一种超支化一锅法滚环扩增检测单核苷酸多态性的方法.pdf

摘要
申请专利号：	CN201810792602.3	申请日：	20180718
公开号：	CN108707649A	公开日：	20181026
当前法律状态：		有效性：	审查中
法律详情：
IPC分类号：	C12Q1/6858	主分类号：	C12Q1/6858
申请人：	桂林理工大学
发明人：	朱文远,周琳莹,郝杰,梁晓琳,潘宏程,郭自宽
地址：	541004 广西壮族自治区桂林市七星区建干路12号
优先权：	CN201810792602A
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内容摘要

本发明公开了一种超支化一锅法滚环扩增检测单核苷酸多态性的方法。结合超支化一锅法滚环扩增反应和无标记荧光检测，建立了一种灵敏度高和特异性好的单核苷酸多态性检测方法。方法利用了特异性的连接反应和强有力的目标DNA引导的支化滚环扩增反应，在一锅法的基础上引入第二引物，其能通过一锅法超支化滚环扩增反应进行有效的扩增并产生了不同长度的DNA产物，随后加入高灵敏的SYBR Green I染料进行荧光测量，提高了一锅法滚环扩增的灵敏度，方法可用于单核苷酸多态性的快速定量检测。

权利要求书

1.一种超支化一锅法滚环扩增检测单核苷酸多态性的方法，其特征在于具体步骤为：（1）将1µL浓度为1μmol/L的锁式探针、1µL浓度为10mmol/L的四种脱氧核糖核苷三磷酸的混合物即dNTPs，1μL浓度为4μmol/L的第二引物即2ndprimer和7µL的焦碳酸二乙酯处理的蒸馏水即DEPC水混合组成10µL的A预混液，再将2µL10×TaqDNA连接酶缓冲液、2µL10×phi29DNA聚合酶缓冲液、1µL浓度为10nmol/L的待测靶序列、0.5µL40U/µL的TaqDNA连接酶、0.5µL10U/µL的phi29DNA聚合酶以及4µLDEPC水混合组成10µL的B预混液，然后将A预混液和B预混液混合均匀，用移液枪吹打均匀，以上操作均在冰面上进行，然后置于30℃下反应6小时，于65℃下10分钟使酶失活以终止扩增反应；（2）单核苷酸多态性的分型测定：取步骤（1）中的扩增产物5μL、1μL6×LoadingBuffer和0.6μL100×SyberGreenⅠ工作液，室温放置5分钟，灌胶后点样到质量百分比浓度为1%的琼脂糖凝胶中，跑胶时用1×TBE缓冲液即0.04mol/LTris-硼酸，0.001mol/LEDTA，pH=8.0的溶液，在100V电压下跑胶40分钟，在凝胶成像仪下成像，保存图片；（3）单核苷酸多态性荧光检测：取步骤（1）中的扩增产物2μL、2μL20×SyberGreenⅠ溶液，用pH7.410mmol/L磷酸盐缓冲溶液溶液稀释到100μL，室温下保持10-15分钟，用350μL的微量比色皿测定，荧光测量时选择激发波长为495nm，光谱记录范围从505nm到700nm，在534nm处测定其荧光信号强度。 2.如权利要求1所述的超支化一锅法滚环扩增检测单核苷酸多态性的方法，其特征在于所述步骤（1）混合后的20μL溶液中含有pH7.670mmol/LTris-HCl，25mmol/LKAc，10mmol/LMg(Ac)，1mmol/L烟酰胺腺嘌呤二核苷酸即NAD，10mmol/LMgCl，10mmol/L(NH)SO，14mmol/L二硫苏糖醇即DTT，质量百分比浓度为0.2%的TritonX-100，500μmol/L的dNTPs，0.2μmol/L2ndprimer、20UTaqDNA连接酶、5U的phi29DNA聚合酶和0.5nmol/L目标核酸。

说明书

技术领域

本发明涉及一种超支化一锅法滚环扩增单核苷酸多态性的方法，属于分子生物学和核酸化学领域。

背景技术

单核苷酸多态性(SNPs)是人类基因组中最常见的变异类型，它们为各种医学遗传学研究提供了强有力的工具。单核苷酸多态性具有如下特点：（1）数量众多，分布广泛约占人类基因组中核苷酸的1‰，其总数达到300万个甚至更多，比前两种遗传标记广泛地多。（2）高度稳定，特别是处于编码区的SNPs是高度稳定的。（3）适于快速、自动化分析，一般的SNPs都是二态的标记，不需要分析片段的长度，这有利于SNPs的自动化分析和检测。（4）适于基因分型，在任何人群中可以估算其等位基因的频率。因此，发展选择性高，灵敏度好的检测SNPs的方法对遗传疾病的基因诊断和发病机理研究有着重要的意义。

超支化滚环扩增是在线性滚环扩增体系中引入第二条与锁式探针序列相同的反向引物即第二引物，其与滚环扩增产物互补并进行反向延伸并顶替下游生成的DNA链，从而形成了不同长度的双链DNA和单链DNA，这种循环依次进行，超支化滚环扩增反应的速度比线性扩增快很多，可以实现109倍的指数式扩增，能够进一步提高检测的灵敏度。

一锅法滚环扩增结合荧光电泳检测SNPs的方法，虽然实现了检测SNPs的高选择性测定，但灵敏度还有待提高。针对一锅法检测灵敏度低的问题，建立了超支化一锅法滚环扩增技术。在一锅法滚环扩增基础上加入第二引物（2nd primer），以一锅法滚环扩增的扩增产物为模板进行反向扩增，加入高灵敏的SYBR Green I染料进行荧光测量，建立了超支化一锅法滚环扩增技术。超支化扩增技术提高了一锅法滚环扩增的灵敏度，该方法不仅简便快捷，而且灵敏度高，检出限低，成功检测出1%的突变频率。

发明内容

本发明的目的是提供一种超支化一锅法滚环扩增检测单核苷酸多态性的方法。

具体步骤为：

（1）将1 µL浓度为1 μmol/L的锁式探针、1 µL浓度为10mmol/L的dNTPs、1μL浓度为4μmol/L 的2nd primer和7µL的焦碳酸二乙酯处理的蒸馏水(DEPC水)混合组成10µL的A预混液，再将2 µL 10×Taq DNA 连接酶缓冲液、2 µL 10× phi29 DNA 聚合酶缓冲液、1 µL浓度为10 nmol/L的待测靶序列、0.5 µL 40U/ µL的Taq DNA连接酶、0.5 µL 10U/ µL的phi29 DNA聚合酶以及4 µL DEPC水混合组成10 µL的 B预混液，然后将A预混液和B预混液混合均匀，混合后的20 µL溶液中含有70 mmol/L Tris-HCl (pH 7.6)，25 mmol/L KAc，10 mmol/L Mg(Ac)2，1 mmol/L 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)， 10 mmol/L MgCl2，10 mmol/L (NH4)2SO4，14 mmol/L 二硫苏糖醇(DTT)，质量百分比浓度为0.2% 的Triton X-100， 500 μmol/L的dNTPs，0.2 μmol/L2nd primer、20 U Taq DNA连接酶、5 U的phi29 DNA聚合酶和0.5 nmol/L目标DNA，以上操作均在冰上完成，然后置于30℃下反应6 小时，于65℃下10分钟使酶失活以终止扩增反应。

（2）单核苷酸多态性分型测定：取步骤（1）中的扩增产物5 µL、1 µL 6×Loading Buffer和0.6 µL Syber GreenⅠ工作液（100×），室温放置5分钟，灌胶后点样到质量百分比浓度1%的琼脂糖凝胶中，跑胶时用1×TBE缓冲液（0.04 mol/L Tris-硼酸，0.001 mol/L EDTA，pH=8.0），在100V电压下跑胶40分钟，在凝胶成像仪下成像，保存图片。

（3）单核苷酸多态性荧光检测：取步骤（1）中的扩增产物2 µL、加入2 µL Syber Green Ⅰ(20×)溶液，用10 mmol/L磷酸盐缓冲溶液（pH7.4）溶液稀释到100 µL，室温下保持10分钟，用350 µL的微量比色皿测定，荧光测量时选择激发波长为495 nm，光谱记录范围从505 nm到700 nm，在534 nm处测定其荧光信号强度。

本发明方法的优点如下：

一锅法滚环扩增合三为一，简单便捷。将扩增需要的目标序列、锁式探针、连接酶、聚合酶和dNTPs等原料混合，在一定温度下和缓冲体系下反应实现一步扩增。超支化扩增技术提高了一锅法滚环扩增的灵敏度，该方法不仅简便快捷，而且灵敏度高，检出限低。

附图说明

图1为本发明超支化一锅法滚环扩增检测单核苷酸多态性的原理图。

图2为DNA错配位点和第二引物的序列图。

图3为本发明实施例中的琼脂糖凝胶电泳图。

图4为本发明实施例中一锅法和超支化一锅法滚环扩增检测单核苷酸多态性的荧光光谱。

图5为本发明实施例中单核苷酸多态性突变频率检测图。

图6为本发明实施例中不同浓度DNA-7a的一锅法超支化滚环扩增反应的荧光光谱。

图7为本发明实施例中DNA-7a浓度为5 pmol/L-200 pmol/L线性关系曲线。

具体实施方式

以下将结合说明书附图和具体实施例对本发明做详细说明。

实施例：

（1）将1 µL浓度为1 μmol/L的锁式探针、1 µL浓度为10mmol/L的dNTPs，1μL浓度为4μmol/L 的2nd primer和7µL的焦碳酸二乙酯处理的蒸馏水(DEPC水)混合组成10µL的A预混液，再将2 µL 10×Taq DNA 连接酶缓冲液、2 µL 10× phi29 DNA 聚合酶缓冲液、1 µL浓度为10 nmol/L的待测靶序列、0.5 µL 40U/ µL的Taq DNA连接酶、0.5 µL 10U/ µL的phi29 DNA聚合酶以及4 µL DEPC水混合组成10 µL的 B预混液，然后将A预混液和B预混液混合均匀，用移液枪吹打均匀，混合后的20 μL溶液中含有70 mmol/L Tris-HCl (pH 7.6)，25 mmol/L KAc，10 mmol/L Mg(Ac)2，1 mmol/L 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)， 10 mmol/L MgCl2，10 mmol/L (NH4)2SO4，14 mmol/L二硫苏糖醇(DTT)，质量百分比浓度为0.2% 的Triton X-100， 500 μmol/L的dNTPs，0.2 μmol/L 2nd primer、20 U Taq DNA连接酶、5 U的phi29 DNA聚合酶和0.5 nmol/L目标核酸，以上操作均在冰面上进行，然后置于30℃下反应6 小时，于65℃下10 分钟使酶失活以终止扩增反应。

（2）单核苷酸多态性荧光的检测：

取步骤1中的扩增产物2 µL、加入2 µL Syber Green Ⅰ(20×)溶液，用10 mmol/L磷酸盐缓冲溶液（pH7.4）溶液稀释到100 µL，室温下保持10分钟，用350 µL的微量比色皿测定，荧光测量时选择激发波长为495 nm，光谱记录范围从505 nm到700 nm，在534 nm处测定其荧光信号强度。

（3）单核苷酸多态性的分型测定：

取步骤1中的扩增产物5 µL、加入1 µL 6×Loading Buffer和0.6 µL Syber Green Ⅰ工作液（100×），室温放置5分钟，灌胶后点样到质量百分比浓度为1%的琼脂糖凝胶中，跑胶时用1×TBE缓冲液（0.04 mol/L Tris-硼酸，0.001 mol/L EDTA，pH=8.0），在100V电压下跑胶40分钟，在凝胶成像仪下成像，保存图片。

通过应用超支化一锅法滚环扩增反应检测单核苷酸多态性的原理图分析，如图1所示，一锅法将常规滚环扩增反应合三为一，连接反应和扩增反应同时进行，锁式探针与目标DNA-7a完全互补，在Taq DNA连接酶的作用下以DNA-7a为模板连接成环，同时DNA-7a又作为引物，以环化的锁式探针为模板，在phi29 DNA聚合酶的作用下引发滚环扩增反应；此外，加入的第二引物能够与目标DNA-7a引发产生的串联滚环扩增产物的重复序列产物杂交并进行顶替反向扩增，置换下游生成的DNA序列，引起超支化扩增反应，在反应过程中产生了不同长度的双链DNA和单链DNA产物，加入Syber Green Ⅰ染料进行荧光测量，导致荧光信号显著增强。相比较DNA-7d有两个与锁式探针错配的碱基，不能被连接酶连接成环，只发生线性的扩增，加入Syber Green Ⅰ后产生了很弱的荧光背景信号。引入支化滚环扩增，进一步提高了一锅法超支化滚环扩增反应的灵敏度。

图2为DNA错配位点图，除了DNA-7a与锁式探针的部分碱基完全互补外，错配的都不能与之完全互补。

由图3可以看出，目标序列DNA-7a经过一锅法超支化滚环扩增反应后的长链DNA产物在泳道2中，因为其产物太大不能通过电泳进入凝胶，相比较，DNA-7d只发生有限的扩增，产生的扩增产物较少，所以在泳道1没中无显示。结果表明目标序列DNA-7a通过一锅法超支化滚环扩增反应产生了特异、高效的扩增。

通过对比本发明实施例中一锅法和超支化一锅法滚环扩增检测单核苷酸多态性的荧光光谱，如图4所示，DNA-7a产物（2）的荧光强度明显高于DNA-7d的强度（1），荧光比值约为4.8：1，两者有区别的原因是DNA-7a引发的是滚环扩增，DNA-7d引发的是有限的扩增，所以两者扩增效率不同；当加入第二引物发生支化扩增时，DNA-7a的荧光信号显著增强，表明支化扩增反应产生单双链产物的荧光强度明显多于线性扩增；与之相比DNA-7d只发生了有限扩增，其不能与第二引物发生反向扩增，加入第二引物之后荧光强度变化较小，DNA-7a进行超支化滚环扩增反应的荧光信号与DNA-7d反应产物荧光信号比值为5.4：1，结果说明引入第二引物后产生的一锅法超支化滚环扩增反应可以提高检测单核苷酸多态性的灵敏度和选择性。

通过对比本发明实施例中单核苷酸多态性突变频率检测图，如图5所示，我们将DNA-7a和7d按照不同比率混合来作为DNA样品，样品中DNA-7a和7d的总量为300 pmol/L，当DNA-7a的物质量浓度占总量的1%、5%、10%、50%、100%时，样品在534 nm处的荧光强度与突变频率呈现良好的线性关系，线性方程为I=22.95 C+57.15，线性相关系数为r=0.9968，结果表明，本方法可以成功测定样品中单核苷酸多态性的突变频率。

通过对比本发明实施例中不同浓度DNA-7a的一锅法超支化滚环扩增反应的荧光光谱，如图6所示，在5 pmol/L-200 pmol/L 范围内，DNA-7a 的荧光信号随着浓度的增大而逐渐增强，荧光信号和浓度的对数值呈现出良好的线性关系。

通过对比本发明实施例中DNA-7a浓度为5 pmol/L-200 pmol/L线性关系曲线，如图7所示，其线性方程为I=124.9 lgC+144.1，线性相关系数为r=0.9955，检出限为2.9 pmol/L（3倍信噪比），进行平行实验估算方法的精密度，选25 pmol/L和200 pmol/L的DNA-7a进行6次重复实验，相对标准偏差分别为3.73%和4.51%。

以上仅是本发明的优选实施方案，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，与本发明构思无实质性差异的各种工艺方案均在本发明的保护范围内。

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810792602.3 (22)申请日 2018.07.18 (71)申请人桂林理工大学地址 541004 广西壮族自治区桂林市七星区建干路12号 (72)发明人朱文远周琳莹郝杰梁晓琳潘宏程郭自宽 (51)Int.Cl. C12Q 1/6858(2018.01) (54)发明名称一种超支化一锅法滚环扩增检测单核苷酸多态性的方法 (57)摘要本发明公开了一种超支化一锅法滚环扩增检测单核苷酸多态性的方法。结合超支化一锅法滚环扩增反应和无标记荧光检测，建立。

2、了一种灵敏度高和特异性好的单核苷酸多态性检测方法。方法利用了特异性的连接反应和强有力的目标 DNA引导的支化滚环扩增反应，在一锅法的基础上引入第二引物，其能通过一锅法超支化滚环扩增反应进行有效的扩增并产生了不同长度的DNA 产物，随后加入高灵敏的SYBRGreenI染料进行荧光测量，提高了一锅法滚环扩增的灵敏度，方法可用于单核苷酸多态性的快速定量检测。权利要求书1页说明书4页附图4页 CN 108707649 A 2018.10.26 CN 108707649 A 1.一种超支化一锅法滚环扩增检测单核苷酸多态性的方法，其特征在于具体步骤为：（1）将1 L浓度为。

3、1 mol/L的锁式探针、 1 L浓度为10mmol/L的四种脱氧核糖核苷三磷酸的混合物即dNTPs， 1 L浓度为4 mol/L 的第二引物即2nd primer和7L的焦碳酸二乙酯处理的蒸馏水即DEPC水混合组成10L的A预混液，再将2 L 10Taq DNA 连接酶缓冲液、 2 L 10 phi29 DNA 聚合酶缓冲液、 1 L浓度为10 nmol/L的待测靶序列、 0.5 L 40U/ L的Taq DNA连接酶、 0.5 L 10U/ L的phi29 DNA聚合酶以及4 L DEPC水混合组成 10 L的 B预混液，然后将A预混液和B预混液混合均匀，用移液枪吹打均匀，以。

4、上操作均在冰面上进行，然后置于30下反应6 小时，于65下10 分钟使酶失活以终止扩增反应；（2）单核苷酸多态性的分型测定：取步骤（1）中的扩增产物5L、 1L 6Loading Buffer和0.6 L 100Syber Green 工作液，室温放置5分钟，灌胶后点样到质量百分比浓度为1%的琼脂糖凝胶中，跑胶时用1TBE缓冲液即0.04 mol/L Tris-硼酸， 0.001 mol/L EDTA， pH=8.0的溶液，在100V电压下跑胶40分钟，在凝胶成像仪下成像，保存图片；（3）单核苷酸多态性荧光检测：取步骤（1）中的扩增产物2 L、 2 L 。

5、20Syber Green 溶液，用pH7.4 10 mmol/L磷酸盐缓冲溶液溶液稀释到100 L，室温下保持10-15分钟，用 350 L的微量比色皿测定，荧光测量时选择激发波长为495 nm，光谱记录范围从505 nm到 700 nm，在534 nm处测定其荧光信号强度。 2.如权利要求1所述的超支化一锅法滚环扩增检测单核苷酸多态性的方法，其特征在于所述步骤（1）混合后的20 L溶液中含有pH 7.6 70 mmol/L Tris-HCl， 25 mmol/L KAc， 10 mmol/L Mg(Ac)2， 1 mmol/L 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸即NAD， 10 mm。

6、ol/L MgCl2， 10 mmol/ L (NH4)2SO4， 14 mmol/L二硫苏糖醇即DTT，质量百分比浓度为0.2% 的Triton X-100， 500 mol/L的dNTPs， 0.2 mol/L 2nd primer、 20 U Taq DNA连接酶、 5 U的phi29 DNA聚合酶和 0.5 nmol/L目标核酸。权利要求书 1/1 页 2 CN 108707649 A 2 一种超支化一锅法滚环扩增检测单核苷酸多态性的方法技术领域 0001 本发明涉及一种超支化一锅法滚环扩增单核苷酸多态性的方法，属于分子生物学和核酸化学领域。背景技术 0002 单核苷酸多态。

7、性(SNPs)是人类基因组中最常见的变异类型，它们为各种医学遗传学研究提供了强有力的工具。单核苷酸多态性具有如下特点：（1）数量众多，分布广泛约占人类基因组中核苷酸的1，其总数达到300万个甚至更多，比前两种遗传标记广泛地多。（2）高度稳定，特别是处于编码区的SNPs是高度稳定的。（3）适于快速、自动化分析，一般的 SNPs都是二态的标记，不需要分析片段的长度，这有利于SNPs的自动化分析和检测。（4）适于基因分型，在任何人群中可以估算其等位基因的频率。因此，发展选择性高，灵敏度好的检测SNPs的方法对遗传疾病的基因诊断和发病机理研究有着重要的意义。

8、。 0003 超支化滚环扩增是在线性滚环扩增体系中引入第二条与锁式探针序列相同的反向引物即第二引物，其与滚环扩增产物互补并进行反向延伸并顶替下游生成的DNA链，从而形成了不同长度的双链DNA和单链DNA，这种循环依次进行，超支化滚环扩增反应的速度比线性扩增快很多，可以实现109倍的指数式扩增，能够进一步提高检测的灵敏度。 0004 一锅法滚环扩增结合荧光电泳检测SNPs的方法，虽然实现了检测SNPs的高选择性测定，但灵敏度还有待提高。针对一锅法检测灵敏度低的问题，建立了超支化一锅法滚环扩增技术。在一锅法滚环扩增基础上加入第二引物（2nd primer），以。

9、一锅法滚环扩增的扩增产物为模板进行反向扩增，加入高灵敏的SYBR Green I染料进行荧光测量，建立了超支化一锅法滚环扩增技术。超支化扩增技术提高了一锅法滚环扩增的灵敏度，该方法不仅简便快捷，而且灵敏度高，检出限低，成功检测出1%的突变频率。发明内容 0005 本发明的目的是提供一种超支化一锅法滚环扩增检测单核苷酸多态性的方法。 0006 具体步骤为：（1）将1 L浓度为1 mol/L的锁式探针、 1 L浓度为10mmol/L的dNTPs、 1 L浓度为4 mol/L 的2nd primer和7L的焦碳酸二乙酯处理的蒸馏水(DEPC水)混合组成10L的A预混液，。

10、再将2 L 10Taq DNA 连接酶缓冲液、 2 L 10 phi29 DNA 聚合酶缓冲液、 1 L浓度为10 nmol/L的待测靶序列、 0.5 L 40U/ L的Taq DNA连接酶、 0.5 L 10U/ L的phi29 DNA聚合酶以及4 L DEPC水混合组成10 L的 B预混液，然后将A预混液和B预混液混合均匀，混合后的20 L溶液中含有70 mmol/L Tris-HCl (pH 7.6)， 25 mmol/L KAc， 10 mmol/L Mg(Ac)2， 1 mmol/L 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)， 10 mmol/L MgCl2， 10 mmol/L (N。

11、H4) 2SO4， 14 mmol/L 二硫苏糖醇(DTT)，质量百分比浓度为0.2% 的Triton X-100， 500 mol/L 的dNTPs， 0.2 mol/L2nd primer、 20 U Taq DNA连接酶、 5 U的phi29 DNA聚合酶和0.5 nmol/L目标DNA，以上操作均在冰上完成，然后置于30下反应6 小时，于65下10分钟使说明书 1/4 页 3 CN 108707649 A 3 酶失活以终止扩增反应。 0007 （2）单核苷酸多态性分型测定：取步骤（1）中的扩增产物5 L、 1 L 6Loading Buffer和0.6 L Syber。

12、 Green 工作液（100），室温放置5分钟，灌胶后点样到质量百分比浓度1%的琼脂糖凝胶中，跑胶时用1TBE缓冲液（0.04 mol/L Tris-硼酸， 0.001 mol/L EDTA， pH=8.0），在100V电压下跑胶40分钟，在凝胶成像仪下成像，保存图片。 0008 （3）单核苷酸多态性荧光检测：取步骤（1）中的扩增产物2 L、加入2 L Syber Green (20)溶液，用10 mmol/L磷酸盐缓冲溶液（pH7.4）溶液稀释到100 L，室温下保持 10分钟，用350 L的微量比色皿测定，荧光测量时选择激发波长为495 nm，。

13、光谱记录范围从 505 nm到700 nm，在534 nm处测定其荧光信号强度。 0009 本发明方法的优点如下：一锅法滚环扩增合三为一，简单便捷。将扩增需要的目标序列、锁式探针、连接酶、聚合酶和dNTPs等原料混合，在一定温度下和缓冲体系下反应实现一步扩增。超支化扩增技术提高了一锅法滚环扩增的灵敏度，该方法不仅简便快捷，而且灵敏度高，检出限低。附图说明 0010 图1为本发明超支化一锅法滚环扩增检测单核苷酸多态性的原理图。 0011 图2为DNA错配位点和第二引物的序列图。 0012 图3为本发明实施例中的琼脂糖凝胶电泳图。 0013 图4为本发明实施例中一锅法。

14、和超支化一锅法滚环扩增检测单核苷酸多态性的荧光光谱。 0014 图5为本发明实施例中单核苷酸多态性突变频率检测图。 0015 图6为本发明实施例中不同浓度DNA-7a的一锅法超支化滚环扩增反应的荧光光谱。 0016 图7为本发明实施例中DNA-7a浓度为5 pmol/L-200 pmol/L线性关系曲线。具体实施方式 0017 以下将结合说明书附图和具体实施例对本发明做详细说明。 0018 实施例：（1）将1 L浓度为1 mol/L的锁式探针、 1 L浓度为10mmol/L的dNTPs， 1 L浓度为4 mol/L 的2nd primer和7L的焦碳酸二乙酯处理的蒸馏水(DEPC水)。

15、混合组成10L的A预混液，再将2 L 10Taq DNA 连接酶缓冲液、 2 L 10 phi29 DNA 聚合酶缓冲液、 1 L浓度为10 nmol/L的待测靶序列、 0.5 L 40U/ L的Taq DNA连接酶、 0.5 L 10U/ L的phi29 DNA聚合酶以及4 L DEPC水混合组成10 L的 B预混液，然后将A预混液和B预混液混合均匀，用移液枪吹打均匀，混合后的20 L溶液中含有70 mmol/L Tris-HCl (pH 7.6)， 25 mmol/L KAc， 10 mmol/L Mg(Ac)2， 1 mmol/L 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)， 10 m。

16、mol/L MgCl2， 10 mmol/L (NH4)2SO4， 14 mmol/L二硫苏糖醇(DTT)，质量百分比浓度为0.2% 的 Triton X-100， 500 mol/L的dNTPs， 0.2 mol/L 2nd primer、 20 U Taq DNA连接酶、 5 U 的phi29 DNA聚合酶和0.5 nmol/L目标核酸，以上操作均在冰面上进行，然后置于30下反应6 小时，于65下10 分钟使酶失活以终止扩增反应。说明书 2/4 页 4 CN 108707649 A 4 0019 （2）单核苷酸多态性荧光的检测：取步骤1中的扩增产物2 L、加入2 L Sy。

17、ber Green (20)溶液，用10 mmol/L磷酸盐缓冲溶液（pH7.4）溶液稀释到100 L，室温下保持10分钟，用350 L的微量比色皿测定，荧光测量时选择激发波长为495 nm，光谱记录范围从505 nm到700 nm，在534 nm处测定其荧光信号强度。 0020 （3）单核苷酸多态性的分型测定：取步骤1中的扩增产物5 L、加入1 L 6Loading Buffer和0.6 L Syber Green 工作液（100），室温放置5分钟，灌胶后点样到质量百分比浓度为1%的琼脂糖凝胶中，跑胶时用1TBE缓冲液（0.04 mol/L Tris-。

18、硼酸， 0.001 mol/L EDTA， pH=8.0），在100V电压下跑胶40分钟，在凝胶成像仪下成像，保存图片。 0021 通过应用超支化一锅法滚环扩增反应检测单核苷酸多态性的原理图分析，如图1 所示，一锅法将常规滚环扩增反应合三为一，连接反应和扩增反应同时进行，锁式探针与目标DNA-7a完全互补，在Taq DNA连接酶的作用下以DNA-7a为模板连接成环，同时DNA-7a又作为引物，以环化的锁式探针为模板，在phi29 DNA聚合酶的作用下引发滚环扩增反应；此外，加入的第二引物能够与目标DNA-7a引发产生的串联滚环扩增产物的重复序列产物杂交并进行。

19、顶替反向扩增，置换下游生成的DNA序列，引起超支化扩增反应，在反应过程中产生了不同长度的双链DNA和单链DNA产物，加入Syber Green 染料进行荧光测量，导致荧光信号显著增强。相比较DNA-7d有两个与锁式探针错配的碱基，不能被连接酶连接成环，只发生线性的扩增，加入Syber Green 后产生了很弱的荧光背景信号。引入支化滚环扩增，进一步提高了一锅法超支化滚环扩增反应的灵敏度。 0022 图2为DNA错配位点图，除了DNA-7a与锁式探针的部分碱基完全互补外，错配的都不能与之完全互补。 0023 由图3可以看出，目标序列DNA-7a经过一锅法超支。

20、化滚环扩增反应后的长链DNA产物在泳道2中，因为其产物太大不能通过电泳进入凝胶，相比较， DNA-7d只发生有限的扩增，产生的扩增产物较少，所以在泳道1没中无显示。结果表明目标序列DNA-7a通过一锅法超支化滚环扩增反应产生了特异、高效的扩增。 0024 通过对比本发明实施例中一锅法和超支化一锅法滚环扩增检测单核苷酸多态性的荧光光谱，如图4所示， DNA-7a产物（2）的荧光强度明显高于DNA-7d的强度（1），荧光比值约为4.8： 1，两者有区别的原因是DNA-7a引发的是滚环扩增， DNA-7d引发的是有限的扩增，所以两者扩增效率不同；当加入第二引物发。

21、生支化扩增时， DNA-7a的荧光信号显著增强，表明支化扩增反应产生单双链产物的荧光强度明显多于线性扩增；与之相比DNA-7d只发生了有限扩增，其不能与第二引物发生反向扩增，加入第二引物之后荧光强度变化较小， DNA-7a 进行超支化滚环扩增反应的荧光信号与DNA-7d反应产物荧光信号比值为5.4： 1，结果说明引入第二引物后产生的一锅法超支化滚环扩增反应可以提高检测单核苷酸多态性的灵敏度和选择性。 0025 通过对比本发明实施例中单核苷酸多态性突变频率检测图，如图5所示，我们将 DNA-7a和7d按照不同比率混合来作为DNA样品，样品中DNA-7a和7d的总量为300。

22、 pmol/L，当 DNA-7a的物质量浓度占总量的1%、 5%、 10%、 50%、 100%时，样品在534 nm处的荧光强度与突变频率呈现良好的线性关系，线性方程为I=22.95 C+57.15，线性相关系数为r=0.9968，结果说明书 3/4 页 5 CN 108707649 A 5 表明，本方法可以成功测定样品中单核苷酸多态性的突变频率。 0026 通过对比本发明实施例中不同浓度DNA-7a的一锅法超支化滚环扩增反应的荧光光谱，如图6所示，在5 pmol/L-200 pmol/L 范围内， DNA-7a 的荧光信号随着浓度的增大而逐渐增强，荧光信号和浓度的。

23、对数值呈现出良好的线性关系。 0027 通过对比本发明实施例中DNA-7a浓度为5 pmol/L-200 pmol/L线性关系曲线，如图7所示，其线性方程为I=124.9 lgC+144.1，线性相关系数为r=0.9955，检出限为2.9 pmol/L （3倍信噪比），进行平行实验估算方法的精密度，选25 pmol/L和200 pmol/L的DNA- 7a进行6次重复实验，相对标准偏差分别为3.73%和4.51%。 0028 以上仅是本发明的优选实施方案，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，与本发明构思无实质性差异的各种工艺方案均在本发明的保护范围内。说明书 4/4 页 6 CN 108707649 A 6 图1 图2 说明书附图 1/4 页 7 CN 108707649 A 7 图3 图4 说明书附图 2/4 页 8 CN 108707649 A 8 图5 图6 说明书附图 3/4 页 9 CN 108707649 A 9 图7 说明书附图 4/4 页 10 CN 108707649 A 10 。

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