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1、(10)授权公告号 CN 101155833 B (45)授权公告日 2011.04.20 CN 101155833 B *CN101155833B* (21)申请号 200680011379.X (22)申请日 2006.03.31 60/669,546 2005.04.08 US C08B 37/00(2006.01) A61K 39/09(2006.01) (73)专利权人 惠氏公司 地址 美国新泽西州 (72)发明人 布赖恩巴勒尔 李初顺 贾森阿诺德洛特温 马克爱德华鲁彭 帕梅拉休芬克沙博诺 (74)专利代理机构 北京律盟知识产权代理有限 责任公司 11287 代理人 刘国伟 EP 0。
2、024493 A,1981.03.11, 全文 . EP 0072513 A,1983.02.23, 全文 . EP 0002404 A,1979.06.13, 全文 . WO 8201995 A,1982.06.24, 全文 . CN 1429276 A,2003.07.09, 全文 . CN 1318103 A,2001.10.17, 全文 . (54) 发明名称 通过 pH 操作将污染物与肺炎链球菌多糖分 离 (57) 摘要 本发明描述一种在纯化之前降低复杂细胞肺 炎链球菌 (Streptococcus pneumoniae) 溶解产 物肉汤中的蛋白质含量且保持其中的荚膜多糖含 量的方法。
3、。 细胞溶解后利用pH值的降低产生始终 符合蛋白质规格的纯化多糖和纯化过程中的较高 多糖回收产量。 (30)优先权数据 (85)PCT申请进入国家阶段日 2007.10.08 (86)PCT申请的申请数据 PCT/US2006/012134 2006.03.31 (87)PCT申请的公布数据 WO2006/110352 EN 2006.10.19 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 褚战星 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 2 页 说明书 8 页 附图 6 页 CN 101155833 B1/2 页 2 1. 一种在纯化之前降低复杂细胞肺炎链球菌。
4、 (Streptococcus pneumoniae) 溶解产物肉 汤中的蛋白质含量且保持其中荚膜多糖含量的方法，所述方法包含以下步骤 ： (a) 使选定肺炎链球菌 (S.pneumoniae) 血清型在大豆基培养基中生长，其包括 ： (i) 向含有所述大豆基培养基的第一个容器接种所述选定血清型的菌种储备物，且培 育所述第一个容器直到生长要求得到满足， (ii) 向含有所述大豆基培养基的第二个容器接种来自步骤 (i) 的培养物，同时在所述 第二个容器中维持稳定的 pH 值和温度，和 (b) 用阴离子型或阳离子型洗涤剂溶解步骤 (a) 中所产生的细菌细胞，从而产生含有 可溶性蛋白质、细胞碎片、核。
5、酸和多糖的溶解产物 ； (c) 搅拌所述细胞溶解产物历时足以确保完全溶解和多糖释放的时间 ； (d) 将所述细胞溶解产物的 pH 值降低到 4.5 与小于 5.5 之间以使所述洗涤剂和大部分 所述可溶性蛋白质沉淀析出 ； (e) 在不搅拌的情况下将步骤 (d) 中所形成的溶液和沉淀保持历时足以使所述沉淀沉 降的时间 ；和 (f) 通过离心和 / 或过滤加工所述溶液和沉淀， 由此溶液中的所述英膜多糖得以保留且所述可溶性蛋白质得以有效减少。 2. 一种在纯化之前降低复杂细胞肺炎链球菌溶解产物肉汤中的蛋白质含量且保持其 中荚膜多糖含量的方法，所述方法包含以下步骤 ： (a) 在大豆基培养基中使选定肺。
6、炎链球菌血清型从开始容器到生产规模容器以递增体 积扩大且在细胞生长期间维持稳定的 pH 值和温度 ； (b) 用阴离子型或阳离子型洗涤剂溶解步骤 (a) 中所产生的细菌细胞，从而产生含有 可溶性蛋白质、细胞碎片、核酸和多糖的溶解产物 ； (c) 搅拌所述细胞溶解产物历时足以确保完全溶解和多糖释放的时间 ； (d) 将所述细胞溶解产物的 pH 值降低到 4.5 与小于 5.5 之间以使所述洗涤剂和大部分 所述可溶性蛋白质沉淀析出 ； (e) 在不搅拌的情况下将步骤 (d) 中所形成的溶液和沉淀保持历时足以使所述沉淀沉 降的时间 ；和 (f) 通过离心和 / 或过滤加工所述溶液和沉淀，由此溶液中的。
7、所述荚膜多糖得以保留 且所述可溶性蛋白质得以有效减少。 3. 根据权利要求 1 或 2 所述的方法，其中所述选定肺炎链球菌血清型为 1、4、5、 6A、6B、7F 或 19A。 4. 根据权利要求 1 或 2 所述的方法，其中步骤 (a) 中的所述 pH 值通过氢氧化钠、碳 酸钠或其组合的碱馈入维持。 5. 一种在纯化之前降低复杂细胞肺炎链球菌溶解产物肉汤中的蛋白质含量且保持其 中荚膜多糖含量的方法，所述方法包含以下步骤 ： (a)使选自由血清型1、4、6A、6B和7F组成的群组的肺炎链球菌血清型在大豆基培 养基中从开始容器到生产规模容器以递增体积扩大，且在细胞生长期间维持稳定的 pH 值 和。
8、温度，所述 pH 值用氢氧化钠维持 ； (b) 用阴离子型或阳离子型洗涤剂溶解步骤 (a) 中所产生的细菌细胞，从而产生含有 权 利 要 求 书 CN 101155833 B2/2 页 3 可溶性蛋白质、细胞碎片、核酸和多糖的溶解产物 ； (c) 搅拌所述细胞溶解产物历时足以确保完全溶解和多糖释放的时间 ； (d) 将所述细胞溶解产物的 pH 值降低到 4.5 与小于 5.5 之间以使所述洗涤剂和大部分 所述可溶性蛋白质沉淀析出 ； (e) 在不搅拌的情况下将步骤 (d) 中所形成的溶液和沉淀保持历时足以使所述沉淀沉 降的时间 ；和 (f) 通过离心和 / 或过滤加工所述溶液和沉淀， 由此溶液。
9、中的所述荚膜多糖得以保留且所述可溶性蛋白质得以有效减少。 6. 一种在纯化之前降低复杂细胞肺炎链球菌溶解产物肉汤中的蛋白质含量且保持其 中荚膜多糖含量的方法，所述方法包含以下步骤 ： (a) 使肺炎链球菌血清型 5 在补充有碳酸氢钠的大豆基培养基中从开始容器到生产规 模容器以递增体积扩大，且在细胞生长期间维持稳定的 pH 值和温度，所述 pH 值用氢氧 化钠维持 ； (b) 用阴离子型或阳离子型洗涤剂溶解步骤 (a) 中所产生的细菌细胞，从而产生含有 可溶性蛋白质、细胞碎片、核酸和多糖的溶解产物 ； (c) 搅拌所述细胞溶解产物历时足以确保完全溶解和多糖释放的时间 ； (d) 将所述细胞溶解产。
10、物的 pH 值降低到 4.5 与小于 5.5 之间以使所述洗涤剂和大部分 所述可溶性蛋白质沉淀析出 ； (e) 在不搅拌的情况下将步骤 (d) 中所形成的溶液和沉淀保持历时足以使所述沉淀沉 降的时间 ；和 (f) 通过离心和 / 或过滤加工所述溶液和沉淀，由此溶液中的所述荚膜多糖得以保留 且所述可溶性蛋白质得以有效减少。 7. 一种在纯化之前降低复杂细胞肺炎链球菌溶解产物肉汤中的蛋白质含量且保持其 中荚膜多糖含量的方法，所述方法包含以下步骤 ： (a)使肺炎链球菌血清型19A在补充有碳酸氢钠的大豆基培养基中从开始容器到生产 规模容器以递增体积扩大，且在细胞生长期间维持稳定的 pH 值和温度，所。
11、述 pH 值用碳 酸钠维持 ； (b) 用阴离子型或阳离子型洗涤剂溶解步骤 (a) 中所产生的细菌细胞，从而产生含有 可溶性蛋白质、细胞碎片、核酸和多糖的溶解产物 ； (c) 搅拌所述细胞溶解产物历时足以确保完全溶解和多糖释放的时间 ； (d) 将所述细胞溶解产物的 pH 值降低到 4.5 与小于 5.5 之间以使所述洗涤剂和大部分 所述可溶性蛋白质沉淀析出 ； (e) 在不搅拌的情况下将步骤 (d) 中所形成的溶液和沉淀保持历时足以使所述沉淀沉 降的时间 ；和 (f) 通过离心和 / 或过滤加工所述溶液和沉淀，由此溶液中的所述荚膜多糖得以保留 且所述可溶性蛋白质得以有效减少。 8. 根据权利。
12、要求 1、2、5、6 或 7 中任一权利要求所述的方法，其中所述洗涤剂为脱 氧胆酸钠。 权 利 要 求 书 CN 101155833 B1/8 页 4 通过 pH 操作将污染物与肺炎链球菌多糖分离 技术领域 0001 本发明涉及从用于生产肺炎球菌多糖 (pneumococcal polysaccharide) 的肺炎链球 菌(Streptococcus pneumoniae，S.pneumoniae)血清型的细胞溶解产物中去除过量可溶性蛋 白质的方法。 背景技术 0002 用于疫苗产品的各肺炎链球菌血清型的荚膜多糖通过使有机体在复杂液体培养 基中生长产生。 有机体群体通常从菌种小瓶到菌种瓶按比。
13、例增加且经由一个或一个以上 具有递增体积的菌种发酵罐传代直到达到生产规模发酵体积。 生长周期的终点可通过数 种方法中的一种确定，此时通过添加有助于细胞壁分解和在细胞达到稳定期时引起细胞 溶解的自溶素 (autolysin) 释放的洗涤剂使细胞溶解。 然后，收集溶解产物肉汤用于下游 (纯化)加工。 所述纯化包括数个管柱色谱和渗滤步骤以回收包围细菌细胞的荚膜多糖。 当将多糖与诸如 CRM197的高分子量蛋白质接合且调配为含有具有多种血清型的接合物的 疫苗时，在将其注射入诸如婴儿和幼儿的目标群体时，其有助于给予免疫性 ( 对肺炎链 球菌 )。 0003 已设定各血清型的纯化多糖中蛋白质含量的规格以降。
14、低因疫苗导致的不利结果 的危险。 举例来说，在当前销售的 7 价肺炎球菌接合物 (7vPnC) 疫苗 (Prevnar) 中， 纯化血清型 4 多糖中蛋白质含量的规格为以干重计不大于 3且纯化血清型 6B 多糖中蛋 白质含量的规格为以干重计不大于 2。 0004 在一些情况下，已证明难以移除在整个纯化过程后仍存在的残余蛋白质。 通过 改变细胞溶解产物的纯化过程解决这一问题所做的努力仅获得中等成果。 0005 因此，决定在这一过程的上游侧着手解决这一问题。 确定主要污染蛋白质为细 胞生长和完整性的关键。 因此，可用于降低总蛋白质的剩余选择由改变生长和 / 或收集 条件组成。 0006 发酵过程相。
15、当简单。 将细胞 ( 菌种 ) 在具有大豆基培养基的瓶中扩大，然后经 由一或两个菌种发酵罐传代，且最终传代至生产规模发酵罐中。 在各步骤中，严密监测 温度和 pH 值，其中 pH 值通过添加碱性物质 (20碳酸钠 ) 加以控制。 当生长达到某一 点时，通过引入启始细胞溶解过程的诸如脱氧胆酸钠(DOC)的洗涤剂结束操作。 一段保 持时间后，将溶解产物肉汤的 pH 值调节到 6.6 以使脱氧胆酸盐和细胞膜复合物沉淀。 将 这一物质保持直到可通过离心和过滤加工以移除固体。 0007 然而，大量蛋白质仍溶解于澄清溶解产物中，从而使得纯化多糖中的残余蛋白 质含量超出规格。 因此，对在发酵或纯化过程中降低。
16、数种肺炎球菌血清型中的可溶性蛋 白质含量存在需要。 发明内容 0008 本发明通过提供一种在纯化之前降低复杂细胞肺炎链球菌溶解产物肉汤中的蛋 说 明 书 CN 101155833 B2/8 页 5 白质含量且保持其中荚膜多糖含量的方法满足这一需要。 这一方法包含以下步骤 ： 0009 (a) 使选定肺炎链球菌血清型在大豆基培养基中生长，其包括 ： 0010 (i) 向含有大豆基培养基的第一个容器接种选定血清型的菌种储备物，且培育第 一个容器直到生长要求得到满足，和 0011 (ii) 向含有大豆基培养基的第二个容器接种来自步骤 (i) 的培养物，同时在第二 个容器中维持稳定的 pH 值和温度，。
17、和 0012 (b) 用洗涤剂溶解步骤 (a) 中所产生的细菌细胞，从而产生含有可溶性蛋白质、 细胞碎片、核酸和多糖的溶解产物 ； 0013 (c) 搅拌细胞溶解产物历时足以确保完全溶解和多糖释放的时间 ； 0014 (d)将细胞溶解产物的pH值降低到小于5.5以使洗涤剂和大部分可溶性蛋白质沉 淀析出 ； 0015 (e) 在不搅拌的情况下将步骤 (d) 中所形成的溶液和沉淀保持历时足以使沉淀沉 降的时间 ；和 0016 (f) 通过离心和 / 或过滤加工溶液和沉淀，由此溶液中的荚膜多糖得以保留且可 溶性蛋白质得以有效减少。 0017 选择作为本发明的这一实施例的例示性非限制性肺炎链球菌血清型。
18、为 1、4、5、 6A、6B、7F 和 19A。 在本发明的一特定实施例中且视步骤 (a) 中所生长的血清型而定， 通过氢氧化钠、碳酸钠或其组合的碱馈入维持步骤 (a) 中的发酵 pH 值。 在另一实施例 中，将步骤 (d) 中的 pH 值降低到 4.5 与小于 5.5 之间。 在又一实施例中，洗涤剂为脱氧 胆酸钠。 0018 本发明也涉及一种在纯化之前降低复杂细胞肺炎链球菌溶解产物肉汤中的蛋白 质含量且保持其中荚膜多糖含量的方法。 这一方法包含以下步骤 ： 0019 (a) 在大豆基培养基中使选定肺炎链球菌血清型从开始容器到生产规模容器以递 增体积扩大且在细胞生长期间维持稳定的 pH 值和温。
19、度 ； 0020 (b) 用洗涤剂溶解步骤 (a) 中所产生的细菌细胞，从而产生含有可溶性蛋白质、 细胞碎片、核酸和多糖的溶解产物 ； 0021 (c) 搅拌细胞溶解产物历时足以确保完全溶解和多糖释放的时间 ； 0022 (d)将细胞溶解产物的pH值降低到小于5.5以使洗涤剂和大部分可溶性蛋白质沉 淀析出 ； 0023 (e) 在不搅拌的情况下将步骤 (d) 中所形成的溶液和沉淀保持历时足以使沉淀沉 降的时间 ；和 0024 (f) 通过离心和 / 或过滤加工溶液和沉淀，由此溶液中的荚膜多糖得以保留且可 溶性蛋白质得以有效减少。 0025 选择作为本发明的这一实施例的例示性非限制性肺炎链球菌血。
20、清型为 1、4、5、 6A、6B、7F 和 19A。 在本发明的一特定实施例中且视步骤 (a) 中所生长的血清型而定， 通过氢氧化钠、碳酸钠或其组合的碱馈入维持步骤 (a) 中的发酵 pH 值。 在另一实施例 中，将步骤 (d) 中的 pH 值降低到 4.5 与小于 5.5 之间。 在又一实施例中，洗涤剂为脱氧 胆酸钠。 0026 在又一实施例中，当血清型为血清型 5 或 19A 时，用碳酸氢钠补充大豆基培养 说 明 书 CN 101155833 B3/8 页 6 基。 0027 本发明允许从细胞溶解产物中移除大量过量蛋白质污染物，从而产生供纯化用 的较洁净产物 ( 无细胞肉汤 (Cell F。
21、ree Broth) 或 CFB)，这一产物通常将获得比使用先前 发酵和回收法可能的多糖回收率和总多糖产量高的多糖回收率和总多糖产量。 附图说明 0028 图 1 为肺炎链球菌型 4 的展示在用乙酸使 pH 值降低时，以每升溶解产物的克数 计可溶性蛋白质显著减少的SDS-PAGE凝胶。 39 kDa和48 kDa组分为细胞壁表面蛋白。 也展示多糖产量。 0029 图 2 为 pH 值向下调节到 pH 5 的肺炎链球菌型 6B 的结果图，其展示由 SDS-PAGE所测定的蛋白质降低和用折射率(RI)检测器由HPLC-SEC所测定的多糖(Ps) 产量。 0030 图3为pH值向下调节到pH 5的肺。
22、炎链球菌型1的结果图，其展示由SDS-PAGE 所测定的蛋白质降低和用 RI 检测器由 HPLC-SEC 所测定的多糖产量。 0031 图 4 为 pH 值向下调节到 pH 4.1 的肺炎链球菌型 5 的结果图，其展示由 SDS-PAGE 所测定的蛋白质降低和用 RI 检测器由 HPLC-SEC 所测定的多糖产量。 0032 图 5 为两种不同发酵操作的 pH 值向下调节到 pH 4.5 的肺炎链球菌型 6A 的结果 图，其展示由SDS-PAGE所测定的蛋白质降低和用RI检测器由HPLC-SEC所测定的多糖 产量。 0033 图 6 为 pH 值向下调节到 pH 4.8 的肺炎链球菌型 7F 。
23、的结果图，其展示由 SDS-PAGE 所测定的蛋白质降低和用 RI 检测器由 HPLC-SEC 所测定的多糖产量。 具体实施方式 0034 肺炎链球菌为通常成对(双球菌)出现，但以短链或单细胞形式出现的革兰氏阳 性柳叶形球菌。 其在血液琼脂板上容易生长为反光菌落，且除非无氧生长 ( 此时其展示 B 溶血现象 )，否则其显示 溶血现象。 其对可在细胞自身的酶自溶素存在下分解细胞 壁的胆汁盐敏感。 所述有机体为兼性厌氧菌且不易生长，因为其具有复杂营养需求。 0035 大部分肺炎球菌血清型细胞具有作为包围各细胞的多糖鞘的荚膜。 这一荚膜在 人类中为病毒性的决定子，因为其通过阻止抗体附着于细菌细胞而干。
24、扰吞噬作用。 当前 存在 90 种已鉴别的血清型，其中 23 种血清型引发约 90的侵袭性疾病。 虽然作为疫苗 的多糖鞘在具有已发育或未受损伤的免疫系统的个体内可给予合理程度的免疫性 ( 对肺 炎链球菌 )，但具有多糖的接合蛋白质使也处于受肺炎球菌感染的最大危险中的婴儿和年 长者产生免疫反应。 重要的是能够从溶解 ( 杀死 ) 的细菌中分离出这一荚膜多糖且移除 尽可能多的细胞碎片。 如本文所述，这一移除在一系列发酵过程变化中实现。 0036 3 个已大大改良下游加工的主要变化如下 ：(1) 可能时将发酵碱馈入由碳酸钠改 为氢氧化钠 ；(2)在脱氧胆酸盐保持间隔期间，在发酵罐中维持搅拌 ；和(3。
25、)在脱氧胆酸 盐溶解产物保持后，将 pH 值降低到小于 5.5。 0037 最初的发现为通过将pH值降低到小于5.5，在后续加工(纯化)之前，可从细胞 溶解产物中移除 50-90的不想要的可溶性蛋白质。 虽然其为极重要的方法提高，但在 说 明 书 CN 101155833 B4/8 页 7 发酵操作期间使用大量碳酸钠维持设定点的pH值导致在用乙酸将pH值调节到5.0时，引 起严重的发泡问题。也发现调节后难以维持稳定的pH值，因为溶液中存在的多种形式的 碳酸盐。 此导致着眼于在发酵肉汤中不会产生碳酸盐堆积的替代碱馈入。 因为在接种之 前已使用氢氧化钠调节培养基和菌种瓶的 pH 值，所以选择氢氧化。
26、钠。 高达 100L 发酵的 研究表明其为可行的替代物，以光密度 (OD) 计生长仅略微降低。 这一碱也解决发泡问 题。 除氢氧化钠外，也可使用其他碱，且在已确定诸如血清型 5 和 19A 的有机体需要某 种形式的碳酸盐来维持生长的情况下可使用碳酸氢钠作为补充物。 如果使用碳酸钠作为 ( 诸如 ) 血清型 19A 的主要碱馈入，那么溶解后 pH 值调节 ( 到小于 5.5 的 pH 值 ) 需要减 缓的多小时受控酸添加以避免发泡。 0038 最终，基于实验室观察，确定如果在不搅拌的情况下进行脱氧胆酸盐保持 ( 如 在先前方案中 )，那么胶状沉淀会沉降在发酵罐壁和 pH 值探针上。 当调节 pH。
27、 值时，此 产生不可靠的原位 pH 值读数。 搅拌步骤阻止这一沉淀形成且使 pH 探针的完整性得以维 持。 0039 因此，在本发明中，使选定肺炎链球菌血清型在包含(例如)经酶消化的大豆基 产物、氯化钠、磷酸二氢钾、氯化钙和选定氨基酸的无菌培养基中从开始菌种小瓶以递 增体积扩大。 在液体培养基中使用具有硫酸镁的右旋糖作为碳源来维持生长。 所述培养 基中也可补充有特定血清型或方法所需要的其他添加剂。 培养在诸如菌种瓶的第一个容 器中开始，在基于对流的培育箱中的生长一段时间后，使用所述第一个容器给诸如菌种 发酵罐的第二个容器接种，所述第二个容器转而又可用于给(必要时)至少一个诸如生产 发酵罐的逐渐。
28、增加的更大容器接种，直到达到生产规模。 在一实施例中，使选定肺炎链 球菌血清型从开始菌种小瓶到菌种瓶到 20L 发酵罐到 200L 发酵罐到 2000L 生产发酵罐以 递增体积扩大。就光密度、温度和pH值严密监测生长参数以确定何时将培养物转移到下 一发酵规模中以及何时终止分批操作。 0040 当细菌进入稳定期时，通过添加诸如阴离子型或阳离子型洗涤剂的洗涤剂迫使 生产发酵罐中的细胞溶解。 所述洗涤剂的代表性实例包括脱氧胆酸钠、 N- 月桂基肌氨 酸、鹅脱氧胆酸钠和皂角苷。 在 7与 13之间的温度下搅拌细胞溶解产物历时足以确 保完全细胞死亡，例如 8 小时与 24 小时之间的时间后，方法的第二阶。
29、段为用诸如 50乙 酸的酸溶液将细胞溶解产物的 pH 值降低到小于 pH 5.5。 实际 pH 值降低随血清型变化， 目的为能够低于稳固生产方法所需的一致基础上的最终纯化蛋白质规格。 在本发明的一 特定实施例中，将 pH 值降低到 4.5 与小于 5.5 之间。 0041 pH 值降低步骤引起原先可溶性蛋白质的“盐析” ( 沉淀 )。 此为当蛋白质达到 其等电点时，蛋白质众所周知的化学效应。 使这一步骤在本发明中独特的是其在高度复 杂的细胞溶解产物肉汤中用作纯化步骤。 肉汤定义为 “复合体”，因为其含有培养基组 分、DNA、蛋白质、多糖、RNA 和其他细胞碎片。 0042 除乙酸外，也展示所主。
30、张的方法也可用硫酸和磷酸起作用，且这些酸为一部分 的Hofmeister系列后应以不同功效起作用。 Hofmeister系列为多种阴离子和阳离子的组合 且其具有使蛋白质混合物沉淀析出的能力。 溶液中这些化合物 (Hofmeister 系列 ) 的最终 浓度决定多种蛋白质的最终溶解度。 0043 在不搅拌的情况下，在 15与 25之间的温度下保持一段足以使沉淀沉降且从 说 明 书 CN 101155833 B5/8 页 8 而有助于连续离心过程的诸如12小时与24小时之间的时间后，先前可溶的蛋白质的极大 部分(和可能一些其他先前可溶的污染物组分)以固体沉淀形式析出溶液，其中保留在溶 液中的多糖产。
31、物几乎未损失或降解。 0044 然后，经由连续离心机或通过标准瓶离心加工这一具有沉淀的溶液。 收集含有 多糖的上清液且在转移用于下游浓缩和纯化之前经由颗粒物和微米过滤器过滤。 0045 使用本发明的方法的结果描绘在以下各图中。 图 1 展示使用乙酸将 pH 值从 6.8 降低到 5.0，肺炎链球菌血清型 4 的细胞溶解产物肉汤中所观察到的蛋白质减少的代表性 SDS-PAGE 凝胶。 最左泳道为用作蛋白质重量参考的分子量标记。 样品泳道 1( “C”) 为 pH 值未经调节的对照。 数字展示两个主要蛋白质污染物带 (48 kDa 和 39 kDa) 以及整 个泳道中的总蛋白质的近似值(溶解肉汤中。
32、g/L)。 也展示提供用于HPLC-SEC分析的样 品等分试样中所含有的总多糖产量。 泳道 2-8 展示 pH 值经调节的样品的相同信息。 泳 道 9-11 为用于由基本线性回归分析确定蛋白质产量的 BSA 标准物。 Ps 分析不对 pH 6.8 的样品进行。 在这一特定血清型中，存在一些适度的多糖 (Ps) 损失，但速率比经由降低 pH 值导致的蛋白质损失的速率低得多。 0046 图 2为说明当细胞溶解产物的pH值降低到5.0时肺炎链球菌血清型6B的细胞溶 解产物中蛋白质的减少以及多糖产量稳定性的区块图。 这一血清型未见多糖的损失。 相 反，总蛋白质减少超过一半。 0047 图 3 为说明当。
33、细胞溶解产物的 pH 值降低到 5.0 时肺炎链球菌血清型 1 的细胞溶 解产物中蛋白质的减少以及多糖产量稳定性的区块图。 几乎观察不到多糖浓度的变化。 相反，总蛋白质减少超过 90。 0048 图 4 为说明当细胞溶解产物的 pH 值降低到 4.1 时肺炎链球菌血清型 5 的细胞溶 解产物中蛋白质的减少以及多糖产量稳定性的区块图。在极低pH值之前几乎观察不到多 糖浓度的变化，其归因于由酸添加量引起的稀释效应。 相反，在 pH 4.5 下，总蛋白质减 少超过 75。 0049 图5为说明当细胞溶解产物的pH值降低到4.5时肺炎链球菌血清型6A的细胞溶 解产物中蛋白质的减少以及多糖产量稳定性的两。
34、种不同发酵操作的区块图。 几乎观察不 到多糖浓度的变化。 这一图也展示当使用NaOH而不是Na2CO3时，多糖浓度得以维持而 蛋白质浓度降低。 0050 图 6 为说明当细胞溶解产物的 pH 值降低到 4.8 时肺炎链球菌血清型 7F 的细胞溶 解产物中蛋白质的减少以及多糖产量稳定性的区块图。 几乎观察不到多糖浓度的变化。 相反，在 pH 4.8 下，总蛋白质减少超过 80。 0051 下表 1 表示使用本发明的方法后，最终纯化多糖的一些蛋白质减少和多糖获得 量。 0052 表 1. 数种肺炎链球菌血清型的蛋白质浓度和多糖产量 0053 说 明 书 CN 101155833 B6/8 页 9 。
35、血清型蛋白质规格 原始方法本发明的方法 蛋白质浓 度 Ps 产量蛋白质浓 度 Ps 产量 12.011.711.2g 0.815 20g 57.510.26.0g 6.5 * 8 13g 7F5.00.219.2g0.253 g 6A2.0NANA0.321.6g 0054 * 发酵过程展示 DOC 溶解物质的 80的蛋白质减少，但其他蛋白质移除不如纯 化过程期间高效。 0055 上述发酵过程变化用于在纯化加工之前大大降低溶解产物肉汤的蛋白质含量。 在无需显著修改用于多糖回收的当前纯化过程的情况下，其使纯化产物符合蛋白质规 格。 这些变化的意外效益为即使如由 OD 所测定生长略有下降，但总纯化。
36、多糖产量提高 25-100。 其为可大大增加肺炎球菌多糖产量的发酵 / 回收过程的稳固改良。 0056 以上揭露内容大体上描述本发明。 通过参考以下特定实例可获得更完全的理 解。 仅出于说明的目的描述这些实例且不希望这些实例限制本发明的范畴。 实例 0057 实例 1 0058 肺炎链球菌血清型 1、6A 和 7F 的细胞溶解产物中的蛋白质减少 0059 制备母液和工作细胞库 0060 肺炎链球菌血清型 1 是获自美国典型微生物菌种保藏中心 (American Type CultureCollection)， ATCC，菌株 6301。 肺炎链球菌血清型 6A 和 7F 是获自纽约州立大 学 。
37、(the StateUniversity of New York) 的 Gerald Shiftman 博士。 产生数代菌种储备物以使菌 株扩大且移除动物来源的组分 (F1 代、F2 代和 F3 代 )。 再生产两代菌种储备物。 附加 第一代由F3小瓶制备，且随后的代由附加第一代的小瓶制备。 将菌种小瓶以作为冷冻保 护剂的合成甘油冷冻储藏 ( -70 )。 除冷冻小瓶外，也为 F4 代制备冷冻干燥小瓶。 就细胞库制备来说，使所有培养物在大豆基培养基中生长。 在冷冻之前，通过离心浓缩 细胞，移除用过的培养基，且将细胞小球再悬浮于含有诸如合成甘油的冷冻保护剂的新 鲜培养基中。 0061 发酵和回收。
38、 0062 使用来自工作细胞库的培养物给含有大豆基培养基 ( 表 2) 的菌种瓶接种。 在不 搅拌的情况下，将瓶在 36 2下培育直到生长要求得到满足。 使用菌种瓶给含有大 豆基培养基的菌种发酵罐接种。 用 3N NaOH 将 pH 值维持在约 7。 达到目标光密度后， 使用菌种发酵罐给含有大豆基培养基生产发酵罐接种。 用 3N NaOH 维持 pH 值。 终止生 长后或当达到发酵罐的工作体积时，终止发酵。 将适当量的无菌 12脱氧胆酸钠添加到 培养物中以获得于肉汤中的 0.12 -0.13浓度，溶解细菌细胞且释放细胞结合的多糖。 说 明 书 CN 101155833 B7/8 页 10 溶解。
39、后，在 7与 13之间的温度下将发酵罐内含物搅拌 8 小时与 24 小时之间的时间间 隔以确保出现完全细胞溶解和多糖释放。 在这一保持时间期间的搅拌阻止溶解产物沉积 物沉降到发酵罐壁和pH探针上，从而得以维持pH探针的完整性。 接着，用50乙酸将 溶解培养物肉汤的 pH 值调节到约 pH 5.0。 在不搅拌的情况下，在 15与 25之间的温 度下保持12小时与24小时之间的时间间隔的时间后，极大部分先前可溶的蛋白质以固体 沉淀形式析出溶液，其中保留在溶液中的多糖几乎未损失或分解。 然后，将具有沉淀的 溶液通过连续流动离心，接着深度过滤和 0.45m 微过滤澄清。 0063 在较小规模情况下，上。
40、述方法也产生血清型 4 和 6B( 图 1 和 2) 的总蛋白质的明 显减少，此表明就这两种血清型来说，这一方法在较大规模的情况下会起作用。(肺炎链 球菌血清型 4 和 6B 也是获自纽约州立大学的 Gerald Shiffman 博士。 ) 0064 表 2. 大豆基培养基的组成 0065 组分基线浓度低浓度高浓度 HySoy28g/L18g/L38g/L NaCl3.5g/L3.5g/L3.5g/L KH2PO40.7g/L0.7g/L0.7g/L CaCl2 H2O0.018g/L0.018g/L0.018g/L L- 半胱氨酸，HCl 0.21g/L0.21g/L0.21g/L 006。
41、6 实例 2 0067 肺炎链球菌血清型 5 的细胞溶解产物中的蛋白质减少 0068 肺炎链球菌血清型 5 是获自纽约州立大学 (the State University of New York， Brooklyn，New York)的Gerald Schiffman博士。关于细胞库系统的制备，请参见实例1。 0069 发酵和回收 0070 使用来自工作细胞库的培养物给含有上述大豆基培养基 ( 表 2) 的菌种瓶接 种，所述培养基补充有 10mM 浓度的无菌 NaHCO3溶液。 在不搅拌的情况下，将瓶在 36 2下培育直到满足生长要求。 使用菌种瓶给含有大豆基培养基的菌种发酵罐接 种，其中培养。
42、基中 NaHCO3浓度为 10mM。 用 3N NaOH 将 pH 值维持在约 7.0。 达到目 标光密度后，使用菌种发酵罐给含有大豆基培养基的生产发酵罐接种，其中培养基中的 NaHCO3浓度为 10mM。 用 3N NaOH 维持 pH 值。 生长终止后或当达到发酵罐的工作 体积时，终止发酵。 将适当量的无菌 12脱氧胆酸钠添加到培养物中以获得于肉汤中的 0.12 -0.13浓度，溶解细菌细胞且释放细胞结合的多糖。 溶解后，在 7与 13之间 的温度下将发酵罐内含物搅拌在 8 小时与 24 小时之间的一段时间以确保出现完全细胞溶 解和多糖释放。在这一保持时间期间的搅拌阻止溶解产物沉积物沉降到。
43、发酵罐壁和pH探 针上，从而得以维持pH探针的完整性。 接着，用50乙酸将溶解培养物肉汤的pH值调 说 明 书 CN 101155833 B8/8 页 11 节到约 pH 4.8。 在不搅拌的情况下，在 15与 25之间的温度下保持在 12 小时与 24 小 时之间的一段时间的时间后，极大部分先前可溶的蛋白质以固体沉淀形式析出溶液，其 中多糖几乎未损失或分解而保留在溶液中。 然后，将具有沉淀的溶液通过连续流动离心 并接着深度过滤和 0.45m 微过滤而澄清。 0071 应了解上述讨论和实例仅仅给出某些实施例的详细描述。 因此，对所属领域的 技术人员来说显而易见的是，在不悖离本发明的精神和范畴的情况下，可产生多种修改 和等效物。 说 明 书 CN 101155833 B1/6 页 12 说 明 书 附 图 CN 101155833 B2/6 页 13 说 明 书 附 图 CN 101155833 B3/6 页 14 说 明 书 附 图 CN 101155833 B4/6 页 15 说 明 书 附 图 CN 101155833 B5/6 页 16 说 明 书 附 图 CN 101155833 B6/6 页 17 说 明 书 附 图 。