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1、(10)授权公告号 CN 102181440 B (45)授权公告日 2013.06.19 CN 102181440 B *CN102181440B* (21)申请号 201110091643.8 (22)申请日 2011.04.13 C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) (73)专利权人 武汉大学 地址 430072 湖北省武汉市武昌区珞珈山武 汉大学 (72)发明人 何光存 邱永福 杜波 陈荣智 祝莉莉 (74)专利代理机构 武汉科皓知识产权代理事务 所 ( 特殊普通合伙 ) 42222 代理人 张火春 CN 101659988 A,2010.03.。
2、03, Kshirod K 等 .current status of brown planthopper(BPH) resistance and genetics. rice .2010, 第 3 卷 161-171. Yu qiang liu 等 .The distribution and identification of brown planthopper resistance genes in rice. hereditas .2009, 第 146 卷 67-73. (54) 发明名称 水稻抗褐飞虱主效基因 bph7 的分子标记及 其应用 (57) 摘要 本发明提供了水稻抗褐飞虱主效。
3、基因bph7 的分子标记及其应用。通过将水稻抗虫品种 T12 （） 与感虫品种 9311（） 杂交获得的 F2各单株 的基因型， 同时结合 F2:3各家系的抗褐飞虱的抗 性级别进行遗传连锁分析， 获得抗虫品种 T12 抗 性基因bph7并定位于分子标记 RM3448 和 RM313 之间。与该基因连锁的分子标记还有 RM28295、 RM519、 RM28305和RM28374。 本发明中的分子标记 可以有效检测抗虫品种 T12 及其衍生品种 （系） 中 是否含有该主效基因位点， 大大提高抗褐飞虱水 稻的选择效率， 获得含有bph7基因的抗褐飞虱水 稻品种。 (51)Int.Cl. (56)对。
4、比文件 审查员 高雅 权利要求书 1 页 说明书 7 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书7页 附图1页 (10)授权公告号 CN 102181440 B CN 102181440 B *CN102181440B* 1/1 页 2 1.水稻抗褐飞虱主效基因bph7的分子标记， 其由下述之一的引物对经PCR扩增获得 ： 1） 标记引物 RM28295， 左端引物序列， CCAGCTTAGCTATCAACGGATCG 右端引物序列， ACCTCCTCCGTTTCAATTCTCC ； 2） 标记引物 RM519， 左端引物序列， AATTT。
5、CCGCGAAATCAGCATCC 右端引物序列， TCATCTGGACAGTCGAGGTACGC ； 3） 标记引物 RM28305， 左端引物序列， GTCATCTTCGCAAATGGTGATGG 右端引物序列， GGTCGTCGTGGTGTTATTCTTGG ； 4） 标记引物 RM3448， 左端引物序列， TATTTACCACTCCCTGCCACTGC 右端引物序列， AGGGAAGGGTACAAGGGTGTCG ； 5） 标记引物 RM313， 左端引物序列， TGCTACAAGTGTTCTTCAGGAC 右端引物序列， GCTCACCTTTTGTGTTCCAC ； 6） 标记引物。
6、 RM28374， 左端引物序列， GTCATCATGCGAAAGCAACAAAGG 右端引物序列， CGACATCGCCTTCAAGGTTGG ； 其中， 所述 bph7 来自水稻 T12， 扩增模板为水稻 T12 基因组 ； 所述标记引物 1） 6） 的扩 增长度分别为 100bp、 125bp、 142bp、 163bp、 111bp 以及 169bp。 2. 权利要求 1 所述分子标记在选育抗褐飞虱水稻中的应用。 3. 一种筛选抗褐飞虱水稻的方法， 其用权利要求 1 中所述的引物对之一扩增待检水稻 基因组 DNA， 如果用引物 RM28295 能够扩增出 100bp 的扩增片段， 或者。
7、用引物 RM519 能够扩 增出 125bp 的扩增片段， 或者用引物 RM28305 能够扩增出 142bp 的扩增片段， 或者用引物 RM3448能够扩增出163bp的扩增片段， 或者用引物RM313能够扩增出111bp的扩增片段， 或 者用引物 RM28374 能够扩增出 169bp 的扩增片段， 则标志着该待检水稻存在抗褐飞虱主效 基因 bph7。 权 利 要 求 书 CN 102181440 B 2 1/7 页 3 水稻抗褐飞虱主效基因bph7的分子标记及其应用 技术领域 0001 本发明属于分子遗传学领域， 涉及水稻抗褐飞虱主效基因bph7的分子标记， 本发 明还涉及该分子标记在选。
8、育水稻抗褐飞虱品种中的应用。 背景技术 0002 水稻是世界上最主要的粮食作物之一。 同时， 它也遭到不同病菌和害虫的侵袭， 使 水稻生产受到严重的威胁。 其中， 稻褐飞虱就是水稻种植过程中为害最严重虫害之一， 其成 虫和若虫以口针刺吸水稻韧皮部中的汁液， 从而引起植株的叶片变黄， 严重时整个植株枯 死， 最后可能导致减产甚至绝收。据中国农业年鉴记载， 在 1966、 1969、 1973、 1977、 1983 和 2003 年这 6 年中全国性褐飞虱大发生 ； 而在 1987、 1991、 2005、 2006 和 2007 年这 5 年中全 国性褐飞虱特大发生。褐飞虱发生面积达到水稻种植。
9、总面积的 50以上， 给我国水稻生产 造成了严重的威胁。由于褐飞虱的为害多发生在水稻的灌浆期， 若此时大量使用杀虫剂进 行防治， 会对环境和稻谷造成较严重的污染。 相反， 若利用抗褐飞虱基因来培育抗虫水稻品 种， 这将是褐飞虱综合防治中最为经济有效的方法。 0003 迄今为止， 在不同的籼稻品种和野生稻材料中已经鉴定并报道了 23 个抗褐 飞虱主效基因 （Rahman et al. 2009 High-resolution mapping of two rice brown planthopper resistance genes, Bph20(t) and Bph21(t), origina。
10、ting from Oryza minuta. Theor Appl Genet 119(7): 1237-1246.） 。除了bph5和bph8外， 其余抗褐飞虱 主效基因均已经利用分子标记被定位到水稻不同的染色体上。早期鉴定的抗褐飞虱基因 中， 如Bph1、bph2和Bph3等， 都已经利用传统的杂交方式转育到一些性状优良的水稻材料 中并培育成抗虫品种， 同时在亚洲热带水稻种植区大面积推广种植。 然而， 随着抗褐飞虱水 稻品种的推广种植， 褐飞虱出现新的能致害抗性品种的生物型， 从而使抗褐飞虱品种逐渐 丧失抗性。例如， 携带抗性基因Bph1的水稻抗虫品种经过 2 3 年 （约 24 36 。
11、代） 推广种 植后， 它们就失去对褐飞虱群体的抗性。而携带Bph1和另外几个微效抗性位点的水稻品种 IR64 对褐飞虱群体表现出更持久的抗性性状。可见， 在水稻生产中迫切需要更多的新的抗 褐飞虱基因， 以利于培育更多携带不同抗性基因的水稻品种。 0004 由于水稻材料抗虫性鉴定的复杂性， 利用常规育种手段往往难以有效地导入和聚 合不同的抗虫基因。本发明是在找到与抗虫基因紧密连锁或共分离的分子标记的基础上， 借助分子标记辅助选择 （Marker-assisted selection， MAS） 技术可以有目的地进行抗虫基 因的导入和聚合， 选育持久抗性品种， 延缓抗虫品种的退化年限和防止褐飞虱新。
12、生物型的 发生。 发明内容 0005 本发明的目的是提供一种水稻抗褐飞虱主效基因bph7的分子标记， 通过检测这 些与抗褐飞虱主效基因紧密连锁的分子标记， 能够预测水稻植株对褐飞虱的抗性， 加快抗 褐飞虱水稻品种的选择进度。 说 明 书 CN 102181440 B 3 2/7 页 4 0006 本发明水稻抗褐飞虱主效基因bph7的分子标记， 由下述之一的引物对经PCR扩增 获得 ： 0007 1） 标记引物 RM28295， 0008 左端引物序列， CCAGCTTAGCTATCAACGGATCG 0009 右端引物序列， ACCTCCTCCGTTTCAATTCTCC ； 0010 2） 标。
13、记引物 RM519， 0011 左端引物序列， AATTTCCGCGAAATCAGCATCC 0012 右端引物序列， TCATCTGGACAGTCGAGGTACGC ； 0013 3） 标记引物 RM28305， 0014 左端引物序列， GTCATCTTCGCAAATGGTGATGG 0015 右端引物序列， GGTCGTCGTGGTGTTATTCTTGG ； 0016 4） 标记引物 RM3448， 0017 左端引物序列， TATTTACCACTCCCTGCCACTGC 0018 右端引物序列， AGGGAAGGGTACAAGGGTGTCG ； 0019 5） 标记引物 RM313， 。
14、0020 左端引物序列， TGCTACAAGTGTTCTTCAGGAC 0021 右端引物序列， GCTCACCTTTTGTGTTCCAC ； 0022 6） 标记引物 RM28374， 0023 左端引物序列， GTCATCATGCGAAAGCAACAAAGG 0024 右端引物序列， CGACATCGCCTTCAAGGTTGG。 0025 本发明还提供水稻抗褐飞虱主效基因bph7的分子标记方法， 其是用上述之一的 引物对扩增待检水稻基因组 DNA， 如果用引物 RM28295 能够扩展出 100bp 的扩增片段， 或者 用引物 RM519 能够扩增出 125bp 的扩增片段， 或者用引物 。
15、RM28305 能够扩增出 142bp 的扩 增片段， 或者用引物 RM3448 能够扩增出 163bp 的扩增片段， 或者用引物 RM313 能够扩增出 111bp 的扩增片段， 或者用引物 RM28374 能够扩增出 169bp 的扩增片段， 均标志着水稻 T12 抗褐飞虱主效基因位点bph7的存在。该基因位点位于水稻基因组第 4 染色体长臂的分子 标记 RM28295 和 RM313 之间的区域内。本发明用 RM28295 和 RM313 筛选了 2430 个 BC2F2和 BC3F2的单株， 得到了在这两个分子标记间有重组的单株。分析重组单株的基因型和抗虫 级别后发现， 分子标记 RM。
16、3448 和 RM313 与抗褐飞虱主效基因bph7最靠近 ； 同时， 分子标记 RM28295、 RM519、 RM28305 和 RM28374 也均能用于筛选含bph7基因的抗褐飞虱水稻品种。 0026 筛选上述分子标记引物的过程如下 ： 0027 （1） 最早由 Kabir & Khush（1988） 利用抗虫性筛选发现水稻品种 T12 对褐飞虱 Bangladesh 群体 （生物型 4） 具有抗性， 通过遗传分析表明该品种携带一对隐性抗褐飞虱基 因并将其命名为bph7（Kabir & Khush. 1988 Genetic analysis of resistance to brow。
17、n planthopper in rice, Oryza sativa L. Plant Breeding 100, 5458） 。 但到目前为止， bph7仍未定位在水稻的染色体上， 这给该抗虫基因在水稻分子辅助育种中的应用带来很大 的困难。同时， 水稻品种 T12 中抗性基因bph7的鉴定已经过去二十多年， 在此过程中世界 不同水稻种植地区的褐飞虱群体遗传结构可能发生了变化。因此， 评价水稻品种 T12 对我 国主要褐飞虱群体的抗性级别并且利用 SSR 分子标记定位该抗虫基因是非常必要的， 这将 说 明 书 CN 102181440 B 4 3/7 页 5 为该基因在我国的水稻育种应用中提。
18、供技术支持。因此， 本发明筛选并开发了基于 PCR 技 术的 SSR 分子标记。根据 gramene 网站 （http:/www.gramene.org） 公布的 SSR 分子标记， 按照较均匀的遗传距离选择一定数目分子标记进行合成。 0028 （2） 以高感褐飞虱的籼稻品种 9311 为母本， 抗褐飞虱的品种 T12 为父本， 配制杂 种， 构建9311/T12 F2分离群体用于分子标记分析 ； 每个F2单株通过自交获得相应的F2:3家 系并用于苗期抗虫鉴定。 0029 （3）用 CTAB 法 （Murray & Thompson， 1980 Rapid isolation of high-。
19、molecular-weight plant DNA. Nucleic Acids Res 8: 4321-4325） 提取亲本 T12、 9311 及 F2群体各单株的基因组 DNA。用方法 （1） 获得的备选标记对两亲本进行多态性筛 选， PCR 反应在 PTC-100 扩增仪上进行， 扩增产物在 6% 的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分析， 记录并选择在亲本间具有多态性的 SSR 标记用于后续分析。 0030 （4） 采用苗期接虫进行抗虫性鉴定， 褐飞虱为生物型 1 和生物型 2 混合群体。两叶 一心期按 8 头 / 苗的比例接种 2 3 龄褐飞虱若虫， 当对照感虫品种 TN1 死亡株数达到 。
20、90% 以上时， 参照Huang等介绍的方法对每个单株进行0、 1、 3、 5、 7或9级的抗性评价 （Huang et al. 2001 Identification and mapping of two brown planthopper resistance genes in rice. Theor Appl Genet 102,929934） ， 对亲本材料和群体中的每个家系通过加权平 均计算该家系的抗性级别。 0031 （5） 根据 F2单株的抗虫级别， 分别选择 10 个极端抗虫单株和 10 个极端感虫单株 的 DNA 混合构建抗、 感池。同时， 利用在亲本间有多态性的引物分别筛选。
21、抗、 感 DNA 池并获 得有多态性的分子标记， 该类多态性标记很可能与抗性性状连锁。 然后， 根据连锁标记所在 的染色体， 选择该染色体上在亲本间有多态性的引物筛选F2分离群体的各个单株， PCR程序 同上， 获得群体基因型资料。根据连锁交换规律， 利用软件 JoinMap 3.0 将群体基因型资料 构建水稻的部分遗传图谱并获得各分子标记的遗传距离。最后， 结合 F2群体各个单株的分 子标记基因型资料和相应的褐飞虱抗性鉴定的抗虫级别， 利用 MapQTL 5.0 软件复合区间 作图法， 对目标染色体进行 QTL 位点扫描。 0032 （6） 根据初次 QTL 鉴定的结果， 本发明用 RM28。
22、295 和 RM313 筛选了 2430 个 BC2F2 和 BC3F2群体的单株， DNA 提取、 SSR 的 PCR 扩增及电泳分析同 （2） ， 获得了 37 个在分子标记 RM28295 和 RM313 之间有重组的单株。结合 37 个重组单株的基因型和相应家系的抗虫级 别， 得到与抗褐飞虱主效基因bph7共分离的分子标记。 0033 本发明的有益效果 ： 0034 1. 通过本发明首次用 SSR 标记定位了水稻品种 T12 中的抗褐飞虱主效基因 bph7； 0035 2. 通过本发明分子标记定位的主效基因位点位置明确， 鉴定方便。 通过检测与该 基因位点连锁的分子标记， 即可以预测水。
23、稻植株的褐飞虱抗性， 用于水稻品种或品系的基 因型检测， 以判断该品种或品系是否具有褐飞虱抗性， 进而快速筛选抗虫品种或品系用于 水稻育种。其检测方便快速， 不受环境影响 ； 0036 3. 辅助育种选择目标明确， 节约成本。在传统育种方法中， 首先要收集具有抗虫 基因的亲本与栽培品种进行一系列杂交， 而且要对水稻品种进行抗褐飞虱性状的鉴定并进 行选择， 操作非常复杂， 同时还受环境的影响。 此外， 在进行抗虫鉴定之前， 首先要获得虫源 说 明 书 CN 102181440 B 5 4/7 页 6 并饲养繁殖褐飞虱群体， 同时还要求接种虫源与水稻秧苗苗龄较同步， 这同样给育种工作 带来麻烦， 。
24、若不能有效地处理好虫源、 秧苗以及环境之间的关系， 抗褐飞虱的表型鉴定结果 可靠性就很低。因此， 抗虫育种不仅费时， 而且难度大， 成本高。然而， 通过检测抗褐飞虱主 效基因位点， 可以在苗期就鉴定出高抗褐飞虱的单株， 淘汰其它植株， 不仅节约生产成本而 且大大提高抗褐飞虱水稻材料的选择效率， 极大地缩短水稻品种的育种周期。 附图说明 0037 图 1水稻品种 T12 抗褐飞虱主效基因bph7定位在第 12 染色体。A，bph7初步定 位。垂直线表示水稻第 12 号染色体， 水平短线表示染色体上的分子标记， 括号内的数值表 示标记间的遗传距离 （cM） ， n 为群体的单株数目 ； B， RM。
25、28295 和 RM313 筛选 BC2F2和 BC3F2重 组单株的结果， 结合表现型和基因型结果，bph7定位于 RM3448 和 RM313 之间。参照 9311 的 基因组序列， 这两个标记间的物理距离约为 485kb。n 表示筛选的 BC2F2和 BC3F2单株总数。 具体实施方式 0038 以下实施例进一步说明本发明的内容， 但不应理解为对本发明的限制。在不背离 本发明精神和实质的情况下， 对本发明方法、 步骤或条件所作的修改或替换， 均属于本发明 的范围。 0039 实施例 1 0040 （一） 9311/T12 F2群体构建及表型鉴定 0041 （1）在 1988 年， Kab。
26、ir & Khush 利用抗虫性筛选发现水稻品种 T12 对褐飞虱 Bangladesh 群体 （生物型 4） 具有抗性， 通过遗传分析表明该品种携带一对隐性抗褐飞虱基 因并将其命名为bph7（Kabir & Khush, 1988 Genetic analysis of resistance to brown planthopper in rice, Oryza sativa L. Plant Breeding 100, 5458） 。 水稻品种来源 于中国农业科学院种质资源库， T12 来源于国际水稻研究所水稻种质资源库。抗虫鉴定实 验表明， T12 对我国的褐飞虱群体具有中等抗性。为了寻。
27、找简单有效且与bph7紧密连锁的 分子标记， 本发明以感虫品种 9311 为母本， 以抗褐飞虱品种 T12 为父本杂交， 得到的 F1再 自交， 从而获得 F2分离群体 ； 然后， 每个 F2单株通过自交获得相应的 F2:3家系。 0042 （2） 采用苗期接种对亲本和 F2:3家系进行抗虫性鉴定。为确保亲本和 F2:3群体中 的每个家系生长一致， 所有供试材料在播种前分别浸种催芽。每个家系 （品种） 各 60 粒种 子播种于一个长 58cm、 宽 38cm 和高 9cm， 且盛有 7cm 厚营养土的面包盒中。每盒每个材料 播种 3 个重复， 其中随机播种亲本和 TN1( 感性对照 ) 各 3。
28、 个重复。播种 7 天后间苗， 淘汰 病弱苗。待苗长至两叶一心期时， 按 8 头 / 苗的比例接种 2 3 龄褐飞虱若虫， 最后罩上透 光性良好的尼龙纱网。当感虫品种 TN1 全部死亡时， 参照 Huang 等 （Huang Z et al， 2001 Identification and mapping of two brown planthopper resistance genes in rice. Theor Appl Genet 102,929934） 介绍的方法对每个单株进行0、 1、 3、 5、 7或9级的抗性评 价 （表 1） ， 对亲本材料和群体的每个家系通过加权平均计算该家。
29、系的抗性级别， 并根据抗性 级别推测此单株基因型。 0043 表 1 ： 水稻抗褐飞虱性能鉴定的分级标准 0044 说 明 书 CN 102181440 B 6 5/7 页 7 抗性级别 受害程度 ( 当 90以上台中本地 1 号死亡时考察 )抗性水平 0植株生长健康， 无叶片受害抗 （R） 1一片叶黄抗 （R） 3一至两片叶黄， 或一片叶枯萎中抗 （MR） 5两到三片叶黄， 或二片叶枯萎中抗 （MR） 7三到四片叶枯萎， 但植株尚未死亡感 （S） 9整株死亡感 （S） 0045 （二） 9311/T12 F2群体的分子标记分析 0046 （1）用 CTAB 法 （Murray & Thomp。
30、son， 1980 Rapid isolation of high-molecular-weight plant DNA. Nucleic Acids Res 8: 43214325） 提取亲本及 F2 群体各单株的基因组 DNA。 0047 （2） 根据 gramene 网站 （http:/www.gramene.org/） 公布的 SSR 分子标记， 按照较 均匀的遗传距离选择一定数目分子标记进行合成。 0048 （3） SSR 标记的分析参照 Temnykh 的方法 （Temnykh et al， 2000 Mapping and genome organization of micro。
31、satellite sequences in rice. Theor Appl Genet 100 ： 697712） 。10l 反应体系包括 ： 10mM Tris-HCl pH8.3， 50mM KCl， 1.5mM MgCl2， 50M dNTPs， 0.2M 引物， 0.5U Taq polymerase 和 20ng DNA 模板。扩增反应在 PTC-100 PCR 仪 上进行 ： 94 2min ； 94 15sec， 55 30sec， 72 1.5min， 35 个循环 ； 72 5min。扩增 产物用 6% 的聚丙烯酰氨凝胶进行分离， 通过银染显色 （Zhu et al, 2。
32、004 Identification and characterization of a new blast resistance gene located on rice chromosome 1 through linkage and differential analyses. Phytipathology 94:515-519） 。扩增 的 DNA 条带利用装有荧光灯的灯箱进行观察。记录结果， 亲本间有多态的引物在 F2群体中 进行分析， 获取群体基因型资料。 0049 （4） 根据 F2单株的抗虫级别， 分别选择 10 个极端抗虫单株和 10 个极端感虫单株 的 DNA 混合构建抗、。
33、 感池。同时， 利用在亲本间有多态性的引物分别筛选抗、 感 DNA 池并获 得有多态性的分子标记， 该类多态性标记可能与抗性性状连锁。 然后， 根据连锁标记所在的 染色体， 选择该染色体上在亲本间有多态性的引物筛选F2分离群体的各个单株， PCR程序同 上， 获得群体中单株的基因型资料。根据连锁交换规律， 利用软件 JoinMap 3.0 将群体基因 型资料构建水稻的部分遗传图谱并获得各分子标记的遗传距离。最后， 结合 F2群体各个单 株的分子标记基因型资料和相应的褐飞虱抗性鉴定的抗虫级别， 利用 MapQTL 5.0 软件复 合区间作图法， 对目标染色体进行 QTL 位点扫描。 0050 （。
34、三） 利用分子标记筛选 9311/T12 BC2F2和 BC3F2群体定位bph7基因 0051 根据 QTL 的定位结果， 用两侧的 SSR 标记 RM28295 和 RM313 筛选了 BC2F2和 BC3F2 单株， 获得两个标记间发生重组的单株。 结合检测各单株的基因型和表型， 考察标记与抗性 表型共分离的情况。 0052 （四） 结果与分析 0053 苗期抗虫鉴定结果表明， 水稻品种 T12 对褐飞虱表现出中等抗性， 9311 表现出高 感性状 ； 它们的抗虫级别分别为 4.9 和 8.7。140 个 F2:3家系对褐飞虱的抗虫级别频率分布 呈连续分布， 最小为 2.4， 最大为 8。
35、.8。根据褐飞虱的抗虫级别， 我们可以将 F2:3家系分为抗 虫、 抗感分离和感虫 3 种表型， 而相应的 F2单株的基因型则分别记为 RR （纯合抗虫） 、 Rr （杂 合抗虫） 和 rr（纯合感虫） 3 种。若以分别以 0 7.0 和 7.1 9.0 来划分抗感植株， F2群 说 明 书 CN 102181440 B 7 6/7 页 8 体对褐飞虱的抗感分离符合 3:1 的比例 （90:40， 2=2.31 20.05=3.84） （表 2） 。 0054 根据 gramene 网站 （http:/www.gramene.org/） 公布的分子标记， 按照较均匀的 遗传距离选择并合成一定数。
36、目的 SSR 分子标记以备选。 0055 用亲本间有多态性的 SSR 标记分析 F2单株的基因型， 同时结合各单株的抗性值进 行 QTL 扫描。结果表明第 4 染色体长臂 RM28295 和 RM313 间存在一个 QTL 位点， LOD 值为 13.4， 贡献率为38.3%， 该QTL所在的分子标记RM28295和RM313相距1.1cM （图1） 。 RM28295 和 RM313 的选择正确率可以达到 98 99%。 0056 表 2 9311/T12 F2分离群体 130 个单株对褐飞虱抗感分离比 0057 F2基因型 a F2个体数 b 相应的 F2:3家系表现型 c RR 和 Rr。
37、90RS 7 rr407 RS 0058 a RR， 纯合抗虫 ； Rr 杂合抗虫 ； rr， 纯合感虫 ；b 3RR(Rr) : 1rr 适合性检测值 2=2.31 20.05=3.84 ； c 抗虫级别 ： RS， Resistance Score 0059 表 3 分子标记筛选的 BC2F2和 BC3F2重组单株的基因型及表现型 0060 0061 a 9311 和 T12 是两个亲本材料 ； 表中所列单株是部分重组单株， 通过分析重组单 株基因型和抗虫级别， 将bph7基因定位于 RM3448 和 RM313 之间。表中三种基因型分别为 ： A， 9311 纯合的基因型 ； B， T1。
38、2 纯合的基因型 ； H， 9311 和 T12 杂合的基因型。 0062 由于 RM28295 和 RM313 之间的物理距离仍较大， 在测序的籼稻品种 9311 中相距 说 明 书 CN 102181440 B 8 7/7 页 9 约 0.7Mb， 为了寻找与bph7更紧密连锁的标记， 本发明用 RM28295 和 RM313 筛选了 2430 个 BC2F2和 BC3F2单株。结果显示， 共有 22 个单株在标记 RM28295 和 RM313 之间存在重组 （表 3） 。于是， 用这两个标记之间的其它的 SSR 标记检测重组单株的基因型， 并结合重组单株的 抗虫鉴定结果， 最后将bph。
39、7定位于 RM3448 和 RM313 之间。在测序的 9311 品种中， RM3448 和RM313之间的物理距离仅有485kb， 因此， 利用上述分子标记来鉴定bph7抗性基因的存在 具有很高的效率， 这样也大大提高水稻抗褐飞虱品种的育种进度。 0063 实施例 2 分子标记的验证 0064 1、 材料和方法 0065 1.1 材料 0066 阴性品种 ： 10 份， 感虫品种 9311、 台中本地 1 号 （TN1） 、 9311 X T12 育种组合中的 不抗虫材料 8 份。 0067 阳性品种 ： 抗虫品种 T12 和 9311 X T12 育种组合中的抗虫材料 9 份。 0068 。
40、分子标记引物 ： RM28295、 RM519、 RM28305、 RM3448、 RM313、 RM28374。 0069 1.2 方法 0070 CTAB 抽提法提取水稻样品基因组 DNA（方法同实施例 1） 。分别用引物 RM28295、 RM519、 RM28305、 RM3448、 RM313 和 RM28374 扩增样品 DNA。反应体系中包括 0.10M 的引物、 250M dNTP、 1PCR反应缓冲液(50mM KCl、 10mM Tris-HCl pH8.3、 1.5mM MgCl2)、 100ng的 DNA 模板、 1UTaq酶。反应程序为 ： 94预变性 5min， 循。
41、环 (94 1min、 51-61 1min、 72 1min)41次， 最后72延伸10min。 根据引物的特性， 对退火温度作相应的修改 （退火温度分 别为 ： 58（RM28295） 、 55（RM519） 、 57（RM28305） 、 55（RM3448） 、 55（RM313）和 52（RM28374） 。PCR 扩增产物在 6的聚丙烯胺凝胶电泳分离。电泳后用硝酸银银染法 染色后读图分析。 0071 2、 结果 ： 0072 用上述方法， 分别对水稻品种 T12 等二十份不同样本进行扩增。结果表明， 在阳性 样本中均能分别扩增出相应的 100bp 片段、 125bp 片段、 142bp 片段、 163bp 片段、 111bp 片段 和 169bp 片段， 而在阴性样本中均不能扩增出这些片段。 0073 由此说明， 本发明提供的分子标记方法能够准确筛选出含有抗褐飞虱的主效基 因， 从而大大提高育种效率。 说 明 书 CN 102181440 B 9 1/1 页 10 图 1 说 明 书 附 图 CN 102181440 B 10 。