一种地衣芽孢杆菌W10抗菌蛋白及应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710660702.6 (22)申请日 2017.08.04 (71)申请人 扬州大学 地址 225009 江苏省扬州市大学南路88号 (72)发明人 纪兆林陈丽丽徐敬友童蕴慧 董京萍宋宏峰 (74)专利代理机构 南京知识律师事务所 32207 代理人 卢亚丽 (51)Int.Cl. C07K 14/32(2006.01) A01N 37/46(2006.01) A01P 3/00(2006.01) A01G 13/00(2006.01) A23B 7/155(2006.0。

2、1) (54)发明名称 一种地衣芽孢杆菌W10抗菌蛋白及应用 (57)摘要 本发明涉及植物病害的生物防治， 属于植物 保护学科中的生物防治研究与应用领域。 具体涉 及一种地衣芽孢杆菌W10的抗菌蛋白及应用。 所 述地衣芽孢杆菌W10抗菌蛋白， 其氨基酸序列SEQ IDNO.1所示。 该菌株的蛋白对桃褐腐病菌、 番茄 灰霉病菌的抑制效果显著。 因此可以此蛋白研发 新型生物农药， 用于生物防治。 权利要求书1页 说明书3页 序列表4页 附图5页 CN 107266539 A 2017.10.20 CN 107266539 A 1.一种地衣芽孢杆菌W10抗菌蛋白， 其特征在于， 其氨基酸序列SEQ 。

3、ID NO.1所示。 2.权利要求1所述的地衣芽孢杆菌W10抗菌蛋白在防治植物病害中的应用。 3.根据权利要求2所述的应用， 其特征在于， 所述植物病害是桃褐腐病菌及番茄灰霉病 菌。 4.权利要求1所述的地衣芽孢杆菌W10抗菌蛋白在采后桃果防腐保鲜中的应用。 权利要求书 1/1 页 2 CN 107266539 A 2 一种地衣芽孢杆菌W10抗菌蛋白及应用 技术领域 0001 本发明涉及植物病害的生物防治， 属于植物保护学科中的生物防治研究与应用领 域。 具体涉及一种地衣芽孢杆菌W10的抗菌蛋白的氨基酸序列。 背景技术 0002 芽孢杆菌(Bacillus spp.)作为一类重要的生防菌， 可。

4、以产生各种抑菌抗菌物质 拮抗植物病原菌， 具有防治植物病害的潜力， 也是生物防治的主要来源。 目前， 许多科研人 员对枯草芽孢杆菌(B.subtilis)以及其它芽孢杆菌的植物病原拮抗作用及其抗菌物质的 研究非常广泛。 芽孢杆菌能够产生多种抑菌物质防治植物病害， 包括细菌素、 细胞壁降解酶 类、 抗菌蛋白、 脂肽类抗生素、 聚酮类化合物和多肽类化合物等。 抗菌蛋白是具有抗真菌活 性的大分子量蛋白类物质， 其氨基酸残基通常在50个以上， 分子量大于5kDa。 研究芽孢杆菌 类生防细菌产生的抗菌蛋白， 一方面可以进行发酵生产， 形成生物农药用于防治植物病害， 替代或减少化学农药使用； 另一方面通过。

5、克隆抗菌蛋白编码基因， 构建高效转基因工程菌 或多重功能工程菌， 进行生产应用。 发明内容 0003 本发明为了给研制新型生物农药提供基础， 丰富生物防治药剂种类， 提供一种抗 菌蛋白的氨基酸序列， 该抗菌蛋白具有较好的抑菌作用。 0004 本发明报述的抗菌蛋白含有448个氨基酸残基， 分子量为48.794kDa抗菌蛋白的氨 基酸序列SEQ ID NO.1所示， 如下： 0005 本发明进一步公开了抗菌蛋白在防治植物病害中的应用。 0006 该抗菌蛋白来自于一株地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)W10的代谢产 物， 可明显抑制桃褐腐病菌及番茄灰霉病菌的生长， 效果与化。

6、学农药相当。 可弥补桃褐腐 病、 番茄灰霉病等病害防控中缺乏的生物防治手段， 该抗菌蛋白用于病害防控， 可部分替代 化学农药或与化学农药复配使用， 在不影响防效的情况下能明显减少化学农药使用， 减少 农药残留和对环境造成的污染， 同时也可延缓病菌产生抗药性， 有助于保证桃果、 番茄等安 全性， 提升农产品质量。 因此可以用该抗菌蛋白研发新型生物农药， 用于桃褐腐病和番茄灰 霉病的生物防治， 特别是采后桃果防腐保鲜的应用。 因此， 该发明及其应用， 不仅能够用于 防治病害， 而且还能有利于增加绿色农产品供给， 推进农业的绿色发展。 0007 在生产中大量制备并应用抗菌蛋白有四种方式： 一是菌株发。

7、酵， 发酵液中含有抗 菌蛋白， 制成菌剂使用。 二是菌株发酵后， 研发抗菌蛋白提取生产工艺， 制成抗菌蛋白产品， 可用于田间防治和采后果蔬防腐处理。 三是可以和化学农药复配使用， 减少农药使用。 我们 也研究了蛋白与化学药剂的复配增效作用， 结果显示， 在两者比例为1： 1时， 蛋白对化学药 剂腐霉利有增效作用， 其EC50值(1.0416 g/mL)与腐霉利(1.2495 g/mL)相当。 四是构建抗菌 蛋白的基因工程菌， 使得抗菌蛋白大量表达， 用于田间防治。 也可以尝试将该蛋白的基因转 入植物中， 从而达到防病效果。 说明书 1/3 页 3 CN 107266539 A 3 0008 本。

8、发明的抗菌蛋白能有效抑制桃褐腐病菌、 番茄灰霉病菌， 效果与化学农药多菌 灵相当， 有防治这些病害的潜力。 而且与化学药剂相比， 应用抗菌蛋白防治植物病害没有环 境污染、 农药残留等问题， 也可用于采后农产品特别是桃果的防腐保鲜。 附图说明 0009 图1是粗蛋白SDS-PAGE电泳图。 M:Marker 1:粗蛋白。 0010 图2是提取的粗蛋白对桃褐腐病菌的拮抗效果。 0011 图3是提取的粗蛋白对番茄灰霉病菌的拮抗效果。 0012 图4是用HiPrep 16/60Sephacryl S-100High Resolution纯化柱经AKTA purifier系统纯化粗蛋白的洗脱图。 001。

9、3 图5是纯化蛋白SDS-PAGE电泳图。 M： Premixed Protein Marker(Low)； 15： 峰 洗 脱液； 67： 峰洗脱液； 810： 峰洗脱液。 0014 图6是纯化后的蛋白对番茄灰霉病菌的拮抗效果。 0015 图7是包含抗菌蛋白基因的PCR扩增电泳图。 M:Marker 1-3:同一基因3个重复。 0016 图8是带酶切位点抗菌蛋白基因PCR扩增电泳图。 M:Marker 1-3:同一基因3个重 复。 0017 图9是菌株基因组双酶切电泳图。 M:Marker 1-3:同一基因3个重复。 0018 图10是pet28a(+)双酶切电泳图。 M:Marker 1-。

10、3:同一基因3个重复。 0019 图11是重组原核表达载体菌落PCR验证电泳图。 M:Marker 1-3:同一基因3个重复。 0020 图12是重组质粒双酶切电泳图。 M:Marker 1-3:同一基因3个重复。 0021 图13是重组质粒转入BL21后抗菌蛋白基因扩增电泳图。 M:Marker 1-3:同一基因3 个重复。 0022 图14是重组蛋白SDS-PAGE电泳图。 M:Marker 1:重组表达蛋白。 具体实施方式 0023 (1)地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)W10(地衣芽孢杆菌W10及其抗菌蛋 白对桃褐腐病的抑制作用。 纪兆林， 贺惠文等， 园艺。

11、学报， 2015， 42(10):1879-1888)用NB培 养液培养(28、 180r/min)72h， 4下8000g离心20min， 上清液经滤器(滤膜孔径0.45 m)过 滤， 滤液用30饱和度的硫酸铵盐析， 4过夜， 收集沉淀， 沉淀溶解在0.05mol/L、 pH 6.8的 Tris-HCl缓冲液中， 透析袋(截留分子量为8.0kDa)中透析48h(定时更换缓冲液)， 再经滤器 (滤膜孔径0.22 m)过滤， 过滤得到的即为粗蛋白， 蛋白经10SDS-PAGE分析， 出现2条条带 (图1)。 将桃褐腐病菌、 番茄灰霉病菌菌丝块(直径6mm)分别接在马铃薯蔗糖琼脂培养基 (PDA)。

12、平板中央， 将50 l的Tris-HCl缓冲液、 粗蛋白分别接到离病原菌20mm的对称位置。 25 培养48h观察抑菌活性， 如图2-3所示， 粗蛋白可明显抑制桃褐腐病菌、 番茄灰霉病菌的生 长。 0024 (2)配制0.2M NaOH、 20乙醇、 1mM NaOH、 0.05mol/L、 pH 6.8的Tris-HCl缓冲液以 及无菌水， 用HiPrep 16/60Sephacryl S-100High Resolution纯化柱经AKTApurifier系统 纯化粗蛋白(图4)， 根据洗脱图收集溶液。 将分别收集的3个峰的溶液经10SDS-PAGE分析， 如图5所示， 只有峰 的溶液显示。

13、出一条与原来大小相似的条带， 并进行质谱鉴定。 将番茄灰 说明书 2/3 页 4 CN 107266539 A 4 霉病菌菌丝块(直径6mm)接在马铃薯蔗糖琼脂培养基(PDA)平板中央， 将50 L的Tris-HCl缓 冲液、 峰 收集的溶液分别接到离病原菌20mm的对称位置。 25培养48h观察抑菌活性， 如图 6所示， 峰 收集的溶液可明显抑制番茄灰霉病菌的生长， 这表明峰 收集得到的是抗菌蛋 白。 0025 (3)根据质谱结果Mascot检索的相似物， 使用Primer 5.0设计特异性引物(up： 5， - AATGCCGTTACAGCCCGCTCAT-3， (SEQ ID NO.2)。

14、,down： 5， -GTAAGTGCCATTGTGATTCCTCC-3， (SEQ ID NO.)3)进行PCR扩增， 得到一条1778bp的条带(图7)， 并送生工测序， SEQ ID NO.6所示。 0026 (4)根据获得的全长序列使用DNAman进行分析， 并结合载体pET-28a(+)的基因序 列， 设计分别带EcoR I、 Xho I酶切位点的特异性引物 0027 (up： 5， -aggaattcATGGGAGGAAAAGTATATATG-3， (SEQ ID NO.4)， 0028 down： 5， -ATActcgagAAAGGTTACTCTTTCGGCAC-3， (SEQ。

15、 ID NO.5)。 以该菌株的基因 组DNA为模板， 进行PCR扩增， 得到一条1347bp的条带(图8)。 0029 (5)在37下使用EcoR I、 Xho I对基因组和载体pET-28a(+)进行双酶切3h(图9- 10)， 使用T4连接酶连接酶切产物， 16过夜。 0030 (6)将连接产物热击转化到DH5 中， 使用步骤4中设计的特异性引物进行PCR扩增 验证(图11)， 并酶切进一步验证(图12)。 0031 (7)构建重组分泌型表达质粒， 将步骤5中抗菌蛋白与载体pET-28a(+)的连接产物 热激转化到大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)中， 进行PCR扩增验证(图13。

16、)， 并送生工测序。 0032 (8)将重组菌株在LA(含Km)平板上划线， 37活化培养， 后接入20mL LB培养液(含 Km)中37条件下， 180r/min过夜培养。 以1： 100接种于100mL LB液体培养基(含Km)中， 37 条件下， 180r/min振荡培养， OD600达到0.6-0.8时， 加入终浓度1.0mM的IPTG， 诱导培养2h。 等分离心收集菌体细胞(4500r/min， 10min， 4)， 加入1/10体积的PBS(pH6.5)， 溶解菌 体， 将菌体悬浮液置于冰上， 进行超声波破碎(共5次， 每次15s， 间隔30s)， 12000r/min， 4 下离。

17、心15min， 回收上清， 上清即为表达的重组蛋白， 经10SDS-PAGE分析， 如图14所示， 有 一条与原来大小相似的条带， 并进行质谱鉴定。 0033 (9)使用DNAman软件检测步骤3测定的核苷酸序列的开放阅读框， 从而得到本抗菌 蛋白的核苷酸序列， 再使用DNAman软件翻译为氨基酸序列,如SEQ ID NO.1。 根据得到的氨 基酸序列， 使用生物信息学软件， 对蛋白进行预测。 利用ProtParam工具分析得知本抗菌蛋 白含有448个氨基酸残基， 分子量为48.794kDa。 使用ProtScale程序分析得知本蛋白为亲水 性蛋白。 使用TMHMM软件得知不存在跨膜区。 使用。

18、SignalP软件得知不存在信号肽。 使用 SMART服务器搜索蛋白结构域， 结果显示含有Peptidase_S8的保守功能域。 0034 实施例2 0035 在我们的室内试验中， 结果表明， 该抗菌蛋白在桃果上应用能较好的防治褐腐病， 能明显推迟病害发生， 浸果处理能显著降低桃果贮藏期的自然腐烂率， 与化学农药多菌灵 类似； 且对桃果品质没有影响。 另外， 在小区试验中， 我们利用提取的粗蛋白喷雾防治番茄 灰霉病叶片病害， 以化学药剂腐霉利为对照， 药后20d调查， 抗菌蛋白防效(65.34)好于腐 霉利(45.29)。 说明书 3/3 页 5 CN 107266539 A 5 SEQUEN。

19、CE LISTING 扬州大学 一种地衣芽孢杆菌W10抗菌蛋白及应用 6 PatentIn version 3.3 1 448 PRT 地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis 1 Met Gly Gly Lys Val Tyr Met Phe Gly Tyr Ser Met Val Gln Met Val 1 5 10 15 Arg Ser Asn Ala His Lys Leu Asp Trp Pro Leu Arg Glu Asn Val Leu 20 25 30 Gln Leu Tyr Lys Pro Phe Lys Trp Thr Pro Cys Phe Leu Hi。

20、s Asn Phe 35 40 45 Phe Glu Lys Lys Val Lys Asn Arg Lys Lys Met Ser Val Ile Ile Glu 50 55 60 Phe Glu Glu Gly Cys His Glu Ser Gly Phe His Ser Thr Gly Gln Val 65 70 75 80 Leu Ser Lys Glu Lys Arg Cys Thr Ile Lys Lys Gln Phe Gln Thr Ile 85 90 95 Asn Cys Cys Ser Ala Glu Val Thr Pro Ser Ala Leu His Met Leu。

21、 Leu 100 105 110 Ser Gln Cys Arg Asp Ile Arg Lys Ile Tyr Leu Asn Arg Glu Val Lys 115 120 125 Ala Leu Leu Asp Thr Ala Thr Glu Ser Ser His Ala Lys Glu Val Thr 130 135 140 Arg Asn Gly Thr Val Leu Thr Gly Lys Gly Val Thr Val Ala Val Ile 145 150 155 160 Asp Thr Gly Ile Tyr His His Pro Asp Leu Glu Gly Arg。

22、 Ile Ile Gly 165 170 175 Phe Ala Asp Phe Val Asn Gln Lys Thr Glu Pro Tyr Asp Asp Asn Gly 180 185 190 His Gly Thr His Cys Ala Gly Asp Ile Ala Ser Ser Gly Ala Ser Ser 195 200 205 Ser Gly Lys Tyr Gln Gly Pro Ala Pro Glu Ala Asp Leu Ile Gly Val 序列表 1/4 页 6 CN 107266539 A 6 210 215 220 Lys Val Leu Asn Ly。

23、s Ser Gly Ser Gly Thr Leu Ala Asp Ile Ile Glu 225 230 235 240 Gly Val Glu Trp Cys Ile Gln Tyr Asn Lys Glu His Thr Lys Asn Pro 245 250 255 Ile Arg Ile Ile Ser Met Ser Leu Gly Gly Asp Ala Leu Lys Tyr Asp 260 265 270 Lys Glu Thr Asp Asp Pro Leu Val Lys Ala Val Glu Glu Ala Trp Asn 275 280 285 Glu Gly Il。

24、e Val Val Cys Val Ala Ala Gly Asn Ser Gly Pro Glu Ala 290 295 300 Gln Thr Ile Ser Ser Pro Gly Val Ser Glu Lys Val Ile Thr Val Gly 305 310 315 320 Ala Tyr Asp Asp Asn Asp Thr Ala Ser Asn Glu Asp Asp Thr Val Ala 325 330 335 Ser Phe Ser Ser Arg Gly Pro Thr Val Tyr Gly Lys Glu Lys Pro Asp 340 345 350 Il。

25、e Leu Ala Pro Gly Val Asp Ile Val Ser Leu Arg Ser Pro Arg Ser 355 360 365 Tyr Leu Asp Lys Leu Gln Lys Ser Asn Arg Val Gly Ser Leu Tyr Phe 370 375 380 Ser Leu Ser Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro Ile Cys Ala Gly Ile Ala 385 390 395 400 Ala Leu Ile Leu Gln Gln Asn Pro Gln Leu Ser Pro Gly Glu Val Lys 405 41。

26、0 415 Thr Leu Ile Arg Gln Ser Pro Asp Gln Trp Thr Asn Glu Asp Pro Asn 420 425 430 Ile Tyr Gly Ala Gly Ala Val Asn Ala Glu Asn Ala Val Pro Lys Glu 435 440 445 2 22 DNA 人工序列 2 aatgccgtta cagcccgctc at 22 3 23 DNA 人工序列 序列表 2/4 页 7 CN 107266539 A 7 3 gtaagtgcca ttgtgattcc tcc 23 4 29 DNA 人工序列 4 aggaattc。

27、at gggaggaaaa gtatatatg 29 5 29 DNA 人工序列 5 atactcgaga aaggttactc tttcggcac 29 6 1778 DNA 地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis 6 ccattttact atggtccgtt ttgaacggag ccgtcttttt tcatatatat aatatcaatc 60 ggaagctgtt tttccaagga gtgtctcaat atgatgttca tgtatatacc cctttccgcc 120 ggattcatta taaaccaaca aacgttccga cccaactc。

28、ga tttcttctcc tgaaaaagcc 180 gcaagtaacc agcgctcctg aaggacaaac aaactgaccg aacttacggc ctgttcatat 240 ggtatagaga gaatcgccag aatgggagga aaagtatata tgtttggtta ctcaatggta 300 caaatggtgc ggtcaaatgc tcataagctg gactggccgc tcagagaaaa cgtattacag 360 ttatataaac ctttcaaatg gacaccttgc tttttacaca attttttcga aaaaaa。

29、ggtg 420 aaaaacagaa agaaaatgtc agtcatcatt gaatttgaag agggctgcca tgaatccggt 480 tttcacagca caggacaggt cttatcaaaa gaaaaacgct gcaccataaa aaagcagttt 540 caaacaatca attgctgcag cgccgaagtc acgccgtccg cccttcacat gcttctttcg 600 caatgccggg atatccgtaa aatctattta aaccgtgaag taaaagctct ccttgataca 660 gcaactgaat 。

30、cgtctcatgc aaaagaagtg acccgtaacg gcaccgtatt aacaggaaaa 720 ggcgtaaccg tcgccgttat tgataccgga atctatcacc atcccgattt agaaggcagg 780 attatcggat ttgcggactt tgtcaaccaa aagacagaac cgtatgatga caacggacac 840 ggcacccatt gcgccggtga tatcgcaagc agcggcgctt catcttcggg taaatatcag 900 gggccggcgc cggaagccga tctgatcgg。

31、a gtcaaggttt taaacaaatc aggatcagga 960 accttggctg atatcattga aggtgtggaa tggtgcatac aatataataa agaacacaca 1020 aagaatccga tcagaatcat cagcatgtcg ctgggcggag atgcgctcaa atatgataaa 1080 gaaacggacg acccgctcgt caaggccgtt gaagaggcat ggaatgaagg aatcgtcgtc 1140 tgcgtcgccg cgggcaactc cggtccggaa gctcaaacga tttc。

32、aagccc cggtgtcagc 1200 序列表 3/4 页 8 CN 107266539 A 8 gagaaggtca tcacggtagg cgcctatgat gacaatgata cagccagcaa tgaggacgat 1260 acggtcgctt ctttctcaag ccgcggcccg acggtgtacg gaaaagagaa gcctgacatt 1320 cttgcgcccg gggtcgatat cgtatctctt cgttctccgc gttcatatct tgacaaatta 1380 cagaaatcaa accgagtagg ctccttgtat tt。

33、cagtctgt cgggcacgtc catggccact 1440 ccgatctgtg cgggcatcgc tgccttaatc cttcagcaaa acccgcagct ttcgcctggc 1500 gaagtgaaaa cattgatcag acaaagtccg gatcaatgga caaatgaaga tccgaacatt 1560 tacggagcgg gcgcagtgaa cgccgaaaac gccgtgccga aagagtaacc tttttatcat 1620 gagaacgggg tcgtctgcac ggcagatgac tccgtttttc aggtgaa。

34、tag atgaaacatt 1680 tataatgaag gaactcggaa cagttcagaa ccggctgtca gaaaaaaaga tcaatgcaag 1740 gcggtgtatt tctaaaaaaa taggaataag tagggtga 1778 序列表 4/4 页 9 CN 107266539 A 9 图1 图2 图3 说明书附图 1/5 页 10 CN 107266539 A 10 图4 图5 说明书附图 2/5 页 11 CN 107266539 A 11 图6 图7 图8 图9 说明书附图 3/5 页 12 CN 107266539 A 12 图10 图11 图12 图13 说明书附图 4/5 页 13 CN 107266539 A 13 图14 说明书附图 5/5 页 14 CN 107266539 A 14 。