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1、(10)申请公布号 CN 102250831 A (43)申请公布日 2011.11.23 CN 102250831 A *CN102250831A* (21)申请号 201110194207.3 (22)申请日 2011.07.12 C12N 5/071(2010.01) (71)申请人 中国农业大学 地址 100193 北京市海淀区圆明园西路 2 号 (72)发明人 李向东 李冬冬 孙婧 (74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 代理人 关畅 (54) 发明名称 一种提高牛腔前卵泡体外发育的培养基及其 应用 (57) 摘要 本发明公开了一种提高牛腔前卵泡体外发育 的。
2、培养基及其应用。本发明提供制备促进离体哺 乳动物腔前卵泡体外发育的培养基的方法， 为将 胰岛素、 转铁蛋白、 亚硒酸钠、 丙酮酸钠、 谷氨酰 胺、 次黄嘌呤、 血清、 促卵泡素、 促黄体素、 雌激素、 PTEN 抑制剂和 -MEM 培养基混合， 得到培养基。 本发明的实验证明， 本发明首先从卵巢皮质分离 牛腔前卵泡， 随后将获取的卵泡在本发明提供的 培养基和对照培养基中进行体外培养， 观察其直 径增长以及卵泡的成腔率， 结果发现， 本发明提供 的培养基培养得到成腔率和直径增长值均高于对 照， 为进一步挖掘雌性生殖资源提供必要的培养 体系。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识。
3、产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 1 页 CN 102250833 A1/1 页 2 1. 一种制备促进离体哺乳动物腔前卵泡体外发育的培养基的方法， 为将胰岛素、 转铁 蛋白、 亚硒酸钠、 丙酮酸钠、 谷氨酰胺、 次黄嘌呤、 血清、 促卵泡素、 促黄体素、 雌激素、 PTEN 抑 制剂、 水和 -MEM 培养基混合， 得到培养基， 所述胰岛素在所述培养基中的浓度为 5ug/ml， 所述转铁蛋白在所述培养基中的浓度为 5ug/ml， 所述亚硒酸钠在所述培养基中的浓度为 5ng/ml ； 所述丙酮酸钠在所述培养基中的浓度为(0.21-0.29)mmol/l， 。
4、所述谷氨酰胺在所述 培养基中的浓度为 (1.5-2.0)mmol/l， 所述次黄嘌呤在所述培养基中的浓度为 (1.8-2.5) mmol/l， 所述血清在所述培养基中的浓度为5-10(体积百分含量)， 所述促卵泡素在所 述培养基中的浓度为 0.25gml-1-0.5gml-1， 所述促黄体素在所述培养基中的浓度为 5IU ml-1-10IUml-1， 所述雌激素在所述培养基中的浓度为 0.5gml-1-1.0gml-1， 所述 PTEN抑制剂在所述培养基中的浓度为100nmol/L-10mol/L， 所述-MEM培养基在所述培 养基中的浓度为 10.1g/L。 2. 根据权利要求 1 所述的方。
5、法， 其特征在于 ： 所述丙酮酸钠在所述培养基中的浓度为 0.21mmol/l、 0.23mmol/l 或 0.29mmol/l ； 所 述谷氨酰胺在所述培养基中的浓度为 1.5mmol/l、 1.8mmol/l 或 2.0mmol/l， 所述次黄嘌呤 在所述培养基中的浓度为 1.8mmol/l、 2mmol/l 或 2.5mmol/l， 所述血清在所述培养基中 的浓度为 5、 7.5或 10 ( 体积百分含量 )， 所述促卵泡素在所述培养基中的浓度为 0.25gml-1、 0.4gml-1或 0.5gml-1， 所述促黄体素在所述培养基中的浓度为 5IU ml-1、 8IU ml-1或10I。
6、U ml-1， 所述雌激素在所述培养基中的浓度为0.5g ml-1、 0.8g ml-1 或 1.0gml-1， 所述 PTEN 抑制剂在所述培养基中的浓度为 100nmol/L、 1mol/L 或 10mol/L。 3. 根据权利要求 1 或 2 所述的方法， 其特征在于 ： 所述血清为胎牛血清 ； 所述雌激素为雌激素 E2 ； 所述 PTEN 抑制剂为 PTEN 抑制剂 pic。 4. 根据权利要求 1-3 中任一所述的方法， 其特征在于 ： 所述哺乳动物为牛。 5. 权利要求 1-4 中任一所述的方法制备的培养基。 6. 权利要求 5 所述的培养基在促进离体哺乳动物腔前卵泡体外发育中的应。
7、用。 7. 根据权利要求 6 所述的应用， 其特征在于 ： 所述哺乳动物为牛。 8. 根据权利要求 6 或 7 所述的应用， 其特征在于 ： 所述离体哺乳动物腔前卵泡体外发育通过增加卵泡直径和 / 或提高卵泡成腔率体现。 9. 一种体外培养获得有腔卵泡的方法， 包括如下步骤 ： 将离体哺乳动物腔前卵泡在权 利要求 5 所述的培养基中培养， 得到有腔卵泡。 10. 根据权利要求 9 所述的方法， 其特征在于 ： 所述培养的温度为 39， 所述培养在 5 CO2条件下进行， 所述培养的时间为 21 天。 权 利 要 求 书 CN 102250831 A CN 102250833 A1/5 页 3 。
8、一种提高牛腔前卵泡体外发育的培养基及其应用 技术领域 0001 本发明涉及畜牧学 ( 动物繁殖 )， 尤其涉及一种提高牛腔前卵泡体外发育的培养 基及其应用。 背景技术 0002 牛卵巢上有数万个原始卵泡， 在其生长成熟过程中， 有相当数量的卵泡退化、 闭 锁， 仅有极少数的卵泡发育到成熟阶段， 直至排卵。在雌性生殖资源中， 卵母细胞是体外受 精、 胚胎移植、 性别控制、 胚胎分割、 动物克隆和转基因等胚胎生物技术研究和开发必不可 少的材料， 卵母细胞来源匮乏成为制约这些技术研究进展的主要因素， 因此卵巢腔前卵泡 的开发无疑是解决这一难题的有效途径。 0003 与普通的体细胞培养和来自有腔阶段的。
9、卵泡卵母细胞的体外成熟培养比较， 哺乳 动物腔前卵泡的体外培养难度更大。尽管如此， 1989 年 Eppig 等用两步法体外培养小鼠腔 前卵泡， 获得成熟卵母细胞并成功产下正常后代， 自此人们先后在其它动物上开始了腔前 卵泡体外培养的研究。 特别是在牛、 羊、 猪等家畜方面研究较多， 并且在研究内容、 手段和方 法上都取得了一些进展。 但是到目前为止， 仍未建立起一套牛腔前卵泡体外培养的体系。 因 此， 进一步优化和建立牛腔前卵泡体外培养体系显得尤为重要。 发明内容 0004 本发明的一个目的是提供一种制备促进离体哺乳动物腔前卵泡体外发育的培养 基的方法。 0005 本发明提供的方法， 包括如。
10、下步骤 ： 将胰岛素、 转铁蛋白、 亚硒酸钠、 丙酮酸钠、 谷 氨酰胺、 次黄嘌呤、 血清、 促卵泡素、 促黄体素、 雌激素、 PTEN 抑制剂、 水和 -MEM 培养基 混合， 得到培养基， 所述胰岛素在所述培养基中的浓度为 5ug/ml， 所述转铁蛋白在所述培 养基中的浓度为 5ug/ml， 所述亚硒酸钠在所述培养基中的浓度为 5ng/ml ； 所述丙酮酸钠 在所述培养基中的浓度为 (0.21-0.29)mmol/l， 所述谷氨酰胺在所述培养基中的浓度为 (1.5-2.0)mmol/l， 所述次黄嘌呤在所述培养基中的浓度为 (1.8-2.5)mmol/l， 所述血清在 所述培养基中的浓度为。
11、 5 -10 ( 体积百分含量 )， 所述促卵泡素在所述培养基中的浓 度为 0.25gml-1-0.5gml-1， 所述促黄体素在所述培养基中的浓度为 5IU ml-1-10IU ml-1， 所述雌激素在所述培养基中的浓度为 0.5gml-1-1.0gml-1， 所述 PTEN 抑制剂在 所述培养基中的浓度为 100nmol/L-10mol/L， 所述 -MEM 培养基在所述培养基中的浓度 为 10.1g/L。 0006 所述丙酮酸钠在所述培养基中的浓度为 0.21mmol/l、 0.23mmol/l 或 0.29mmol/ l ； 所述谷氨酰胺在所述培养基中的浓度为 1.5mmol/l、 1。
12、.8mmol/l 或 2.0mmol/l， 所述次黄 嘌呤在所述培养基中的浓度为 1.8mmol/l、 2mmol/l 或 2.5mmol/l， 所述血清在所述培养基 中的浓度为 5、 7.5或 10 ( 体积百分含量 )， 所述促卵泡素在所述培养基中的浓度为 0.25gml-1、 0.4gml-1或 0.5gml-1， 所述促黄体素在所述培养基中的浓度为 5IU 说 明 书 CN 102250831 A CN 102250833 A2/5 页 4 ml-1、 8IU ml-1或10IU ml-1， 所述雌激素在所述培养基中的浓度为0.5g ml-1、 0.8g ml-1 或 1.0gml-1。
13、， 所述 PTEN 抑制剂在所述培养基中的浓度为 100nmol/L、 1mol/L 或 10mol/L。 0007 所述血清为胎牛血清 ； 0008 所述雌激素为雌激素 E2 ； 0009 所述 PTEN 抑制剂为 PTEN 抑制剂 pic。 0010 所述哺乳动物为牛。 0011 所述的方法制备的培养基也是本发明保护的范围。 0012 所述的培养基在促进离体哺乳动物腔前卵泡体外发育中的应用。 0013 所述哺乳动物为牛。 0014 所述离体哺乳动物腔前卵泡体外发育通过增加卵泡直径和 / 或提高卵泡成腔率 体现。 0015 所述-MEM培养基可商购， 也可按照如下方法制备 ： 200.00m。
14、g/L氯化钙(无水)、 400.00mg/L 氯化钾、 98.00mg/L 氯化镁 ( 无水 )、 6,800.00mg/L 氯化钠、 140.00mg/L 一水 合磷酸氢二钠、 1,000.00mg/L D- 葡萄糖、 0.20mg/L 硫辛酸、 10.00mg/L 酚红、 110.00mg/L 丙酮酸钠、 25.00mg/L L- 丙氨酸 ； 127.00mg/L L- 精氨酸盐酸盐、 50.00mg/LL- 天冬氨酸一 水合物、 30.00mg/L L- 天冬氨酸、 31.00mg/L L- 胱氨酸二盐酸盐、 100.00mg/L L- 半胱氨 酸盐酸盐一水合物、 75.00mg/L L。
15、- 谷氨酸、 292.00mg/L L- 谷氨酰胺、 50.00mg/L L- 甘氨 酸、 42.00mg/L L- 组氨酸盐酸盐一水合物、 52.00mg/L L- 异亮氨酸、 52.00mg/L L- 亮氨酸、 73.00mg/L L- 赖氨酸盐酸盐、 15.00mg/L L- 甲硫氨酸、 32.00mg/LL- 苯丙氨酸、 40.00mg/L L- 脯氨酸、 25.00mg/L L- 丝氨酸、 48.00mg/L L- 苏氨酸、 10.00mg/L L- 色氨酸、 52.00mg/ L L- 酪氨酸 ( 二钠盐 )、 46.00mg/L L- 缬氨酸、 50.00mg/L L- 抗坏血酸。
16、、 0.10mg/L 生物素、 1.00mg/L泛酸钙、 1.00mg/L氯化胆碱、 1.00mg/L叶酸、 2.00mg/L内消旋肌醇、 1.00mg/L烟酰 胺、 1.00mg/L 盐酸吡哆醛、 0.10mg/L 核黄素、 1.00mg/L 盐酸硫胺、 1.40mg/L 维生素 B12和水 混合， 得到培养基。 0016 本发明的另一个目的是提供一种体外培养获得有腔卵泡的方法的方法。 0017 本发明提供的方法， 包括如下步骤 ： 将离体哺乳动物腔前卵泡在所述的培养基中 培养， 得到有腔卵泡。 0018 所述培养的温度为 39， 所述培养在 5 CO2条件下进行， 所述培养的时间为 21 。
17、天。 0019 本发明的实验证明， 本发明首先从卵巢皮质分离牛腔前卵泡， 随后将获取的卵泡 在本发明提供的培养基和对照培养基中进行体外培养， 观察其直径增长以及卵泡的成腔 率， 结果发现， 本发明提供的培养基培养得到成腔率和直径增长值均高于对照， 为进一步挖 掘雌性生殖资源提供必要的培养体系。通过本发明， 可为研究牛早期腔前卵泡发育的研究 人员提供一套完整有效地体外培养体系， 为进一步研究其卵母细胞体外成熟机制奠定基 础。本发明简捷、 高效、 便于推广。 附图说明 0020 图 1 为不同浓度的 pic 对牛腔前卵泡成腔率的影响 说 明 书 CN 102250831 A CN 10225083。
18、3 A3/5 页 5 具体实施方式 0021 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明， 均为常规方法。 0022 下述实施例中所用的材料、 试剂等， 如无特殊说明， 均可从商业途径得到。 0023 实施例 1、 新的培养体系的获得 0024 1、 腔前卵泡的获取 ： 将屠宰场获取的离体牛卵巢置于 60mm 直径的玻璃平皿中， 去 除多余系膜和黄体， 随后将卵巢沿着卵巢门一切为二， 去除髓质， 在培养基 (M199 培养基， GIBCO， 货号 ： 31100-035) 中清洗 2 次后， 用刀具按照横向和纵向两个方向从卵巢皮质部划 取卵泡， 将获取的卵泡和培养基用滴管吹打， 然后用直径 1m。
19、m 的吸管吹打 80 l00 次， 经 200m 网筛过滤， 再用直径 0.5mm 吸管吹打 80-l00 次， 用 100m 网筛过滤， 以 1500r/min 离心 5min， 除去上清液， 其沉淀加入分离液稀释悬浮， 体视显微镜下镜检卵泡、 计数并测量 直径 ； 0025 结果为卵泡数为每个卵巢 120-140 枚腔前卵泡， 卵泡直径为 60-80um。 0026 2、 腔前卵泡体外培养体系的建立 ： 0027 1) 培养基配制 0028 培养基 1 ： 将 ITS(ITS 固体规格为 25mg 胰岛素、 25mg 转铁蛋白、 25ug 亚硒酸钠， 购自 Sigma， 货号 ： I188。
20、4 ； 使用时用水稀释到终浓度为 5ug/ml 胰岛素、 终浓度 5ug/ml 转铁 蛋白、 终浓度 5ng/ml 亚硒酸钠 )、 丙酮酸钠 (Sigma， 货号 ： P4562)、 谷氨酰胺 (Sigma， 货号 ： G3126)、 次黄嘌呤 (Sigma， 货号 ： H9636)、 胎牛血清 (GIBCO， 货号 ： 16000)、 促卵泡素 (FSH， Sigma， 货号 ： F2293)、 促黄体素(LH， Sigma， 货号 ： L9773)、 雌激素E2(Sigma， E2257)、 PTEN抑 制剂 Pic( 抑癌基因 PTEN 的抑制剂， ALEXIS， L22757)、 水和。
21、 -MEM 培养基 (GIBCO， 12000) 混合， 得到培养基， 胰岛素在所述培养基中的浓度为 5ug/ml， 转铁蛋白在所述培养基中的浓 度为 5ug/ml， 亚硒酸钠在所述培养基中的浓度为 5ng/ml ； 丙酮酸钠在所述培养基中的浓度 为 0.23mmol/l， 谷氨酰胺在所述培养基中的浓度为 1.5mmol/l， 次黄嘌呤在所述培养基中 的浓度为 2mmol/l， 胎牛血清在所述培养基中的浓度为 7.5 ( 体积百分含量 )， 促卵泡素 在所述培养基中的浓度为0.25g ml-1， 促黄体素在所述培养基中的浓度为5IU ml-1， 雌激 素 E2 在所述培养基中的浓度为 0.5g。
22、ml-1， PTEN 抑制剂 Pic 在所述培养基中的浓度为 10mol/L。 0029 培养基 2 ： 成分及其终浓度与培养基 1 基本相同， 0030 不同的是 PTEN 抑制剂 Pic 在所述培养基中的浓度为 1mol/L。 0031 培养基 3 ： 成分及其终浓度与培养基 1 基本相同， 不同的是 PTEN 抑制剂 Pic 在所 述培养基中的浓度为 100nmol/L。 0032 对照培养基 ： 成分及其终浓度与培养基 1 基本相同， 不同的是不加入 PTEN 抑制剂 Pic。 0033 2)PTEN 抑制剂 Pic 的最优浓度筛选 0034 将步骤1得到的腔前卵泡在上述培养基1、 培。
23、养基2和培养基3中分别培养， 39， 5 CO2， 培养 21 天。 0035 3) 卵泡生长状况 0036 统计卵泡直径增长值和卵泡成腔率 ； 说 明 书 CN 102250831 A CN 102250833 A4/5 页 6 0037 成腔率为成腔的卵泡数 / 总培养成活的卵泡数 100 ； 0038 直径增长值为后一次观察时卵泡的直径减去前一次观察时卵泡的直径得到的数 值。 0039 卵泡直径结果如下 ： 0040 表 1 为不同浓度的 pic 对牛腔前卵泡直径的影响 0041 0042 不同浓度的 pic 对牛腔前卵泡成腔率的影响结果如图 1 所示， control 为对照培 养基，。
24、 从图中看出， 在含有 100nM、 1uM、 10uM 的 Pic 的培养基 3、 培养基 2、 培养基 1 的卵泡在 15 天、 17 天、 19 天、 21 天 ( 从加入培养基起记作第 0 天 ) 的卵泡成腔率如下表 2 ： 0043 表 2 为不同浓度的 pic 的卵泡成腔率 0044 0045 0046 通过卵泡直径增长和成腔率的比较， 发现含有 10umol/LPic 的培养基 1 对卵泡生 长的促进作用最大。 0047 实施例 2、 在新的培养体系中体外培养腔前卵泡 0048 卵泡分为腔前卵泡和有腔卵泡， 成腔只是卵泡从腔前无腔状态发育长大到有腔状 态。 0049 方法 1 ：。
25、 0050 将实施例 1 的步骤 1 得到腔前卵泡在实施例 1 的培养基 1 中， 39， 5 CO2， 培养 21 天。以实施例 1 的对照培养基作为对照。 0051 统计腔前卵泡体外发育得到成腔的卵泡的成腔率， 实验重复三次， 结果取平均值 或平均值 标准差。 0052 结果如下 ： 说 明 书 CN 102250831 A CN 102250833 A5/5 页 7 0053 在培养基 1 培养 21d 后的卵泡的直径平均增长值为 167.835.7um， 成腔率为 34.38 ； 0054 在对照培养基中培养 21d 后的卵泡的直径平均增长值为 133.622.3um， 成腔率 为 1。
26、7。 0055 方法 2 ： 0056 与方法 1 基本相同， 不同的是采用培养基 4 培养， 0057 培养基 4 与培养基 1 的成分基本相同， 不同的是所述丙酮酸钠在所述培养基中的 浓度为 0.21mmol/l ； 所述谷氨酰胺在所述培养基中的浓度为 1.8mmol/l， 所述次黄嘌呤在 所述培养基中的浓度为 1.8mmol/l， 所述血清在所述培养基中的浓度为 5 ( 体积百分含 量 )， 所述促卵泡素在所述培养基中的浓度为 0.4gml-1， 所述促黄体素在所述培养基中 的浓度为 8IU ml-1， 所述雌激素在所述培养基中的浓度为 0.8gml-1。 0058 统计腔前卵泡体外发育。
27、得到成腔的卵泡的成腔率， 结果与培养基 1 无显著差异。 0059 方法 3 ： 0060 与方法 1 基本相同， 不同的是采用培养基 5 培养， 0061 培养基 5 与培养基 1 的成分基本相同， 不同的是所述丙酮酸钠在所述培养基中的 浓度为 0.29mmol/l ； 所述谷氨酰胺在所述培养基中的浓度为 2.0mmol/l， 所述次黄嘌呤在 所述培养基中的浓度为 2.5mmol/l， 所述血清在所述培养基中的浓度为 10 ( 体积百分含 量 )， 所述促卵泡素在所述培养基中的浓度为 0.5gml-1， 所述促黄体素在所述培养基中 的浓度为 10IU ml-1， 所述雌激素在所述培养基中的浓度为 1.0gml-1。 0062 统计腔前卵泡体外发育得到成腔的卵泡的成腔率， 结果与培养基 1 无显著差异。 说 明 书 CN 102250831 A CN 102250833 A1/1 页 8 图 1 说 明 书 附 图 CN 102250831 A 。