如果R1≠H，则X-R1-代表酯或仲酰胺 衍生物，且
R2为氢。
在另一个实施方式中，更优选的化合物为如下衍生物，其中：
n包括在0-23之间，优选为0-9，其中，如果n≠0，则碳链是可以为单或多 不饱和的和任意异构形式的线型、环状、或支化的线型或环状的脂肪族碳链，
X为氧(O)，其中，如果R1≠H，则X-R1-代表酯基，且
R2为氢。
在另一个实施方式中，更优选通式(I)的衍生物选自硝基氧乙酸，3-硝基 氧丙酸，4-硝基氧丁酸，5-硝基氧戊酸，6-硝基氧己酸，7-硝基氧庚酸，2-硝基 氧-环己基羧酸，3-硝基氧-环己基羧酸，4-硝基氧-环己基羧酸，8-硝基氧辛酸， 9-硝基氧壬酸，10-硝基氧癸酸，11-硝基氧十一酸，甲基-硝基氧乙酸酯，甲基 -3-硝基氧丙酸酯，甲基-4-硝基氧丁酸酯，甲基5-硝基氧戊酸酯，甲基-6-硝基氧 己酸酯，甲基-7硝基氧庚酸酯，甲基-2-硝基氧-环己基羧酸酯，甲基-3-硝基氧- 环己基羧酸酯，甲基-4-硝基氧-环己基羧酸酯，甲基-8-硝基氧辛酸酯，甲基-9- 硝基氧壬酸酯，甲基-10-硝基氧癸酸酯，甲基-11-硝基氧十一酸酯，乙基-硝基氧 乙酸酯，乙基-3-硝基氧丙酸酯，乙基-4-硝基氧丁酸酯，乙基-5-硝基氧戊酸酯， 乙基-6-硝基氧己酸酯，乙基-7-硝基氧庚酸酯，乙基-2-硝基氧-环己基羧酸酯，乙 基-3-硝基氧-环己基羧酸酯，乙基-4-硝基氧-环己基羧酸酯，乙基-8-硝基氧辛酸 酯，乙基-9-硝基氧壬酸酯，乙基-10-硝基氧癸酸酯，乙基-11-硝基氧十一酸酯， 硝基氧-N-乙酰胺，硝基氧-N-甲基-乙酰胺，硝基氧-N-二甲基-乙酰胺，硝基氧-N- 乙基-乙酰胺，硝基氧-N-二乙基-乙酰胺，硝基氧-N-甲基-乙基-乙酰胺，3-硝基 氧-N-丙酰胺，3-硝基氧-N-甲基-丙酰胺，3-硝基氧-N-二甲基-丙酰胺，3-硝基氧 -N-乙基-丙酰胺，3-硝基氧-N-二乙基-丙酰胺，3硝基氧-N-甲基-乙基-丙酰胺， 4-硝基氧-N-丁酰胺，4-硝基氧-N-甲基-丁酰胺，4-硝基氧-N-二甲基-丁酰胺，4- 硝基氧-N-乙基-丁酰胺，4-硝基氧-N-二乙基-丁酰胺，4-硝基氧-N-甲基-乙基- 丁酰胺，5-硝基氧-N-戊酰胺，5-硝基氧-N-甲基-戊酰胺，5-硝基氧-N-二甲基-戊 酰胺，5-硝基氧-N-乙基-戊酰胺，5-硝基氧-N-二乙基-戊酰胺，5-硝基氧-N-甲基- 乙基-戊酰胺，6-硝基氧-N-戊酰胺，6-硝基氧-N-甲基-戊酰胺，6-硝基氧-N-二 甲基-戊酰胺，6-硝基氧-N-乙基-戊酰胺，6-硝基氧-N-二乙基-戊酰胺，6-硝基氧 -N-甲基-乙基-戊酰胺，2-硝基氧丙酸，甲基-2-硝基氧丙酸酯，乙基-2-硝基氧丙 酸酯，2-硝基氧丁酸，甲基-2-硝基氧丁酸酯，乙基-2-硝基氧丁酸酯，3-硝基氧 丁酸，甲基-3-硝基氧丁酸酯，乙基-3-硝基氧丁酸酯，2，2-二甲基-3-硝基氧丙酸， 甲基-2，2-二甲基-3-硝基氧丙酸酯，乙基-2，2-二甲基-3-硝基氧丙酸酯。
在上述通式(I)定义的衍生物中，考虑到其降低反刍动物产生甲烷的性能， 本发明实施方式最优选的衍生物或通式(I)选自乙基-硝基氧-乙酸酯，3-硝基氧 -丙酸，甲基-3-硝基氧丙酸酯，乙基-3-硝基氧丙酸酯，乙基-2-硝基氧丙酸酯，4- 硝基氧丁酸，乙基-4-硝基氧丁酸酯，乙基-3-硝基氧丁酸酯，5-硝基氧戊酸，乙 基-5-硝基氧戊酸酯，2，2-二甲基-3-硝基氧丙酸，6-硝基氧己酸，乙基-6-硝基氧己 酸酯，8-硝基氧辛酸，乙基-8-硝基氧辛酸酯，11-硝基氧十一酸，乙基-11-硝基氧 十一酸酯，乙基-4-硝基氧-环己烷羧酸酯，5-硝基氧-N-戊酰胺，和5-硝基氧-N- 甲基-戊酰胺，它们的化学结构如表1所示。
表1：本发明最优选的衍生物
所述通式(I)的衍生物更优选选自3-硝基氧丙酸，甲基-3-硝基氧丙酸酯， 乙基-3-硝基氧丙酸酯，乙基-4-硝基氧-丁酸酯，乙基-3-硝基氧丁酸酯，5-硝基氧 戊酸，乙基-5-硝基氧戊酸酯，6-硝基氧己酸，乙基-6-硝基氧己酸酯，乙基-4-硝 基氧-环己烷羧酸酯，8-硝基氧-辛酸，乙基-8-硝基氧辛酸酯，11-硝基氧十一酸， 乙基-11-硝基氧十一酸酯，5-硝基氧-戊酰胺，5-硝基氧-N-甲基-戊酰胺。
此处使用的术语“其衍生物”还包括硝基氧烷酸盐。优选用于制备硝基氧烷 酸盐的阳离子选自由钠(Na+)，钾(K+)，锂(Li+)，镁(Mg2+)，钙(Ca2+)， 钡(Ba2+)，锶(Sr2+)，铵(NH4+)组成的组。盐也可以由碱金属或碱土金属制 得。
原则上，可以根据已知的硝基氧烷酸、酯化或酰基化的合成方法制造本发 明的化合物。
在所有这些情况下，本领域技术人员可以选择合适的方法来纯化所述产品 (通式(I)的化合物)，即通过柱层析，或通式(I)的化合物可以已知的方法分 离和纯化，例如通过添加二乙基乙醚或乙酸乙酯作为溶剂，诱导从反应后的混 合物中分离粗产品，将收集的粗产品与硫酸钠一起干燥。
反刍动物的甲烷排放量可以很容易采用本领域中已知的方法(Grainger等， 2007 J.Dairy Science；90：2755-2766)通过在代谢仓内对单个动物的测量 得到。此外，它也可以通过使用利用激光束的新兴技术(McGinn等，2009， Journal of Environmental Quality；38：1796-1802)在牲口棚水平上评估。 或者，根据WO 2009/156453产乳反刍动物的甲烷产量还可以通过测定乳制品中 的VFA含量进行评估。
反刍动物的性能可以采用本领域中已知的方法进行评估，通常以饲料转化 率、采食量、增重、躯体产量、或牛奶产量为特征。
本发明还涉及至少一种硝基氧烷酸和/或其衍生物与至少一种附加活性物质 组合的用途，所述活性物质显示出对瘤胃中甲烷的形成具有类似效果，并且选 自二烯丙基二硫化物、大蒜油、烯丙基异硫氰酸酯、脱氧胆酸、鹅去氧胆酸及 其衍生物。
可以与根据本发明的化合物一起给予的其它成分为例如酵母菌，精油，如 莫能菌素(Monensin)的离子载体，莫能菌素钠(Rumensin)。
目前预期，异硫氰酸烯丙酯、二烯丙基二硫化物、大蒜油、烯丙基异硫氰 酸酯、脱氧胆酸、鹅去氧胆酸及其衍生物可以在例如0.01-500毫克活性物质每 公斤饲料(ppm)的用量范围内单独给予。这些化合物是市售的或可以由本领域 技术人员采用本领域中众所周知的方法或工艺很容易地制得。
本发明还涉及到至少一种硝基氧烷酸和/或其衍生物的用途，其中当在代谢 仓内测量时，以升每千克摄入干物质计算反刍动物的甲烷产量减少至少10％。 优选，甲烷减排至少15％，更优选，至少20％，更优选，至少25％，最优选， 至少30％。也可以使用像采用激光束或对产乳反刍动物来说可以采用牛奶中的 VFA量来关联甲烷产量以测定甲烷排放量。
本发明还涉及到使用至少一种硝基氧烷酸和/或其衍生物的用途，其中当采 用常规性能检测时，反刍动物饲料转化率降低至少1％。优选，饲料转化率降低 至少2％，更优选，至少2.5％，更优选，至少3％，最优选，至少3.5％。
本发明还涉及到使用至少一种硝基氧烷酸和/或其衍生物的用途，其中给予 反刍动物的通式(I)定义的至少一种活性化合物的量为1毫克到10克每公斤饲 料，优选10毫克到1克每公斤饲料，最优选50毫克至500毫克每公斤饲料。 然而，在动物饲料中使用的硝基氧烷酸及其衍生物不需要那么纯净，它可能例 如包括其他化合物和衍生物。
如上所述，本发明的化合物适用于作为反刍动物的饲料添加剂和动物饲料 组合物的化合物，并且相应地适用于用作这种减少动物消化道内甲烷形成或提 高反刍动物的表现的饲料的有效成分。
为实现其作为反刍动物饲料的成分的用途，所述化合物可以采用已知的饲 料配方和加工方法加入到饲料中。
本发明的另一方面是其配方，即含有按照上述定义的化合物的饲料添加剂 和动物饲料组合物。通过饲料摄入提供给动物的本发明的化合物的正常每日剂 量取决于动物的种类及其状况。通常这一剂量应该在约1毫克到约10克化合物 每千克饲料范围内，优选约1克到约10毫克，更优选，50毫克至500毫克。
所述至少一种硝基氧烷酸和/或其衍生物可以与存在于动物饲料组合物(膳 食)中的常规组分结合使用，如碳酸钙，如氯化铵的电解质，如大豆豆粕的蛋 白，小麦，淀粉，葵花籽粕，玉米，肉类和骨粉，氨基酸，动物脂肪，维生素 和微量元素。
本发明组合物的特别实施例如下：
-一种动物饲料添加剂，包括(a)至少一种选自表1的化合物和(b)至少 一种脂溶性维生素，(c)至少一种水溶性维生素，(d)至少一种微量元素，和 /或(e)至少一种常量元素；
-一种动物饲料组合物，包括至少一种选自表1的化合物和50到800克/千 克饲料的粗蛋白。
所谓的预混料是本发明饲料添加剂的例子。预混料指一个或多个微量成分 与稀释剂和/或载体的优选均匀的混合物。预混料用于促进微量成分在较多量混 合物中的均匀分散。
除了本发明的活性成分，本发明的预混料包含至少一种脂溶性维生素，和/ 或至少一种水溶性维生素，和/或至少一种微量元素，和/或至少一种常量元素。 换句话说，本发明的预混料包括至少一种根据发明的化合物，和至少一种选自 脂溶性维生素、水溶性维生素、微量元素和常量元素的附加成分。
常量元素可独立地添加到饲料中。因此，在一个特定实施例中，本发明的 预混料包括至少一种根据发明的化合物，和至少一种选自由脂溶性维生素、水 溶性维生素、微量元素组成的组的附加成分。
以下为这些组分实施例的非排他性的列表：
-脂溶性维生素的例子为维生素A，维生素D3，维生素E，维生素K，如 维生素K3。
-水溶性维生素的例子为维生素B12，生物素和胆碱，维生素B1，维生素 B2，维生素B6，烟酸，叶酸和泛酸盐，如泛酸钙。
-微量元素的例子为锰，锌，铁，铜，碘，硒，钴。
-常量元素的例子为钙，磷，钠。
作为反刍动物如牛的相关饲料组合物及其成分，反刍动物的日常膳食通常 是由容易降解的部分(称作精料)和富含纤维不太容易降解的部分(称作干草、 草料或粗料)组成。
干草由干燥的草、豆类植物或全谷物制成。草包括猫尾草、黑麦草、羊茅 等等。豆科植物包括三叶草，紫花苜蓿(lucerne)或紫花苜蓿(alfalfa)，豌豆， 蚕豆和野豌豆等等。全谷物包括大麦，玉米(maize或corn)，燕麦，高粱等等。 其他草料包括甘蔗，羽衣甘蓝，油菜，卷心菜。块根作物，如萝卜，芜青甘蓝， mangles，饲料甜菜，甜菜(包括甜菜浆和甜菜糖蜜)也可以用于喂养反刍动物。 其他块茎作物，如马铃薯，木薯和红薯也可以使用。青贮饲料是富含纤维部分 (如草、豆类植物或全谷物)的一种贮藏形式，即高含水量的原料通过受控厌氧 发酵工处理(自然发酵或额外处理)。
精料主要由谷物(如包含谷物和酿酒谷物的大麦，玉米，小麦，高粱)制 得，但也经常含有富含蛋白的饲料成分如大豆，油菜籽，棕榈仁，棉籽和葵花 籽。
奶牛也可以饲喂全混合口粮(TMR)，其中所有的日常膳食成分，如饲料， 青贮饲料和精料在食用前混合。
如上所述，预混料是可能包括根据本发明的活性化合物的饲料添加剂的例 子。应当理解该化合物可以以其他不同形式给予动物，例如化合物也可以包裹 在丸剂中再被放入瘤胃中，其会在特定的时间内不断释放出设定剂量的活性化 合物。
本发明还涉及一种降低反刍动物消化活动中甲烷产量和/或提高反刍动物性 能的方法，包括口服足够量的如通式(I)所定义的至少有一种活性化合物和优 选实施方式所描述的衍生物。
而且，本发明还涉及一种如上所述的方法，其中给予动物至少至少一种活 性物质和至少一种选自二烯丙基二硫醚、大蒜油、异硫氰酸烯丙酯、脱氧胆酸、 鹅去氧胆酸及其衍生物的附加活性物质。
本发明还涉及一种如上所述的方法，其中反刍动物选自牛、山羊、绵羊、 长颈鹿、美洲野牛、欧洲野牛、牦牛、水牛、鹿、骆驼、羊驼、美洲驼、牛羚、 羚羊、叉角羚、和蓝牛组成的组，并且更优选选自牛、山羊和绵羊。
本发明还涉及一种如上所述的方法，其中给予反刍动物的由通式(I)定义 的至少一种活性化合物的量是每千克饲料中约1毫克至约10克化合物，优选约 1克至约10毫克，最优选每千克饲料中约50毫克至500毫克化合物。
本发明还涉及一种如上所述的方法，其中在代谢仓中测量时，以升每千克 干物质摄入量计算的反刍动物甲烷产量减少至少10％。优选，甲烷减少至少 15％，更优选，至少20％，还更优选，至少25％，最优选，至少30％。也可 以使用像采用激光束或对产乳反刍动物来说采用牛奶中的VFA量来关联甲烷产 量以测定甲烷排放量。
本发明还涉及一种如上所述的方法，其中当采用常规性能试验测量时，动 物饲料转化率降低至少1％。优选，饲料转化率降低至少2％，更优选，至少2.5％， 还更优选，至少3％，最优选，至少3.5％。
采用下述实施例进一步阐述本发明，其不应该被解释为限制发明的范围。
实施例
实施例1：甲烷产生的体外试验
使用改良的“Hohenheim饲料价值试验”(Forage Value Test，HFT)来测试 特定化合物对体外模拟瘤胃功能的影响。
方法：
将饲料与瘤胃液和合适的缓冲液混合物加入注射器中。溶液在39℃下培养 8小时后，测量所产生的甲烷的量(和组分)，并代入换算公式。
试剂：
常量元素溶液：
-6.2g磷酸二氢钾(KH2PO4)
-0.6g七水硫酸镁(MgSO4*7H2O)
-9ml浓磷酸(1mol/L)
-溶于蒸馏水中至1L(pH值约1.6)
缓冲溶液：
-35.0g碳酸氢钠(NaHCO3)
-4.0g碳酸氢铵((NH4)HCO3)
-溶于蒸馏水中至1L
微量元素溶液：
-13.2g二水氯化钙(CaCl2*2H2O)
-10.0g四水氯化锰(Ⅱ)(MnCl2*4H2O)
-1.0g六水氯化钴(Ⅱ)(CoCl2*6H2O)
-8.0g氯化铁(Ⅲ)(FeCl3*6H2O)
-在蒸馏水中溶解至100毫升
钠盐溶液：
-100mg钠盐
-在蒸馏水中溶解至100毫升
还原溶液：
-在71.25ml水中先加入3ml氢氧化钠(c＝1mol/L)，然后加入427.5mg硫 化钠水合物(Na2S*H2O)
-溶液必须在加入介质溶液之前不久制备。
步骤：
样品称量：
饲料过筛至1mm-常用TMR(精料44％，干草6％，玉米青贮饲料37％和 13％的牧草青贮饲料)-准确称量至64个注射器中。这些注射器中的4个为基 底对照(substrate controls)，其显示没有测试化合物影响的气体产量。其他4个 注射器是加入溴乙基磺酸钠(bromoethane sulfonate)至0.1mM的阳性对照。如 果需要，4个注射器包含载体对照(如果测试化合物需要载体)，其余的注射器 每4个一组包含测试物质。
介质溶液的制备：
所述组分在Woulff瓶中按照下列顺序混合：
-711ml的水
-0.18ml微量元素溶液
-355.5ml缓冲液
-355.5ml常量元素溶液
将完成的溶液加热至39℃随后加入1.83ml钠盐溶液并在36℃下加入还原 液。当指示剂变为无色时加入瘤胃液体。
提取瘤胃液：
在持续搅拌并通入CO2气体的条件下，将750毫升瘤胃液加入到约1400毫 升介质溶液中。
灌装注射器、孵化并测定气体体积和VFA值：
将稀释瘤胃液(24ml)加入到玻璃注射器中。所述注射器随后在39℃下低 速搅拌孵化8小时。8小时后，测定产生的气体量，并使用气相色谱法测定气相 中的甲烷比例。
结果
被发酵的食物是人工TMR(精料44％，干草6％，玉米青贮饲料37％和牧 草青贮饲料13％)。如实施例3-20中所述生产的化合物以2％至0.01％的干物质 (DM)浓度加入到发酵注射器中。所得结果列于下表。
表2：根据本发明的一些化合物的2个实验的平均甲烷减排效果(“对甲烷 生成的影响(％)”一栏中后面跟有整数的负号是指与对照相比甲烷的减排量； 没有数值意味着浓度未测)
实施例2：体内抑制甲烷试验
1.材料与方法
实验设计由每个阶段每种处理2只羊的交叉设计组成。整个过程有3个连 续阶段：14天的剂量适应期加上连续三天的仓内甲烷测定。确立14天的适应期 是因为该时间段是消除连续时段内不同剂量实验的影响所必需的。在最后两天 的仓内甲烷测量中收集早上饲喂后2小时的瘤胃内容物样品，采样并在提取 DNA前立即冷冻和测量挥发性脂肪酸和氨氮浓度。实验动物2个一组随机分配 为三个小组并进行三种处理中的一个(对照，剂量1和剂量2)。3个分组以三 天的间隔开始适应期，所以它们在仓内甲烷测量之前具有相同的适应天数。每 个动物放入笼子中并不断获得新鲜水。供给动物的日常膳食由切成15至20厘 米的苜蓿干草和比例为1∶1约为1.1倍能源需求维持水平的精料加上矿物质- 维生素补充剂组成(Prieto等，1990)。整个实验过程中监测每个动物每天的新 鲜物质摄入。所述日常膳食在9:00h和14:00h的两餐中平均提供给动物。
与日常膳食同样的时间，所述添加剂每天通过瘤胃插管提供两次。各剂量 组的相应量加入到10克的研磨精料中并在其被放入瘤胃之前用纤维素纸包裹。 为了避免活性分子的挥发，添加剂都被保存在4℃的冷室中，在那里每天进行 将其装入纤维素袋的加工过程。
所述剂量分别为每只动物50(剂量1)和500(剂量2)毫克/每天，较高剂 量在逐渐增加剂量(50，200和500毫克)3天后达到，所以整个适应期相应延 长3天。
在这个实验中测试的添加剂为具有下式的乙基-3-硝基氧丙酸酯：
甲烷的测量
第14天时所述动物被引入甲烷测量仓连续3天。每个测量仓室为1.8米宽 ×1.8米深×1.5米高。仓室内的空气温度保持15至20℃。在每个仓室内，动物 在适应期内被单独约束在相同的笼子里。每天上午8:30h，净化仓室的地板时中 断，并饲喂动物。这些中断干扰对每天的排放影响不大，因为流量每天计算3 次，然后平均得出23小时的排放值。测量每个仓室的进气管和排气管的气流和 甲烷浓度。一天内连续监测每个管室的每个进气管和排气管空气流速。对3个 管道(仓室1，仓室2和背景)的空气流采样，使用气体分析仪ADM MGA3000 (Spurling works，Herts，UK)持续监测甲烷浓度。需要8分钟对2个仓室内(仓 室1和仓室2内3分钟，背景中2分钟)的所有进气和排气管顺序采样。总之， 通过新鲜空气进气口和测量仓室排风口的甲烷浓度的差值和平均空气流速来测 量3天测试期内每天每个测量仓室的甲烷流量。
瘤胃样品分析
瘤胃内容物样品被冻干，并且在进行DNA提取前通过使用珠磨式研磨机 (小型珠磨式研磨机，BioSpec Products，Bartlesville，OK，USA)以物理方式彻底 混合，所述DNA提取是通过使用QIAampDNA Stool Mini Kit(Qiagen Ltd，West Sussex，UK)从大约50毫克的样品进行提取，根据制造商的说明书进行操作但 是使用更高的温度(95℃)用于裂解孵化。DNA样品被用作模板进行定量实 时PCR(定量PCR)扩增。总细菌、总原生动物、总产甲烷菌(methanogenic archae) 的数量通过实时-PCR(qPCR)定量。
不同的引物被用于扩增16S rRNA基因靶向总细菌(Maeda等FEMS Inmunology and Medical Microbiology 39，81-86，2003)，和原生动物 (Sylvester等Journal Dairy Science.88，2083-2095 2005)。设计用于测定产甲 烷菌的引物靶向甲基辅酶M还原酶(mcrA)基因(Denman等FEMS Microbiology Ecology.62，313-322，2007)。在总体积23μL的扩增混合物中含 有11.5μL 2X RT-PCR supermix BioRad(Bio-Rad Laboratories Inc.，Hercules， 加利福尼亚，美国)，每种引物0.4μL(50pmol)和0.5μL样品。每对引物的扩 增效率用下面的程序进行评估：95℃5分钟循环，95℃15秒40个循环，60℃ 30秒，72℃55秒，75℃经过6秒进行荧光检测。通过将温度从55℃增加到 95℃并且每5℃读一次数建立熔解曲线。每个靶向组的扩增通过下面的程序进 行：95℃循环5分钟，95℃15秒40个循环，60℃15秒，72℃45秒(包括荧 光检测)和以45℃为设定点温度和95℃为终点温度的熔解曲线。细菌、原生动 物和产甲烷菌的绝对数量表示为DNA拷贝数，通过使用标准品进行测定。qPCR 标准品由质粒PCR4-TOPO(InvitrogenTM，Carlsbad，加利福尼亚，美国)组成。 对使用各组引物获得的PCR产物进行纯化，然后克隆至PCR4-TOPO质粒 (InvitrogenTM，Carlsbad，加利福尼亚，美国)以生产重组质粒。经PCR核实嵌 入了预期的片段的单个菌落在固体培养基上与抗生素和X-gal过夜生长。之后， 进行转化的大肠杆菌(E.coli)菌落的筛选，并随机选择出一些阳性的(positive)。 在通过PCR确认插入片段在克隆体中存在后，在液体培养基中过夜大规模培养 阳性菌落。使用Pure LinkTM Miniprep试剂盒(InvitrogenTM，Carlsbad，加利福尼 亚，美国)提取属于这些培养物的质粒，然后测序来验证插入片段的存在。使用 质粒DNA的浓度和插入载体的分子量来计算所述质粒提取物中16S rRNA基因 的拷贝数量。浓缩质粒被连续稀释(10倍)以提供108-102的拷贝数。连续稀释 样品用于生成标准曲线。
采用气相色谱仪分析挥发性脂肪酸并用比色法分析氨氮浓度 (Cantalapiedra-Híjar等Journal of Animal Science.87，622-631，2009)。
统计分析
通过个体甲烷排放量，VFA组成概况，醋酸丙酸比，氨氮浓度，以及总细 菌浓度、总原生动物浓度和总产甲烷菌浓度的log10转换值来分析下述指标的效 果：添加剂的剂量，测量天数，并在实验的交叉设计下使用重复测量实验的方 差来分析它们之间的相互作用。用计算机计算每个分析的平均值标准误差 (SEM)。没有在任何实验中检测到测量天数或其与添加剂剂量的相互作用的显 著影响，所以列入表中的只有剂量效果。使用最小显著差异(LSD)程序进一 步比较所述平均值。使用14.0版本的Windows SPSS(2005年；SPSS公司，芝 加哥，IL)进行数据录入统计分析。
2.结果
实验中动物新鲜物质的摄入量没有随适应期改变。同样，处理组之间的体 重(作为仓内测量之前和之后的平均称重)也没有区别(见表3)。当在日常膳 食中加入乙基-3-硝基氧丙酸酯时，甲烷净排放或每单元重量/摄入量都明显减 少，尽管只有使用高剂量时才能达到统计差异(P＜0.05)。剂量1和剂量2观察 到减少分别为18％和29％并且看起来在发生在适应期的最初几天，每个阶段7 天后得到的中间值开始显示出如上所述的相同趋势。
表3：加入乙基-3-硝基氧丙酸酯添加剂对绵羊(平均连续3天测量)体重、 摄食量和甲烷排放量的影响。适应期＝整个适应期的半路数据记录。
e adaptation period.
a，b同一行的值上的上标字母不同表示差异显著，P＜0.05。
*平均体重计为仓内测量前和测量后的平均重量。
瘤胃发酵参数的研究表明接受添加物的动物的瘤胃中的发酵途径(见表4) 朝着更丙酸型转变，尤其是那些高剂量处理的。这反映为随着添加物剂量的增 加减少的醋酸丙酸比例(P＜0.01)。处理后的氨氮浓度也相似。
表4：加入乙基-3-硝基氧丙酸酯添加剂对绵羊瘤胃中的挥发性脂肪酸浓度 (mmol/l)、组成(mol/100mol)、氨氮浓度(mg/100ml)的影响。
a，b同一行的值上的上标字母不同表示差异显著，P＜0.05。
瘤胃中主要微生物群体浓度的研究表明处理组间无明显差异。然而，当动 物接受高剂量的添加剂时，总细菌和产甲烷菌分别观察到了大量的增加和减少。
表5：加入乙基-3-硝基氧丙酸酯添加剂对羊瘤胃中总细菌(16SrRNA)、原 生动物(18SrRNA)和产甲烷菌(mcrΔ基因)浓度(基因拷贝数/g新鲜物质) 的影响
3.结论
显示出乙基3-硝基氧丙酸酯可以作为甲烷的强抑制剂，能引起涉及H2转移 的代谢途径中的转变。
实施例3：3-硝基-氧-丙酸乙酯的合成
将溶解在150ml乙腈中的30mmol的3-溴丙酸乙酯和75mmol亚硝酸银避 光加入烧瓶中。将该悬浮物70℃搅拌5小时，冷却至室温后过滤该悬浮物并在 真空中浓缩。残余物溶解于二氯甲烷中并用水提取。再次用二氯甲烷洗涤水相。 合并的有机相用水和浓盐水洗涤，Na2SO4干燥，在真空中去除溶剂，剩余4.88g (29.9mmol，99.7％)。
实施例4：3-硝基-氧-丙酸的合成
将溶解在120ml乙腈中的14.6mmol的3-溴丙酸和36.5mmol亚硝酸银避光 加入烧瓶中。将该悬浮物70℃搅拌7小时，冷却至室温后过滤该悬浮物并在真 空中浓缩。残余物溶解于二氯甲烷中并用水提取。再次用二氯甲烷洗涤水相。 合并的有机相用水和浓盐水洗涤，Na2SO4干燥，在真空中去除溶剂，剩余1.77g。
通过快速柱层析在硅胶上使用4∶1的己烷/乙酸乙酯纯化粗产品，产量：0.51g (3.77mmol，25.8％)。
实施例5：4-硝基氧丁酸乙酯的合成
将溶解在120ml乙腈中的14.6mmol的4-溴丁酸乙酯和36.5mmol亚硝酸银 避光加入烧瓶中。将该悬浮物70℃搅拌7小时，冷却至室温后过滤该悬浮物并 在真空中浓缩。残余物溶解于二氯甲烷中并用水提取。再次用二氯甲烷洗涤水 相。合并的有机相用水和浓盐水洗涤，Na2SO4干燥，在真空中去除溶剂，剩余 2.63g。
通过快速柱层析在硅胶上使用4∶1的己烷/乙酸乙酯纯化粗产品，产量：1.9g (10.7mmol，73.5％)。
实施例6：4-硝基氧丁酸的合成
将溶解在115ml乙腈中的14.1mmol的4-溴丁酸和35.1mmol亚硝酸银避光 加入烧瓶中。将该悬浮物70℃搅拌6小时，冷却至室温后过滤该悬浮物并在真 空中浓缩。沉淀溶解于二氯甲烷中并用水提取。再次用二氯甲烷洗涤水相。合 并的有机相用水和浓盐水洗涤，Na2SO4干燥，在真空中去除溶剂，剩余1.04g。
通过快速柱层析在硅胶上使用4∶1的己烷/乙酸乙酯纯化粗产品，产量：0.54g (3.6mmol，25.4％)。
实施例7：5-硝基氧戊酸乙酯的合成
将溶解在115ml乙腈中的14.1mmol的5-溴戊酸乙酯和35.1mmol亚硝酸银 避光加入烧瓶中。将该悬浮物70℃搅拌6小时，冷却至室温后过滤该悬浮物并 在真空中浓缩。残余物溶解于二氯甲烷中并用水提取。再次用二氯甲烷洗涤水 相。合并的有机相用水和浓盐水洗涤，Na2SO4干燥，在真空中去除溶剂，剩余 2.66g。
通过快速柱层析在硅胶上使用4∶1的己烷/乙酸乙酯纯化粗产品，产量：2.23g (11.7mmol，83％)。
实施例8：5-硝基氧戊酸的合成
将溶解在200ml乙腈中的78.7mmol的5-溴戊酸和196.75mmol亚硝酸银避 光加入烧瓶中。将该悬浮物70℃搅拌30分钟，冷却至室温后过滤该悬浮物并 在真空中浓缩。残余物溶解于水中并用TMBE提取两次。再次用二氯甲烷洗涤 水相。合并的有机相用水和浓盐水洗涤，结合，Na2SO4干燥，在真空中去除溶 剂，剩余7.54g。
通过快速柱层析在硅胶上使用1∶1的庚烷/乙酸乙酯纯化粗产品，产量：7.19g (44.1mmol，56.0％)。
实施例9：2-硝基-氧丙酸乙酯的合成
将溶解在115ml乙腈中的14.1mmol的2-溴丙酸乙酯和35.1mmol亚硝 酸银避光加入烧瓶中。将该悬浮物70℃搅拌6小时，冷却至室温后过滤该悬浮 物并在真空中浓缩。残余物溶解于二氯甲烷中并用水提取。再次用二氯甲烷洗 涤水相。合并的有机相用水和浓盐水洗涤，Na2SO4干燥，在真空中去除溶剂， 剩余2.02g(12.4mmol，88.1％)。
实施例10：6-硝基氧己酸乙酯的合成
将溶解在100ml乙腈中的48.80mmol的6-溴己酸乙酯和122.0mmol亚 硝酸银避光加入烧瓶中。将该悬浮物70℃搅拌19小时，冷却至室温后过滤该 悬浮物并在真空中浓缩。残余物溶解于二氯甲烷中并用水提取。再次用二氯甲 烷洗涤水相。合并的有机相用水和浓盐水洗涤，Na2SO4干燥，在真空中去除溶 剂，剩余10.06g。
通过快速柱层析在硅胶上使用4∶1的己烷/乙酸乙酯纯化粗产品，产量：9.72g (47.4mmol，97.1％)。
实施例11：6-硝基氧己酸的合成
将19.1mmol 6-硝基氧-己酸乙酯溶解在222毫升1∶1甲醇/四氢呋喃中。在 反应中加入37.5毫升1M氢氧化锂水溶液，将该浑浊液50℃加热18小时，冷 却至室温后，所述溶液在真空中浓缩。用25％的HCl将该溶液的pH值水平调 整至1，并用TMBE提取两次。合并有机相用浓盐水洗涤，Na2SO4干燥，在真 空中去除溶剂，剩余3.43g。
通过快速柱层析在硅胶上使用1∶1的己烷/乙酸乙酯纯化粗产品，产量：2.96g (16.7mmol，87.5％)。
实施例12：3-硝基氧丙酸甲酯的合成
将溶解在40ml乙腈中的10毫摩尔3-溴丙酸甲酯和25mmol亚硝酸银避光 加入烧瓶中。将该悬浮物70℃搅拌5小时，冷却至室温后过滤该悬浮物并在真 空中浓缩。残余物溶解于二氯甲烷中并用水提取。再次用二氯甲烷洗涤水相。 合并的有机相用水和浓盐水洗涤，Na2SO4干燥，在真空中去除溶剂，剩余1.39g。
通过快速柱层析在硅胶上使用5∶1的己烷/乙酸乙酯纯化粗产品，产量：0.43g (2.9mmol，28％)。
实施例13：3-硝基氧丁酸乙酯的合成
将溶解在80ml乙腈中的14.1mmol的3-溴丁酸乙酯和35.1mmol亚硝酸银 避光加入烧瓶中。将该悬浮物70℃搅拌5小时，冷却至室温后过滤该悬浮物并 在真空中浓缩。残余物溶解于二氯甲烷中并用水提取。再次用二氯甲烷洗涤水 相。合并的有机相用水和浓盐水洗涤，Na2SO4干燥，在真空中去除溶剂，剩余 2.03g。
通过快速柱层析在硅胶上使用5∶1的己烷/乙酸乙酯纯化粗产品，产量：1.35g (7.6mmol，53.3％)。
实施例14：8-硝基氧辛酸的合成
将溶解在60ml乙腈中的21.75mmol的8-溴辛酸和54.4mmol亚硝酸银避光 加入烧瓶中。将该悬浮物70℃搅拌20小时30分钟，冷却至室温后过滤该悬浮 物并在真空中浓缩。残余物溶解于水中并用水TMBE提取。有机相用水和浓盐 水洗涤，Na2SO4干燥，在真空中去除溶剂，剩余4.44g。
通过快速柱层析在硅胶上使用1∶1的庚烷/乙酸乙酯纯化粗产品，产量：3.99g (19.4mmol，89.4％)。
实施例15：8-硝基氧辛酸乙酯的合成
将溶解在80ml乙腈中的20mmol的8-溴辛酸乙酯和50.0mmol亚硝酸银避 光加入烧瓶中。将该悬浮物70℃搅拌18小时，冷却至室温后硅胶过滤该悬浮 物，用乙酸乙酯洗涤并在真空中浓缩。
通过快速柱层析在硅胶上使用1∶1的庚烷/乙酸乙酯纯化粗产品，产量：4.35g (18.6mmol，93.2％)。
实施例16：11-硝基氧-十一酸乙酯的合成
将溶解在60ml乙腈中的13.8mmol的11-溴十一酸酸乙酯和34.6mmol亚硝 酸银避光加入烧瓶中。将该悬浮物70℃搅拌19.5小时，冷却至室温后过滤该 悬浮物并在真空中浓缩。残余物溶解于二氯甲烷中并用水提取。再次用二氯甲 烷洗涤水相。有机相用水和浓盐水洗涤，Na2SO4干燥，在真空中去除溶剂，剩 余4.86g。
通过快速柱层析在硅胶上使用20∶1的庚烷/乙酸乙酯纯化粗产品，产量： 3.6g(13.1mmol，95.0％)。
实施例17：11-硝基氧十一酸的合成
将溶解在60ml乙腈中的18.7mmol的11-溴十一酸和46.6mmol亚硝酸银避 光加入烧瓶中。将该悬浮物70℃搅拌21小时30分钟，冷却至室温后过滤该悬 浮物并在真空中浓缩。残余物溶解于水中并用TMBE提取。有机相用水和浓盐 水洗涤，Na2SO4干燥，在真空中去除溶剂，剩余4.34g。
通过快速柱层析在硅胶上使用2∶1的庚烷/乙酸乙酯纯化粗产品，产量：4.01g (16.1mmol，86.2％)。
实施例18：5-硝基氧-戊酸甲基酰胺的合成
5-硝基氧戊酸2的合成：
在50.0毫升含5-溴戊酸1(5.00g，1.0eq)的干乙腈溶液中加入硝酸银(5.10g， 1.1eq)。反应混合物在70℃下加热2小时。通过硅藻土过滤得到的混合物，滤 液在真空条件下浓缩。残余物被溶解进盐酸(1N)(100.0mL)水溶液，用二氯 甲烷(2×100.0mL)提取，用硫酸镁干燥并在真空条件下蒸发溶剂至得到无色液 体化合物2(2.92g，产率＝65％)。
5-硝基氧-戊酸甲基酰胺3的合成：
在化合物2的溶液(1.60g，1.0eq)中加入干燥二氯甲烷(20.0mL)冷却 至0℃后加入三乙胺(1.70mL，1.2eq)，随后加入氯甲酸乙酯(1.10mL，1.1eq)。 反应混合物0℃下搅拌45分钟和加入40％甲基胺水溶液(20.0mL)。该溶液从 0℃至室温(RT)下搅拌18小时，加入硫酸钠以干燥反应混合物。过滤得到的 混合物，滤液在真空条件下浓缩。残余物被吸附在硅胶上并通过快速柱层析 [Biotage，二氯甲烷/甲醇100/0-＞97/3(15CV*)]纯化得到无色液体化合物3 (0.84g，产率＝47％)。
60℃下减压干燥最终化合物18小时。经1H核磁共振观察降解。降解的化 合物被吸附在硅胶上并通过快速柱层析[Biotage，二氯甲烷/甲醇100/0-＞98/2 (15CV)，98/2(4CV)]纯化得到淡黄色液体化合物3(0.59g，产率＝33％)。
室温下1周后没有观察到进一步的降解。
*CV＝柱体积
实施例19：4-硝基氧-环己基羧酸乙酯的合成
0℃下将96％的浓硫酸(1.24mL，2.0eq)滴入100％发烟硝酸中(0.97mL， 2.0eq)。0℃下搅拌10分钟后，滴入化合物1(2.00g，1.0eq)在二氯甲烷(20.0mL) 中的溶液。反应混合物从0℃到RT搅拌3小时，用水(30.0mL)淬灭。使用水 (20.0mL)和浓盐水(20.0mL)洗涤有机层，用硫酸镁干燥，过滤并在真空条件 下浓缩。残余物被吸附在硅胶上并通过快速柱层析[Biotage，二氯甲烷/甲醇 100/0-＞97/3(10CV*)，97/3(5CV)]纯化得到无色液体化合物2(1.47g，产率＝ 58％)。
实施例20：5-硝基氧戊酰胺的合成
5-硝基氧戊酸2的合成：
在50.0毫升含5-溴戊酸1(5.00g，1.0eq)的干乙腈溶液中加入硝酸银(5.10g， 1.1eq)。反应混合物在70℃下加热2小时。通过硅藻土过滤得到的混合物，滤 液在真空条件下浓缩。残余物被溶解进盐酸(1N)(100.0mL)水溶液，用二氯 甲烷(2×100.0mL)提取，用硫酸镁干燥并在真空条件下蒸发溶剂至得到无色液 体化合物2(2.92g，产率＝65％)。
5-硝基氧戊酰胺3合成：
在冷却至0℃的化合物2(1.30g，1.0eq)在干燥二氯甲烷(20.0mL)中的 溶液中加入三乙胺(1.3mL，1.2eq)，随后加入氯甲酸乙酯(0.83mL，1.1eq)。 反应混合物0℃下搅拌45分钟并加入30％氨水溶液(15.0mL)。该溶液从0℃ 至RT下搅拌18小时，加入硫酸钠以干燥反应混合物。过滤得到的混合物，滤 液在真空条件下浓缩。残余物被吸附在硅胶上并通过快速柱层析[Biotage，二氯 甲烷/甲醇100/0-＞98/2(12CV*)，98/2(6CV)]纯化得到白色固体化合物3(1.10g， 产率＝85％)。
60℃下减压干燥最终化合物18小时。经1H核磁共振观察降解。降解的化 合物被吸附在硅胶上并通过快速柱层析[Biotage，二氯甲烷/甲醇100/0-＞98/2 (12CV)，98/2(6CV)]纯化得到白色固体化合物3(0.90g，产率＝70％)。
室温下1周后没有观察到进一步的降解。