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1、(10)申请公布号 CN 102268487 A (43)申请公布日 2011.12.07 CN 102268487 A *CN102268487A* (21)申请号 201110139619.7 (22)申请日 2011.05.27 C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) G01N 21/64(2006.01) (71)申请人 江苏硕世生物科技有限公司 地址 225300 江苏省泰州市开发区寺巷富野 村帅于村 A 栋 (G19) 第三层厂房与第 三、 第四层办研区 (72)发明人 张旭 王国强 刘中华 魏赵延 李秀林 (74)专利代理机构 北京科龙寰宇知识。
2、产权代理 有限责任公司 11139 代理人 孙皓晨 余光军 (54) 发明名称 登革热病毒 III 型 /IV 型双重荧光 PCR 检测 试剂盒 (57) 摘要 本发明公开了登革热病毒 III 型 /IV 型双重 荧光 PCR 检测试剂盒， 属于登革热病毒的检测领 域。本发明试剂盒包括以下各组分 ： RT-PCR 反应 液、 酶混合液、 登革热病毒 III 型 /IV 型双重反应 液和去 RNA 酶水。本发明登革热病毒 III 型 /IV 型双重荧光 PCR 检测试剂盒解决了现有的体外检 测试剂盒无法在同一反应管中同时检测出登革热 病毒不同亚型的问题， 能够在同一反应管中同时 检测出登革热病毒。
3、III型和IV型， 具有特异性强、 灵敏性高， 还具有操作简便、 可重复性强、 检测结 果快速客观等优点。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 6 页 序列表 2 页 附图 2 页 CN 102268494 A1/1 页 2 1.一种登革热病毒III型/IV型双重荧光PCR检测试剂盒， 其特征在于， 包括以下各组 分 ： RT-PCR 反应液、 酶混合液、 登革热病毒 III 型 /IV 型双重反应液和去 RNA 酶水。 2. 按照权利要求 1 所述的双重荧光 PCR 检测试剂盒， 其特征在于， 所述的登革热病毒 II。
4、I 型 /IV 型双重反应液由以下组分 (1) 和组分 (2) 组成 ： 组分 (1) ： 由一对检测登革热病毒 III 型的引物和一条检测登革热病毒 III 型的探针 组成 ； 其中， 所述引物对的碱基序列分别为 SEQ ID No.1 和 SEQ ID No.2 所示 ； 所述探针的 碱基序列为SEQ ID No.3所示， 该探针的5端标记有荧光报告基团， 3端标记有荧光淬灭 基团 ； 组分 (2) ： 由一对检测登革热病毒 IV 型的引物和一条检测登革热病毒 IV 型的探针组 成 ； 其中， 所述引物对的碱基序列分别为 SEQ ID No.4 和 SEQ ID No.5 所示 ； 所述探。
5、针的碱 基序列为SEQ ID No.6所示， 该探针的5端标记有荧光报告基团， 3端标记有荧光淬灭基 团。 3. 按照权利要求 2 所述的双重荧光 PCR 检测试剂盒， 其特征在于 ： 所述的荧光报告基 团包括 FAM、 HEX、 ROX、 CY3 或 CY5 荧光报告基团 ； 所述的荧光淬灭基团包括 BHQ1、 BHQ2 或 BHQ3 荧光淬灭基团。 4.按照权利要求2所述的双重荧光PCR检测试剂盒， 其特征在于， 组分(1)中各引物及 探针的配比如下 ： SEQ ID No.1SEQ ID No.2SEQ ID No.3500nM500nM400nM。 5.按照权利要求2所述的双重荧光PC。
6、R检测试剂盒， 其特征在于， 组分(2)中各引物及 探针的配比如下 ： SEQ ID No.4 SEQ ID No.5 SEQ IDNo.6 600nM 600nM 300nM。 6. 按照权利要求 1-5 任何一种所述的双重荧光 PCR 检测试剂盒， 其特征在于 ： 还含有 登革热病毒 III 型 /IV 型的阳性参考品。 权 利 要 求 书 CN 102268487 A CN 102268494 A1/6 页 3 登革热病毒 III 型 /IV 型双重荧光 PCR 检测试剂盒 技术领域 0001 本发明涉及一种登革热病毒体外检测试剂盒， 尤其涉及登革热病毒 III 型 /IV 型 双重荧光。
7、 PCR 检测试剂盒， 本发明属于登革热病毒血清型的体外检测领域。 背景技术 0002 登革热 (Classical dengue fever， DF) 是由登革热病毒 (dengue virus) 的 4 个 血清型引起的一种急性传染病， 主要通过埃及伊蚊和白纹伊蚊传播， 临床上以高热、 出血、 全身肌肉和关节痛等为主要症状， 可伴有皮疹、 淋巴腺肿和白细胞减少。 登革热病毒感染除 引起登革热外， 严重的还可导致登革出血热 (denguehemorrhagic fever， DHF) 或登革休克 综合症 (dengue shocksyndrome， DSS) 等症状。 0003 DHF以高热。
8、、 出血、 休克和高病死率为特征， 是较为严重的一种临床类型。 由于全球 气候变暖、 国际旅游频繁和对蚊虫缺乏有效的控制， 登革热在世界范围内发生过多次大流 行， 全球有 100 多个国家出现流行， 据 WHO 统计， 每年登革热感染人数有 5000 万， 全世界有 25 亿人正受到感染登革病毒的威胁， 每年均出现几百万病例， 是较为严重的公共卫生问题。 0004 登革病毒是黄病毒科(flaviviridae)黄病毒属(flavivirus)登革亚组的重要成 员， 自然界中存在的登革病毒可分为 4 个血清型。登革热的传染源主要是处于病毒血症期 的显性和隐性的感染者， 在城市型疫源地区患者和隐性。
9、感染者是主要的传染来源。在新疫 区普遍易感。但以青壮年发病率最高。在地方性流行区， 20 岁以下的居民， 100在血清中 能检出抗登革热病毒的中和抗体， 因而发病者多为儿童。 0005 登革热的发现已有 200 多年的历史， 早期记载的报道是 1779 年埃及开罗、 印度尼 西亚雅加达及美国费城， 并根据症状命名为关节热和骨折热。1869 年由英国伦敦皇家内科 学会命名为登革热。中国于 1978 年在广东流行， 并分离出 IV 型登革热病毒。此后， 1979、 1980、 1985 年小流行中分离出 I 型、 II、 III 型病毒。目前各地区主要以散在暴发或散发为 主， 并且以输入型病例引发。
10、的流行居多。 0006 实时荧光定量 PCR 技术 (Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction 简称 Real Time PCR) 是在定性 PCR 技术基础上发展起来的核酸定量技术。实时荧光定量 PCR 技术于 1996 年由美国 Applied biosystems 公司推出， 在 PCR 反应体系中加入荧光基 团， 利用荧光信号积累实时监测整个 PCR 进程， 使每一个循环变得 “可见” ， 最后通过 Ct 值 和标准曲线对样品中的 DNA(cDNA) 的起始浓度进行定量的方法。如果用于 RNA 检测， 这被 称为逆转录实时 PCR。
11、 即 (Real-time RT-PCR) 是实时 PCR 法， 它是指对 DNA 或经过反转录 (RT-PCR) 的 RNA 通过聚合酶链式反应并实时监测 DNA 的放大过程， 在扩增的指数增长期就 测量扩增产物， 因为扩增指数增长期测量值与特异 DNA(RNA) 起始量存在相关性， 从而实现 定量检测。RealTime PCR 的基本目标是精确测量和鉴别非常微量的特异性核酸， 从而可通 过监测 CT 值而实现对原始目标基因的含量定量。实时荧光定量 PCR 法最大的优点是克服 了终点 PCR 法进入平台期或叫饱和期后定量的较大误差， 实现 DNA/RNA 的精确定量。该技 术不仅实现了对 D。
12、NA/RNA 模板的定量， 而且具有灵敏性和特异性高、 能实现多重反应、 自动 说 明 书 CN 102268487 A CN 102268494 A2/6 页 4 化程度高、 无污染、 实时和准确等特点。此外， 通过在该体系中加入两条或者两条以上引物 及对应的探针， 便可实现对多种病原体的同时检测。 0007 现有的登革热病毒体外诊断试剂盒大多不能够同时在一个反应管中分别检测出 登革热病毒 III 型和 IV 型， 且存在特异性和灵敏性较低、 检测步骤繁琐等缺陷， 有待改进。 发明内容 0008 本发明的主要目的提供是一种能够同时在一个反应管中分别检测出登革热病毒 III 型、 IV 型的双。
13、重荧光 PCR 检测试剂盒， 具有特异性强、 灵敏性高等优点。 0009 为了达到上述目的， 本发明采用了这样的技术方案 ： 0010 一种登革热病毒III型/IV型双重荧光PCR检测试剂盒， 包括以下各组分 ： RT-PCR 反应液、 酶混合液、 登革热病毒 III 型 /IV 双重反应液和去 RNA 酶水。 0011 其中， 所述的登革热病毒 III 型 /IV 型双重反应液由以下 2 组组分组成 ： 0012 组分 (1) ： 由一对检测登革热病毒 III 型的引物和一条检测登革热病毒 III 型的 探针组成 ； 其中， 两条引物的碱基序列分别为 SEQ ID No.1 和 SEQ ID。
14、 No.2 所示 ； 探针的碱 基序列为SEQ ID No.3所示， 该探针的5端标记有荧光报告基团， 3端标记有荧光淬灭基 团。 0013 组分 (2) ： 由一对检测登革热病毒 IV 型的引物和一条检测登革热病毒 IV 型的探 针组成 ； 其中， 两条引物的碱基序列分别为SEQ ID No.4和SEQ IDNo.5所示 ； 探针的碱基序 列为 SEQ ID No.6 所示， 该探针的 5端标记有荧光报告基团， 3端标记有荧光淬灭基团。 0014 其中， 所述的荧光报告基团包括 FAM、 HEX、 ROX、 CY3 或 CY5 等荧光报告基团 ； 所述 的荧光淬灭基团包括 BHQ1、 BHQ。
15、2 或 BHQ3 等荧光淬灭基团 ； 0015 本发明对上述引物和探针的配比比例进行了摸索和优化， 试验结果发现， 它们之 间不同的配比比例对于检测结果的特异性和灵敏性具有显著的差异， 本发明通过高通量的 筛选试验发现， 上述引物和探针在下述配比下， 具有最优的检测效果 ： 0016 检测登革热病毒 III 型的引物及探针的配比分别为 ： SEQ ID No.1 SEQ ID No.2 SEQ ID No.3 500nM 500nM 400nM ； 0017 检测登革热病毒 IV 型的引物及探针的配比分别为 ： SEQ ID No.4 SEQ ID No.5 SEQ ID No.6 600nM。
16、 600nM 300nM。 0018 表 1 登革热病毒 III 型 /IV 型引物探针 0019 说 明 书 CN 102268487 A CN 102268494 A3/6 页 5 0020 表 2 登革热病毒 III 型 /IV 型双重反应液组分 0021 试剂名称 加入体积 (l)/50 反应 登革热病毒 III 型 FP(SEQ ID No.1) 6.25 登革热病毒 III 型 RP(SEQ ID No.2) 6.25 登革热病毒 III 型 P(SEQ ID No.3) 5 登革热病毒 IV 型 FP(SEQ ID No.4) 7.5 登革热病毒 IV 型 RP(SEQ ID N。
17、o.5) 7.5 登革热病毒 IV 型 P(SEQ ID No.6) 3.75 0022 0023 为了达到更好的检测效果， 本发明试剂盒中还可含有登革热病毒 III 型 /IV 型的 阳性参考品 ( 购自北京三博远志生物科技有限公司或上海捷瑞生物工程有限公司 )。 0024 所述的酶混合液包括 RNA 酶抑制剂、 Taq 酶、 逆转录酶、 10 缓冲液、 去 RNA 酶水。 逆转录酶和DNA聚合酶在PCR扩增中起着非常重要的作用， 包括逆转录、 扩增的效率和特异 性， 为了达到更好的效果， 本发明优选采用 M-MLV 逆转录酶和热启动酶。 0025 本发明的另一个目的是提供本发明试剂盒检测登。
18、革热病毒III型/IV型的使用方 法， 包括 ： 0026 (1) 提取样本的 RNA ； 0027 (2) 准备以下组分 ： RT-PCR 反应液 12.5ul， 酶混合液 1ul， 登革热病毒 III 型 /IV 型反应液 4ul， 去 RNA 酶水 2.5ul， RNA 样本 5ul。 0028 (3)RT-PCR 扩增 ： 按照以下程序进行 RT-PCR 扩增 0029 0030 (4) 结果判定 ： 在 FAM 通道内荧光曲线呈 “S” 型曲线且 CT 35.0， 判断为登革热 病毒 III 型为阳性 ； 无典型 “S” 型扩增或 CT 35.0， 判断为登革热病毒 III 型为阴性。
19、。在 VIC 通道内荧光曲线呈 “S” 型曲线且 CT 35.0， 判断为登革热病毒 IV 型为阳性 ； 无典型 “S” 型扩增或 CT 35.0， 判断为登革热病毒 IV 型为阴性。 0031 检测前， 先按照常规的 RNA 提取方法对样本提取 RNA， 将待测标本加入准备好的登 革热病毒 III 型 /IV 型试剂的 PCR 反应管中， 在荧光定量 PCR 扩增仪中扩增检测。扩增结 束后， 根据荧光曲线判断是否感染革热病毒 III 型或 IV 型。 说 明 书 CN 102268487 A CN 102268494 A4/6 页 6 0032 本发明登革热病毒 III 型 /IV 型双重荧。
20、光 PCR 检测试剂盒能够同时检测出登革热 病毒 III 型和 IV 型， 解决了现有产品只能在一管反应中检测一种亚型登革热病毒的问题。 本发明还具有操作简便、 可重复性强、 检测结果快速客观等优点， 在登革热体外诊断领域具 有极广的应用前景。 附图说明 0033 图 1 本发明试剂盒检测五组样本的曲线图。 0034 图 2 本发明试剂盒检测登革热病毒 III 型的灵敏性试验结果。 0035 图 3 本发明试剂盒检测登革热病毒 IV 型的灵敏性试验结果。 0036 图 4 本发明试剂盒检测登革热病毒 III 型的特异性试验结果。 0037 图 5 本发明试剂盒检测登革热病毒 IV 型的特异性试。
21、验结果。 具体实施方式 0038 下面结合具体实施例来进一步描述本发明， 本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但这些实施例仅是范例性的， 并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术 人员应该理解的是， 在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式 进行修改或替换， 但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。 0039 试验例1 本发明登革热病毒III型/IV型双重荧光PCR试剂盒临床样本的检测试 验 0040 1 样本处理 (RNA 提取 ) 0041 1.1 取 200ul 登革热临床样品， 加入 400ul Binding Buffer supplemented w。
22、ith Poly(A)， 充分混匀后转入高纯化过滤管， 8000rmp 离心 15s， 弃去收集管中的废液。 0042 1.2加入500ul Inhibitor Removal Buffer至过滤管， 8000rmp离心1min， 弃去收 集管中的废液。 0043 1.3加入450ul Washing Buffer至过滤管， 8000rmp离心1min， 弃去收集管中的废 液。 0044 1.4 重复步骤 3， 然后高速离心 10s， 此步骤务必将废液去除干净 . 0045 1.5 加入 50ul Elution Buffer 至过滤管中， 室温静置 2min， 8000rmp 离心 1min。
23、， 离心所得溶液即为纯化的 RNA。 0046 2 试剂准备 0047 表 3 说 明 书 CN 102268487 A CN 102268494 A5/6 页 7 0048 0049 0050 3PCR 扩增程序 0051 0052 4 结果分析 ： 5 个临床样本具体结果见表 4 和图 1。 0053 表 4 0054 0055 试验例 2 本发明登革热病毒 III 型 /IV 型双重荧光 PCR 试剂盒灵敏性试验 0056 本试验对登革热病毒 III 型质粒 ( 购自北京三博远志生物科技有限公司 ) 和登革 热病毒 IV 型质粒 ( 购自上海捷瑞生物工程有限公司 ) 进行 10 倍倍比稀。
24、释， 检测结果表明， 本发明试剂盒具有良好的灵敏性， 并且 CT 值随浓度减少呈梯度改变 ( 图 2、 图 3)。试验结 果表明， 本发明试剂盒对于登革热病毒 III 型 /IV 型的诊断具有高度的灵敏性。 说 明 书 CN 102268487 A CN 102268494 A6/6 页 8 0057 试验例 3 本发明登革热病毒 III 型 /IV 型双重荧光 PCR 试剂盒特异性试验 0058 为了检测本发明试剂盒的特异性， 用本发明登革热病毒 III 型 /IV 型检测试剂盒 检测登革热病毒毒株、 西尼罗病毒株、 乙脑病毒毒株、 基孔肯雅病毒毒株、 黄热病毒毒株、 辛 德毕斯病毒毒株等。。
25、 0059 试验结果表明， FAM 通道仅对登革热病毒 III 型进行扩增 ( 图 4)， VIC 通道仅对登 革热病毒 IV 型进行扩增 ( 图 5)。表明本发明检测试剂盒能特异性扩增登革热病毒而不与 其它病毒核酸发生交叉反应。 说 明 书 CN 102268487 A CN 102268494 A1/2 页 9 KLPI110307 0001 江苏硕世生物科技有限公司 0002 登革热病毒 III 型 /IV 型双重荧光 PCR 检测试剂盒 0003 k1x1-0021 0004 6 0005 PatentIn version 3.5 0006 1 0007 23 0008 DNA 000。
26、9 artifical sequence 0010 1 0011 aacatgtgca cactcatagc yat 23 0012 2 0013 20 0014 DNA 0015 artifical sequence 0016 2 0017 aggttrcacc arcagtcaat 20 0018 3 0019 24 0020 DNA 0021 artifical sequence 0022 3 0023 trggagarat gtgtgatgac acgg 24 0024 4 0025 22 0026 DNA 0027 artifical sequence 0028 4 0029 tct。
27、wtcaata tgctgaaacg cg 22 0030 5 0031 25 0032 DNA 0033 artifical sequence 0034 5 0035 aaagcaatcc ggttgagaat ctctt 25 0036 6 序 列 表 CN 102268487 A CN 102268494 A2/2 页 10 0037 24 0038 DNA 0039 artifical sequence 0040 6 0041 accgcgtatc aacccctcaa gggt 24 序 列 表 CN 102268487 A CN 102268494 A1/2 页 11 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102268487 A CN 102268494 A2/2 页 12 图 3 图 4 图 5 说 明 书 附 图 CN 102268487 A 。