《一种脂肪酶的高效生产方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种脂肪酶的高效生产方法.pdf（8页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)申请公布号 CN 102250855 A (43)申请公布日 2011.11.23 CN 102250855 A *CN102250855A* (21)申请号 201110222763.7 (22)申请日 2011.08.04 C12N 9/20(2006.01) C12R 1/84(2006.01) (71)申请人 江南大学 地址 214122 江苏省无锡市蠡湖大道 1800 号 (72)发明人 徐岩 喻晓蔚 穆晓清 (74)专利代理机构 北京汇信合知识产权代理有 限公司 11335 代理人 王秀丽 (54) 发明名称 一种脂肪酶的高效生产方法 (57) 摘要 本发明公开一种脂肪酶的。
2、高效生产方法， 发 酵阶段采用了两段式溶氧控制策略， 实现脂肪酶 的高效表达， 降低后续提取的难度 ； 分离提取阶 段通过过料液循环与渗透液循环实现发酵与提取 的偶联。应用本本发明使得酶不断被实时的分离 和浓缩富集， 减少了发酵罐中酶表达的同时被蛋 白酶降解的程度， 提取酶活得率可达 85以上， 菌落总数小于 10CFU/ml， 大肠菌群小于 3， 酵母与 霉菌小于 10CFU/ml， 致病菌 ( 沙门氏菌、 志贺氏 菌、 金黄色葡萄球菌、 溶血性链球菌 ) 未检出。通 过渗透液循环可大幅减少了用水量和废水产生 量， 节能减排。 本方法实现了脂肪酶的高效清洁生 产， 具有广阔的应用前景。 (5。
3、1)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 1 页 CN 102250857 A1/1 页 2 1. 一种脂肪酶的高效生产方法， 其特征在于将脂肪酶的高密度发酵生产与分离提取相 耦合， 所述提取步骤包括陶瓷膜微滤及超滤膜超滤。 2. 权利要求 1 所述的方法， 其特征在于所述高密度发酵生产采用溶氧两段式控制策 略， 具体为 ： 甲醇诱导相启动后， 溶氧控制于 40 50， 菌体浓度 DCW 达到 100 110g/L 后， 溶氧控制于 10 20。 3. 权利要求 1 所述的方法， 其特征在于所述耦合通过料液循环与渗。
4、透液循环实现。 4. 权利要求 3 所述的方法， 其特征在于所述料液循环与渗透液循的工艺条件为 ： 启动 料液循环与渗透液循环后， 当残料液酶活低于初始发酵液酶活的 10 -20时结束发酵， 撤去渗透液的循环， 对发酵液进行陶瓷膜微滤浓缩 ； 当膜通量从拟稳态转为下降至 50时 停止陶瓷膜微滤操作， 最后超滤浓缩至总蛋白浓度约 20-24g/L， 实现发酵与提取的耦合。 5. 权利要求 1 或 4 所述的方法， 其特征在于所述陶瓷膜微滤工艺参数为 ： 膜截留分子 量 800kDa、 膜操作压力 0.25MPa、 温度 20-28、 湿菌体含量 30-40。 6. 权利要求 1 或 4 所述的方。
5、法， 其特征在于所述超滤膜工艺参数为 ： 膜截留分子量 10-30kDa、 膜操作压力 0.5MPa、 温度 20-26、 浓缩总蛋白质浓度为 20-25g/L。 7. 权利要求 1 所述的方法， 其特征在于所述发酵罐与陶瓷膜之间设置一个缓冲储罐用 于控制料液循环的速度。 权 利 要 求 书 CN 102250855 A CN 102250857 A1/5 页 3 一种脂肪酶的高效生产方法 技术领域 0001 本发明涉及一种脂肪酶的生产方法， 是一种高密度发酵与高效分离耦合的清洁生 产方法。 背景技术 0002 在脂肪酶下游提取分离上， 实验室规模提取常用絮凝离心处理， 然后膜超滤 进一步除菌。
6、， 这种方法的酶活回收率较低， 而且只适合小规模处理， 不易于工业放大。工业 大规模的脂肪酶提取常用板框压滤除菌 ( 图 1)， 因为发酵液菌体浓度高， 粘度较大， 而且发 酵液板框处理时间较长， 且发酵液放罐后放置过程中， 衰亡菌体数量不断增加、 粘度不断增 大， 除菌难度很大， 甚至无法进行。 由于板框压滤过程中滤饼的可压缩性， 使过滤阻力增大， 液体透过性差， 工业上应用助滤剂来解决这个问题， 菌体难以分离回收利用。板框设备系 统昂贵， 占用空间大， 能耗高， 手动操作， 需要配备的工人多， 用水量大， 繁琐的滤布清洗、 安 装， 废渣废水产生量大， 且难以回收利用。 板框压滤一般分为明。
7、滤、 暗滤两种方式， 暗滤方式 难预防料液泄露， 明滤的滤出液处于开放环境中， 容易发生交叉污染， 难以满足微生物限量 要求严格的食品和医药级生物制品的生产要求。 0003 毕赤酵母重组菌的发酵目前的发酵方式为补料分批发酵， 中后期菌体达到很高的 密度、 粘度很大。发酵、 除菌、 超滤浓缩操作单元离散化， 产量的进一步提高存在着瓶颈效 应， 毕赤酵母诱导表达相较长， 发酵中后期酶活达到了较高水平， 但酶不断产生的过程中也 同时存在着酶的不断降解和酶在发酵过程的稳定性问题。 放罐后发酵液在预滤储罐待滤过 程中， 菌体处于缺氧和营养匮乏状态， 菌体衰亡加速， 发酵液则变得越来越粘稠， 给下游处 理。
8、带来了很大的困难。 发明内容 0004 本发明所要解决的技术问题是提供一种脂肪酶高效生产方法， 包括耦合的脂肪酶 高密度发酵表达与膜提取步骤， 实现脂肪酶的高效表达、 高效分离与高提取得率的清洁生 产。 0005 具体步骤如下 ： 如图 2 所示。在甲醇诱导表达阶段， 采用溶氧两段式控制策略， 甲 醇流加启动后， 控制溶氧为初始溶氧值 40 50， 当菌体浓度达到 100 110g/L 后， 适 当限制溶氧于1020， 整个诱导表达过程中， 甲醇浓度维持于0.080.12。 从诱导 相602h后开始进行发酵提取耦合， 不断进行料液循环以及渗透液循环操作， 持续约20 30h。陶瓷膜工艺参数 ：。
9、 膜截留分子量 800kDa、 膜操作压力 0.25MPa、 温度 20 28、 湿菌 体含量 30 40， 耦合启动时， 先往陶瓷膜储罐中加约为原发酵液体积三分之一至五分 之一的水， 然后启动耦合陶瓷膜微滤、 膜超滤等。超滤膜的工艺条件 ： 膜截留分子量 10 30kDa、 膜操作压力 0.5MPa、 温度 20 26、 浓缩倍数以总蛋白质浓度为控制指标， 约为 20 24g/L。 0006 所述发酵罐与陶瓷膜之间设置一个缓冲储罐用于控制料液的循环速度。 说 明 书 CN 102250855 A CN 102250857 A2/5 页 4 0007 脂肪酶酶活测定 ： 橄榄油法， 参照中华人。
10、民共和国国家标准 GB/T23535-2009。 0008 湿菌体含量测定 ： 料液固形物含量是陶瓷膜微滤工艺控制的一个重要指标， 为了 方便检测与调控， 本发明以湿菌体含量为控制指标， 即取10ml发酵液， 6000rpm离心10min， 弃上清液， 离心管倒置于滤纸上数分钟， 称重， 再折算成 100ml 发酵液的菌体湿重， 以重量 体积百分比表示。 0009 膜通量测定 ： 用量筒测量滤出液， 同时秒表计时， 按以下公式计算膜通量 ： 0010 J V/St， 式中 J 为膜通量 (L/m2h)、 V 为透过液体积 (L)、 S 为有效膜面积 (m2)、 t 为微滤时间 (h)。通常以膜。
11、衰减曲线和膜拟稳态通量来评价过滤效果， 微滤启动后， 膜通 量迅速衰减至某个值后在一段时间内维持拟稳定状态， 这时的膜通量称为膜拟稳态通量。 0011 粘度 ： 利用 NDJ-1B 旋转粘度计进行测量。 0012 总蛋白浓度 ： 考马斯亮蓝法。 0013 微生物的检测 ： 根据中华人民共和国国家标准 GB4789.2-2010、 GB4789.3-2010、 GB4789.15-2010 检验菌落总数、 大肠菌群数量、 霉菌和酵母菌落数。致病菌 ( 沙门氏菌、 志贺氏菌、 金黄色葡萄球菌、 溶血性链球菌 ) 则按照 GB4789.4-2010、 GB/T4789.5-2003、 GB4789.。
12、10-2010、 GB/T4789.11-2003 标准进行检验。 0014 诱导阶段， 溶氧分段控制， 以100110g/L菌体浓度为控制点， 前阶段给予较高溶 氧是为了让菌体尽快长至高密度， 后阶段控制较低溶氧， 并在较低溶氧的条件下优化得到 最佳的其他工艺条件， 既能使较高的产物比生成率维持较长的时间， 也能使终菌体浓度控 制于适当水平， 改善发酵液的粘度， 降低下游提取的难度， 另外， 较低的溶氧工艺条件， 在工 业生产上容易实现， 使生产工艺容易放大到产业规模。 0015 陶瓷膜的应用弥补了板框的不足。 陶瓷膜微滤是以压力差为推动力的分子筛膜分 离过程， 在生化制药、 果汁饮料、 乳。
13、制品、 精细化工、 污水处理、 工业 / 民用 / 饮用水领域， 得 到了广泛的应用， 在除菌方面也得到了广泛的推广。 陶瓷膜可以除去几乎所有的微生物。 升 或吨级规模化的陶瓷膜微滤技术在毕赤酵母除菌中的应用还未见报道。 0016 本发明创新性地在诱导阶段采用了两段式溶氧控制策略， 实现脂肪酶的高效表 达， 降低后续提取的难度， 便于工业化放大 ； 建立了发酵罐、 陶瓷膜和超滤膜三者耦合的生 产方式， 工艺路线流程如图 2 所示， 使得酶不断被实时的分离和浓缩富集， 减少了发酵罐中 酶表达的同时被蛋白酶降解的程度， 提高了总产量。 在发酵罐与陶瓷膜之间设置缓冲储罐， 易于控制料液的循环速度， 。
14、也便于添加消泡剂， 减少料液的气含量， 避免陶瓷膜供料泵与内 循环泵的空转或泵功率减弱， 提高了料液也膜的有效接触面积和料液循环效率。渗透液循 环 ： 减少了培养基成分的流失， 维持发酵体系中水、 培养基成分、 微量元素含量等的稳定， 也 大幅减少了用水量和废水产生量， 节能减排。另外， 渗透液循环的同时不断回收流失的酶， 提高了提取得率。在发酵表达阶段连续流加甲醇， 使得耦合系统中循环液也保持一定浓度 的甲醇， 利用甲醇对杂菌的抑制作用， 保证了膜滤液的高度无菌状态。 附图说明 0017 图 1 板框压滤工艺流程图 ； 0018 图 2 脂肪酶清洁生产工艺流程图。 说 明 书 CN 1022。
15、50855 A CN 102250857 A3/5 页 5 具体实施方式 0019 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明， 均为常规方法。 0020 下述实施例中所用的材料、 试剂等， 如无特殊说明， 均可从商业途径得到。 0021 生物材料的获得 ： 0022 本发明以含有华根霉 (Rhizopus chinensis)CCTCC No.M201021 脂肪酶基因的 重组酵母菌株 GS115/pPIC9K-proRCL 为生产菌株。生产菌株 GS115/pPIC9K-proRCL 已 在 Xiao-Wei Yu， Le-Le Wang， Yan Xu.Rhizopus chinensis。
16、 lipase ： gene cloning， expression in Pichia pastoris and properties.(2009)Journal of Molecular Catalysis B ： Enzymatic 57 ： 304-311 中公开。 0023 实施例 1 脂肪酶的生产方法 0024 取菌种甘油保存管， 吸 200m 接到 YPD 培养基中， 摇床 30培养 18 小时左右， 当 种子液 OD600达 2 5 后， 完成摇瓶种子液的制备。然后转入 5L 发酵罐 BSM 基础盐培养基 继续进行种子培养， 当菌体湿重 (DCW) 达到 23g/L 左右， 移。
17、种至 50L 发酵罐中进行培养， 各 级接种量皆为 10。 0025 50L 罐发酵， 起始装液量为 18L， 在 30、 pH5.5、 溶氧 50 80条件下进行甘油 生长相培养。当基础培养基中甘油消耗完， 溶氧值大幅度上升， 然后进入过渡相， 流加 50 甘油 ( 含 12mL/L PTM1)， 使菌体浓度长至 35 39g/L， 停止甘油补加， 饥饿 0.5h， 然后进入 诱导相， 进行甲醇 ( 每 Kg 甲醇含 30ml PTM1) 流加， 温度控制于 26 28。在甲醇诱导表 达阶段， 采用溶氧两段式控制策略， 甲醇流加启动后， 控制溶氧为初始溶氧值 40 50， 当菌体浓度达到 1。
18、00 110g/L， 适当限制溶氧于 10 20， 整个诱导表达过程中， 甲醇 浓度维持于 0.08 0.12。诱导 60h 后， 启动耦合操作， 如图 2 所示不断进行料液循环以 及渗透液循环， 持续约 20h。耦合启动时， 先往陶瓷膜储罐中加约为原发酵液体积三分之一 的水， 然后启动耦合陶瓷膜微滤、 膜超滤。当残料液酶活低于初始发酵液酶活的 10 -20 时， 发酵结束， 撤去超滤渗透液的循环， 对发酵液进行微滤浓缩， 当膜通量由拟稳态转为下 降至 50时停止陶瓷膜微滤操作， 最后超滤浓缩至总蛋白浓度约 20 25g/L， 停止操作。 0026 陶瓷膜微滤工艺参数 ： 膜面积为 0.11m。
19、2、 膜截留分子量 800kDa、 膜操作压力 0.25MPa、 温度 20 28、 湿菌体含量 30 40。有机卷式超滤工艺条件 ： 膜截留分子 量1030kDa、 膜操作压力0.5MPa、 温度2026、 浓缩倍数以总蛋白质浓度为控制指标， 约为 20 24g/L。 0027 涉及的培养基 ： 0028 YPD ： 蛋白粉 20g/L， 酵母粉 10g/L， 葡萄糖 20g/L 0029 BSM ： CaSO4(cp)1.1g/L， K2SO4(AR)18.2g/L， 无水硫酸镁 (AR)7.27g/L， KOH(AR)4.128g/L， 甘油 40g/L， 85 H3PO426.7ml/。
20、L 0030 PTM1 ： 五水硫酸铜 6g/L， 碘化钾 0.089g/L， 一水硫酸猛 3.0g/L， 钼酸钠 0.2g/L， 硼 酸0.02g/L， 七水硫酸锌42.2g/L， 七水硫酸亚铁65g/L， 生物素0.2g/L， 六水氯化钴0.5g/L， 硫酸 5ml/L。 0031 结果分析 ： 0032 生产水平 ： 发酵液终体积 40L， 菌体干重 DCW 为 180g/L， 最高单位酶活 26,000U/ ml， 产物对菌体得率 69.333U/gDCW， 比活力为 2.730106U/g， 提取酶活得率 82.17。 说 明 书 CN 102250855 A CN 10225085。
21、7 A4/5 页 6 0033 除菌效果 ： 菌落总数小于 10CFU/ml， 大肠菌群小于 3， 酵母与霉菌小于 10CFU/ml， 致病菌 ( 沙门氏菌、 志贺氏菌、 金黄色葡萄球菌、 溶血性链球菌 ) 未检出。 0034 水用量与废水产生量 ： 水用量约176L， 清洗用水约占88， 废水产生量约182L。 本 发明渗透液循环， 节约了陶瓷膜独立单元操作中常规需要的 3 5 倍发酵液体积的洗滤用 水， 即减少了 115 190L 用水及废水产生量。 0035 实施例 2 脂肪酶的生产方法 0036 涉及的培养基同实施例 1 0037 实施方法 0038 用 YPD 培养基培养一级、 二级。
22、摇瓶种子液， 在火焰保护下接种种子罐， 种子罐的培 养基为基础培养基 BSM。培养条件为 30， pH5.5， 溶氧 30 80。11 14h 后， 种子罐 中的菌体浓度长至 23g/L 左右， 移种至 3m3发酵罐， 各级接种量皆为 10。 0039 3KL 罐发酵， 起始装液量为 1KL， 生长相培养条件 ： 30， pH5.5， 溶氧 30 80， 用氨水来控制 pH， 当甘油耗尽， 溶氧激剧上升时， 甘油生长相结束， 进入甘油过渡相， 流加 50甘油， 同时按每升 50甘油添加 12ml PTM1 的比例流加离子液， 使菌体浓度长至 35 39g/L， 停止补料， 饥饿 0.5h， 进。
23、行甲醇流加， 并按 30ml 每 Kg 甲醇进行 PTM1 的流加， 温度控 制于 26 28。在甲醇诱导表达阶段， 采用溶氧两段式控制策略， 甲醇流加启动后， 控制 溶氧为初始溶氧值 40 50， 当菌体浓度达到 100 110g/L， 适当限制溶氧于 10 20， 整个诱导表达过程中， 甲醇浓度维持于 0.08 0.12。诱导 60h 后， 启动耦合操作， 如图 2 所示不断进行料液循环以及渗透液循环， 持续约 20h。耦合启动时， 先往陶瓷膜储罐 中加约为原发酵液体积四分之一水， 然后启动耦合陶瓷膜微滤、 膜超滤。 当残料液酶活低于 初始发酵液酶活的 10 -20时， 发酵结束， 撤去超。
24、滤渗透液的循环， 对发酵液进行微滤浓 缩， 当膜通量由拟稳态转为下降至 50时停止陶瓷膜微滤操作， 最后超滤浓缩至总蛋白浓 度约 20 25g/L， 停止操作。 0040 陶瓷膜微滤工艺参数 ： 膜面积 6.66m2， 其他参数同实施例 1。有机卷式超滤工艺条 件 ： 膜面积 25m2， 其他条件同实施例 1。 0041 结果分析 ： 0042 生产水平 ： 发酵液终体积 1.75KL， 菌体干重 DCW 为 146g/L， 最高单位酶活 20,500U/ml， 产物对菌体得率 81,4384U/gDCW， 比活力为 2.910106U/g， 提取酶活得率 85.24。 0043 除菌效果 ：。
25、 菌落总数小于 10CFU/ml， 大肠菌群小于 3， 酵母与霉菌小于 10CFU/ml， 致病菌 ( 沙门氏菌、 志贺氏菌、 金黄色葡萄球菌、 溶血性链球菌 ) 未检出。 0044 水用量与废水产生量 ： 水用量约 6.32 吨， 清洗用水约占 83， 废水产生量约 6.5 吨。本发明渗透液循环， 节约了陶瓷膜独立单元操作中常规需要的 3 5 倍发酵液体积的 洗滤用水， 即减少了 5.1 8.5 吨用水及废水产生量。 0045 实施例 3 脂肪酶的高密度发酵与高效分离提取耦合生产方法 0046 涉及的培养基同实施例 1 0047 实施方法 0048 经过 500ml 和 5LYPD 培养基摇。
26、瓶培养， 300L YPD 培养基种子罐、 3KL BSM 培养基种 子罐二级种子培养， 最后移种至 30KL 罐进行发酵进行发酵生产， 各级接种量皆为 10。 说 明 书 CN 102250855 A CN 102250857 A5/5 页 7 0049 30KL 罐发酵， 起始装液量为 10KL， 生长相培养条件 ： 30， pH5.5， 溶氧 30 80， 用氨水来控制 pH， 当甘油耗尽， 溶氧激剧上升时， 甘油生长相结束， 进入甘油过渡相， 流加 50甘油， 同时按每升 50甘油添加 12ml PTM1 的比例流加离子液， 使菌体浓度长至 3539g/L， 停止补料， 饥饿0.5h，。
27、 进行甲醇流加， 并按30ml每Kg甲醇进行PTM1的流加， 温 度控制于2628。 在甲醇诱导表达阶段， 采用溶氧两段式控制策略， 甲醇流加启动后， 控 制溶氧为初始溶氧值 40 50， 当菌体浓度达到 100 110g/L， 适当限制溶氧于 10 20， 整个诱导表达过程中， 甲醇浓度维持于0.080.12。 诱导60h后， 启动耦合操作， 如图 2 所示不断进行料液循环以及渗透液循环， 持续约 20h。耦合启动时， 先往陶瓷膜储罐 中加约为原发酵液体积四分之一水， 然后启动耦合陶瓷膜微滤、 膜超滤。 当残料液酶活低于 初始发酵液酶活的 10 -20时， 发酵结束， 撤去超滤渗透液的循环，。
28、 对发酵液进行微滤浓 缩， 当膜通量由拟稳态转为明显下降时停止陶瓷膜微滤操作， 最后超滤浓缩至总蛋白浓度 约 20 24g/L， 停止操作。 0050 陶瓷膜微滤工艺参数 ： 膜面积 140m2， 其他参数同实施例 1。有机卷式超滤工艺条 件 ： 膜面积 225m2， 其他条件同实施例 1。 0051 结果分析 ： 0052 生产水平 ： 发酵液终体积 17.3KL， 菌体干重 DCW 为 134g/L， 最高单位酶活 17,300U/ml， 产物对菌体得率 80,045U/gDCW， 比活力为 2.830106U/g， 提取酶活得率 86.07。 0053 除菌效果 ： 菌落总数小于 10C。
29、FU/ml， 大肠菌群小于 3， 酵母与霉菌小于 10CFU/ml， 致病菌 ( 沙门氏菌、 志贺氏菌、 金黄色葡萄球菌、 溶血性链球菌 ) 未检出。 0054 水用量与废水产生量 ： 水用量约 80 吨， 清洗用水约占 86， 废水产生量约 83 吨。 本发明渗透液循环， 节约了陶瓷膜独立单元操作中常规需要的 3 5 倍发酵液体积的洗滤 用水， 即减少了 49 83 吨用水及废水产生量。 0055 虽然本发明已以较佳实施例公开如上， 但其并非用以限定本发明， 任何熟悉此技 术的人， 在不脱离本发明的精神和范围内， 都可做各种的改动与修饰， 因此本发明的保护范 围应该以权利要求书所界定的为准。 说 明 书 CN 102250855 A CN 102250857 A1/1 页 8 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102250855 A 。