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1、(10)申请公布号 CN 102154167 A (43)申请公布日 2011.08.17 CN 102154167 A *CN102154167A* (21)申请号 201110001231.0 (22)申请日 2011.01.05 C12N 1/20(2006.01) C12R 1/35(2006.01) (71)申请人 北京大北农科技集团股份有限公司 地址 100080 北京市海淀区中关村大街 27 号中关村大厦 14 层大北农集团 申请人 福州大北农生物技术有限公司 (72)发明人 赵亚荣 车艳杰 闫国辉 王海燕 张峰 高玉梅 高洁 石松 (54) 发明名称 一种猪肺炎支原体培养基及其。
2、制备方法 (57) 摘要 本发明提供一种猪肺炎支原体培养基及其制 备方法， 属于兽医生物学技术领域。本发明的猪 肺炎支原体液体基础培养基组成成分为 ： 脑心浸 液、 乳清蛋白水解物、 PPLO 肉汤、 酵母浸粉、 示蛋 白胨、 硫代硫酸钠、 Hank s 液、 丙酮酸钠、 0.1酚 红溶液、 青霉素和去离子水， 使用前加入健康马血 清。 在液体培养基中加入琼脂， 得到猪肺炎支原体 的固体培养基。本发明的猪肺炎支原体培养基活 菌滴度可达1109CCU/ml11010CCU/ml ； 活菌 滴度和分离的敏感性均远远高于现有技术的培养 基， 猪肺炎支原体生长速度快、 分离的敏感性强 ； 该培养基制备。
3、方法工艺简单， 可操作性强， 适合工 业化大生产。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 6 页 CN 102154168 A1/1 页 2 1. 一种猪肺炎支原体培养基， 其特征在于主要由 A 液和 B 液和 C 液和 / 或琼脂组成 ； A 液由脑心浸出液、 PPLO 肉汤、 去离子水组成 ； B 液由 10Hank s 液、 乳清蛋白水解物、 酵母 浸出液、 丙酮酸钠、 示蛋白胨、 硫代硫酸钠、 0.1酚红、 青霉素、 去离子水组成 ； C 液为健康 马血清。 2. 权 1 所述的猪肺炎支原体培养基， 其特征在于上。
4、述成分的配比如下 ： A 液 ： 脑心浸 出液2.05.0g、 PPLO肉汤1.55.0g、 去离子水200300ml ； B液 ： 10Hank s液1.0 5.0ml、 乳清蛋白水解物1.03.0g、 酵母浸出液3.05.0g、 丙酮酸钠0.82.5g、 示蛋白 胨 1.0 3.0g、 硫代硫酸钠 0.1 0.5g、 0.1酚红 10 20ml、 青霉素 200 400u/ml、 去 离子水 500 600ml ； C 液 ： 健康马血清 140 200ml ； 琼脂 7.0 10g。 3. 权 1 所述的猪肺炎支原体培养基， 其特征在于上述成分的配比如下 ： A 液 ： 脑心浸 出液 4。
5、.5g、 PPLO 肉汤 4.0g、 去离子水 260ml ； B 液 ： 10Hank s 液 3.0ml、 乳清蛋白水解物 1.25g、 酵母浸出液 4.5g、 丙酮酸钠 1.0g、 示蛋白胨 1.5g、 硫代硫酸钠 0.135g、 0.1酚红 17ml、 青霉素 200u/ml、 去离子水 560ml ； C 液 ： 健康马血清 160ml ； 琼脂 10g。 4. 权 1-3 任一项所述的猪肺炎支原体培养基的制备方法， 其特征在于制备步骤如下 ： 按配比称取 A 液各成分， 将各成分混合， 搅拌， 使之完全溶解， 116高压灭菌 20 分 钟， 冷却后备用 ； 按配比称取B液各成分， 。
6、将各成分混合， 搅拌， 使之完全溶解， 用0.22m滤膜过滤除 菌， 4保存备用 ； 按配比称取 C 液成分， 将 A 液、 B 液和 C 液充分混合均匀， 用 1mol/L 氢氧化钠溶液调 整 pH 至 7.6 7.8， 即得猪肺炎支原体培养基。 5. 权 4 所述的猪肺炎支原体培养基的制备方法， 其特征在于还可进一步包括如下步 骤 ： 按配比称取琼脂， 加入步骤制得的培养基中， 混合均匀。 权 利 要 求 书 CN 102154167 A CN 102154168 A1/6 页 3 一种猪肺炎支原体培养基及其制备方法 技术领域 0001 本发明属于兽医生物学技术领域， 涉及一种猪肺炎支原体。
7、培养基及其制备方法。 背景技术 0002 猪肺炎支原体是引起猪的接触性慢性呼吸道疾病的重要病原之一， 是全世界广泛 存在严重危害养猪业健康发展的主要猪病病原之一， 其主要危害是引起猪的生长受阻、 饲 料转化率大幅下降， 继发引起其他疾病的发生并加重发病症状。猪支原体肺炎灭活疫苗可 以减少喘气病的发生， 但优质疫苗的前提需要有一种好的培养基来支撑。 0003 培养基是人工合成各种营养物质供微生物生长的基质。 支原体是一种微小原核生 物， 无细胞壁， 可在人工培养基上生长， 形成小菌落， 但培养条件要求十分苛刻， 且生长速度 慢， 从而难以培养， 这样对防治猪气喘病的研究造成困难。 0004 19。
8、64 年 Goodwin 等首先使用煮沸猪肺组织的灭活细胞培养基成功进行猪肺炎支 原体的分离培养。1965 年 Switer 氏等和 Goodwin 等都各自成功地研究出了能形成菌落的 固体培养基。1973 年， 我国上海农科院畜牧兽医研究所将猪肺炎支原体通过猪肺埋块细胞 培养 240 余代的基础上， 参考 Goodwin 等报导的复合培养基， 使用了无细胞培养技术。1975 年江苏农业科学院在 Switer 的培养基的基础上作了一些改进， 创造了 KM2培养基。2000 年 版兽医生物制品制造及检验规程中提出以脑心浸粉和 PPLO 肉汤为主要原料的猪肺炎支原 体培养基。2006 年农业行业标。
9、准中提出猪支原体肺炎的病原分离用 A26 培养基。但现有技 术的共同缺点是， 猪肺炎支原体在培养基中的生长速度较慢， 同时活菌滴度在 107 108CCU 左右， 活菌滴度低， 不够理想。 发明内容 0005 本发明的目的在于提供一种营养成分丰富、 渗透压适合猪肺炎支原体生长， 且生 长快、 活菌滴度高的猪肺炎支原体培养基， 按照该培养基培养的猪肺炎支原体生长速度快、 活菌滴度高， 分离的敏感性强， 可用于猪肺炎支原体生化特征、 遗传、 免疫等方面的研究。 0006 本发明另一目的是提供该猪肺炎支原体培养基的制备方法。 0007 本发明的目的是通过如下技术方案实现的 ： 0008 本发明的提供。
10、一种猪肺炎支原体培养基， 该培养基主要由 A 液和 B 液和 C 液和 / 或琼脂组成 ； A液由脑心浸出液、 PPLO肉汤、 去离子水组成 ； B液由10Hank s液、 乳清蛋白 水解物、 酵母浸出液、 丙酮酸钠、 示蛋白胨、 硫代硫酸钠、 0.1酚红、 青霉素、 去离子水组成 ； C 液为健康马血清。 0009 其中， 上述成分的配比如下 ： A液 ： 脑心浸出液2.05.0g、 PPLO肉汤1.55.0g、 去离子水 200 300ml ； B 液 ： 10Hank s 液 1.0 5.0ml、 乳清蛋白水解物 1.0 3.0g、 酵母浸出液 3.0 5.0g、 丙酮酸钠 0.8 2.。
11、5g、 示蛋白胨 1.0 3.0g、 硫代硫酸钠 0.1 0.5g、 0.1酚红1020ml、 青霉素200400u/ml、 去离子水500600ml ； C液 ： 健康马血 清 140 200ml ； 琼脂 7.0 10g。 说 明 书 CN 102154167 A CN 102154168 A2/6 页 4 0010 进一步， 上述成分的配比如下 ： A 液 ： 脑心浸出液 4.5g、 PPLO 肉汤 4.0g、 去离子 水 260ml ； B 液 ： 10Hank s 液 3.0ml、 乳清蛋白水解物 1.25g、 酵母浸出液 4.5g、 丙酮酸 钠 1.0g、 示蛋白胨 1.5g、 硫。
12、代硫酸钠 0.135g、 0.1酚红 17ml、 青霉素 200u/ml、 去离子水 560ml ； C 液 ： 健康马血清 160ml ； 琼脂 10g。 0011 本发明还提供了该猪肺炎支原体培养基的制备方法， 其特征在于制备步骤如下 ： 0012 按配比称取 A 液各成分， 将各成分混合， 搅拌， 使之完全溶解， 116高压灭菌 20 分钟， 冷却后备用 ； 0013 按配比称取B液各成分， 将各成分混合， 搅拌， 使之完全溶解， 用0.22m滤膜过 滤除菌， 4保存备用 ； 0014 按配比称取 C 液成分， 将 A 液、 B 液和 C 液充分混合均匀， 用 1mol/L 氢氧化钠溶 。
13、液调整 pH 至 7.6 7.8， 即得猪肺炎支原体的液体培养基。 0015 进一步， 该猪肺炎支原体培养基的制备方法中还可包括如下步骤 ： 按配比称取琼 脂， 加入步骤制得的培养基中， 混合均匀， 从而得到猪肺炎支原体的固体培养基。 0016 本发明的猪肺炎支原体培养基运用微生物学、 有机、 无机分析化学的技术原理， 对 不同的碳源、 氮源、 无机盐、 蛋白质和胆固醇等诸多营养组分的组合进行了筛选， 对培养基 的 pH 值、 渗透压、 离子强度等进行了比较， 研究出了适合猪肺炎支原体快速生长的培养基。 该培养基的配方中除基本成分外， 在培养基中还添加了硫代硫酸钠、 丙酮酸钠， 上述成分 的添。
14、加能明显提高猪肺炎支原体的的活菌滴度 (CCU) ； 对猪肺炎支原体分离的敏感性强 ； 未添加前活菌滴度为 1107CCU/ml 1108CCU/ml， 添加后活菌滴度为 1108CCU/ml 11010CCU/ml ； 活菌滴度和分离的敏感性均远远高于现有技术的培养基。 0017 通过下列实施例将更具体的说明本发明， 但是应理解所述实施例仅是为了说明本 发明， 而不是以任何方式限制本发明的范围。 具体实施方式 0018 实施例 1 本发明培养基的制备 0019 液体培养基 ： 0020 A 液 ： 脑心浸出液 2.0g、 PPLO 肉汤 5.0g、 去离子水 300ml 0021 以上各成分。
15、混合， 搅拌， 使之完全溶解， 116高压灭菌 20 分钟， 冷却后备用 ； 0022 B 液 ： 10Hank s 液 5.0ml、 乳清蛋白水解物 1.0g、 酵母浸出液 5.0g、 丙酮酸钠 0.8g、 示蛋白胨 3.0g、 硫代硫酸钠 0.1g、 0.1酚红 10ml、 青霉素 400U/ml、 去离子水 545ml 0023 以上各成分混合， 搅拌， 使之完全溶解， 用 0.22m 滤膜过滤除菌， 4保存备用 ； 0024 C 液 ： 健康马血清 140ml 0025 将 A 液、 B 液和 C 液充分混合均匀， 1mol/L 氢氧化钠溶液调整 pH 至 7.6， 制得猪肺 炎支原体。
16、液体培养基。 0026 固体培养基 ： 0027 在 1000ml 液体培养基的基础上添加 ： 琼脂 8.0g 0028 实施例 2 本发明培养基的制备 0029 液体培养基 ： 0030 A 液 ： 脑心浸出液 4.5g、 PPLO 肉汤 4.0g、 去离子水 260ml 说 明 书 CN 102154167 A CN 102154168 A3/6 页 5 0031 以上各成分混合， 搅拌， 使之完全溶解， 116高压灭菌 20 分钟， 冷却后备用 ； 0032 B 液 ： 10Hank s 液 3.0ml、 乳清蛋白水解物 1.25g、 酵母浸出液 4.5g、 丙酮酸钠 1.0g、 示蛋白。
17、胨1.5g、 硫代硫酸钠0.135g、 0.1酚红17ml、 青霉素200U/ml、 去离子水560ml 0033 以上各成分混合， 搅拌， 使之完全溶解， 用 0.22m 滤器过滤除菌， 4保存备用 ； 0034 C 液 ： 健康马血清 160ml 0035 将 A 液、 B 液和 C 液充分混合均匀， 1mol/L 氢氧化钠调整 pH 至 7.8， 制得猪肺炎支 原体液体培养基。 0036 固体培养基 ： 0037 在 1000ml 液体培养基的基础上添加 ： 琼脂 10g 0038 实施例 3 本发明培养基的制备 0039 液体培养基 ： 0040 A 液 ： 脑心浸出液 5.0g、 P。
18、PLO 肉汤 1.5g、 去离子水 200ml 0041 以上各成分混合， 搅拌， 使之完全溶解， 116高压灭菌 20 分钟， 冷却后置 4保存 备用 ； 0042 B 液 ： 10Hank s 液 1.0ml、 乳清蛋白水解物 3.0g、 酵母浸出液 3.0g、 丙酮酸钠 2.5g、 示蛋白胨 1.0g、 硫代硫酸钠 0.5g、 0.1酚红 20ml、 青霉素 200U/ml、 去离子水 579ml 0043 以上各成分混合， 搅拌， 使之完全溶解， 用 0.22m 滤膜过滤除菌， 4保存备用 ； 0044 C 液 ： 健康马血清 200ml 0045 将 A 液、 B 液和 C 液充分混。
19、合均匀， 1mol/L 氢氧化钠溶液调整 pH 至 7.7， 制得猪肺 炎支原体液体培养基。 0046 固体培养基 ： 0047 在 1000ml 液体培养基的基础上添加 ： 琼脂 7.0g 0048 实施例 4 本发明猪肺炎支原体培养基与现有技术中几种培养基的比较试验 0049 1 本发明培养基与现有技术中几种培养基活菌滴度比较试验 0050 1.1Mhp 菌株和培养条件将购自中国兽医药品监察的猪肺炎支原体 CVCC355 济南 系 Z 株、 ATCC 引进猪肺炎支原体 25934J 株和自行分离鉴定的猪肺炎支原体 DJ-166 株分 别接种本发明的猪肺炎支原体培养基和现有技术的 3 种培养。
20、基， 种子继代复壮后， 分别按 10 (V/V) 的比例接种， 37培养， 当培养基的颜色变黄、 pH 由 7.6 降至 6.8 6.9 时， 无 菌取出培养物。 0051 1.2 活菌滴度 (CCU) 测定每个菌株取 12 只无菌试管， 每管装 4.5ml 含猪肺炎支原 体培养基， 在第 1 管加入 0.5ml 生长良好的培养物， 混合均匀后， 吸取 0.5ml 加入第 2 根管， 如此进行 10 倍系列稀释至最末 1 管， 同时设未加菌液的猪肺炎支原体培养基作为阴性对 照。试验管设三个重复。之后， 将试管放置 37恒温箱中静止培养， 每日观察 1 次， 主要观 察培养基的颜色变化和浑浊度，。
21、 连续观察时间为 14 日， 最后发生颜色变化的小管稀释度即 为该培养物的 CCU 滴度。此试验共进行了 3 次。 0052 2 结果 0053 2.1 猪肺炎支原体 Z 株接种 4 种培养基 3 次生长试验 CCU( 颜色变化单位 ) 测定结 果见表 1。 0054 表 1 猪肺炎支原体 Z 株接种 4 种培养基 3 次生长试验 CCU 测定结果 说 明 书 CN 102154167 A CN 102154168 A4/6 页 6 0055 0056 2.2 猪肺炎支原体 J 株接种 4 种培养基 3 次生长试验 CCU( 颜色变化单位 ) 测定结 果见表 2。 0057 表 2 猪肺炎支原。
22、体 J 株接种 4 种培养基 3 次生长试验 CCU 测定结果 0058 0059 2.3 猪肺炎支原体 DJ-166 株接种 4 种培养基 3 次生长试验 CCU( 颜色变化单位 ) 测定结果见表 3。 0060 表 3 猪肺炎支原体 DJ-166 株接种 4 种培养基 3 次生长试验 CCU 测定结果 说 明 书 CN 102154167 A CN 102154168 A5/6 页 7 0061 0062 从猪肺炎支原体不同菌株使用本发明制备的培养基同现有技术中的 3 种培养基 的活菌滴度 (CCU) 测定结果来看， 在同样的试验条件下， 本发明的猪肺炎支原体培养基不 同菌株 3 次试验 。
23、CCU 测定结果均在 109以上 ； 而现有技术 3 种培养基 3 次试验 CCU 测定结 果均为 107 108。说明本发明的猪肺炎支原体培养基具有生长迅速， 活菌滴度高的特点。 0063 实施例 5 本发明培养基与现有技术中几种培养基猪肺炎支原体分离的敏感性试 验 0064 本发明所提供的猪肺炎支原体培养基同现有技术中的几种培养基进行了猪肺炎 支原体分离的敏感性试验， 在同样条件下， 对已知为猪肺炎支原体阳性的 20 份猪肺脏病料 进行了分离。首先将猪肺炎支原体阳性病料剪成芝麻大的颗粒， 放入本发明的培养基和现 有技术的3种培养基中(所有培养基里均含青霉素和醋酸铊)， 每管分别放入10粒，。
24、 置37 培养， 每天观察培养基 pH 变化， 观察至 3 周。以培养基颜色发生改变来判定猪肺炎支原体 的生长情况。结果见表 4。 0065 表 44 种培养基猪肺炎支原体的检出率结果 0066 0067 从猪肺炎支原体检出率结果来看， 本发明的猪肺炎支原体培养基从 20 份病料中 猪肺炎支原体检出率为 35 ； 现有技术培养基中， A1 培养基猪肺炎支原体检出率为 25 ； 说 明 书 CN 102154167 A CN 102154168 A6/6 页 8 A2 培养基猪肺炎支原体检出率为 25； A3 培养基猪肺炎支原体检出率为 20； 本发明的猪 肺炎支原体培养基从检出率结果来看均高于现有技术的几种猪肺炎支原体培养基。 0068 从猪肺炎支原体 CCU 测定结果和病料检出率来看， 本发明的猪肺炎支原体培养基 均高于现有技术的几种猪肺炎支原体培养基。试验说明， 本发明猪肺炎支原体培养基具有 更广泛的使用性， 其既适合科学研发， 又适合大规模的生产。 说 明 书 CN 102154167 A 。