技术领域
本发明涉及生物技术和植物基因工程领域。具体而言，本发明涉及一 种植物胚和糊粉层特异表达启动子及相应获取方法，该启动子能够用于在 水稻调控体系中驱动目标基因在胚和糊粉层部位表达。
背景技术
生物体的生长发育、生理过程都是生物体的众多基因有序的、并在外 界环境因子的作用下特定表达的结果。基因正常而有规律的表达保证了植 物的正常生长发育。近年来，分子生物学的研究表明转录水平上的调控是 基因表达调控中的起始步骤，也是基因表达调控的重要方式之一。基因启 动子控制着基因在特定的组织、特定的发育阶段以及一定的环境条件下表 达。因而，分离、鉴定基因启动子，了解启动子的时空专一性表达特征及 其作用机制已成为研究基因表达调控的主要内容。
组织特异性启动子也称器官特异性启动子，该类启动子所调控的下游 基因往往只在某些特定的器官或组织部位表达，并表现出发育调节的特性。 目前，为了便于外源基因在植物体内有利、高效地发挥作用，人们开始越 来越多地研究组织特异性启动子、分析特异启动子中的顺势作用元件及作 用机制，并根据需要选择或人工构建合适的启动子，实现对外源基因表达 的定时、定点、定量三维精确调控。例如，组织特异性启动子在植物育种、 植物生物反应器等研究的应用上已初见成效。获得有组织专一性表达特性 的启动子也是寻找相关功能基因的一种有效途径。另外，植物基因工程研 究中也需要具有组织特异性高表达启动子，使外源目的基因能在特定的组 织中高效表达。
胚是被子植物有性生殖过程中形成的，在植物发育中具有重要的生物 学意义。胚的发育始于合子，经过原胚和胚的分化发育阶段，最后达到成 熟。融合形成的二倍体合子，既保持了物种遗传的相对稳定性，又为后代 中可能出现新的遗传性状、新变异提供了基础，为研究植物遗传和育种提 供重要的理论依据。因而，分离、鉴定水稻种胚特异性启动子，了解胚特 异基因表达的时空专一性特征及其相关表达机制已成为研究水稻种胚的发 生和发育的主要内容。对水稻种胚特异性表达的启动子的功能研究与鉴定， 将有利于实现外源基因在转基因植物特定组织中高效表达。
近年来有关水稻种子特异性的研究逐渐增多，但由于目前已知的胚发 育过程中特殊分子标记较少，具有种胚特异表达模式的功能基因的报道也 不多，故对水稻种子特异性启动子的研究仍主要集中在胚乳特异性启动子 上，像醇溶蛋白基因启动子、球蛋白基因启动子等，而对胚特异性启动子 的研究有报道较少。Kuwano等研究证实水稻Ole18基因的启动子驱动相关 基因在种子种胚中特异表达(PlantBiotechJ,2009,7:96-105)。Wu等通过水 稻中不同贮藏蛋白相关基因的表达模式分析，从中鉴定了一个水稻种胚中 表达强度较高的水稻球蛋白启动子Glb(PlantCellPhysiol,1998,39:885-889)。 若选择胚特异性高强度表达启动子，有助于定时定向调控外源有用蛋白的 合成，既节约能源，保证了植物正常生理活动不受干扰，同时又能提高外 源有用蛋白在种子中的储藏水平。同时，利用胚特异启动子可提高外源基 因在植物胚中的表达和累积水平，也可改良种子品质、将具有生理活性的 蛋白或短肽导入种子中创制保健型功能新品种、利用种子作生物反应器生 产有用外源蛋白或可食性疫苗，增加农产品科技附加值等。因此，胚特异 启动子及其应用为揭示整个植物胚胎发育的过程和机理的研究，利用生物 技术改良种子品质、分子医药农场等研究奠定了基础，具有极大的应用前 景。
发明内容
因此，为了满足植物胚胎发育的过程和机理研究的需要，本发明的目 的是提供一种植物胚和糊粉层特异启动子OsEmb3以及相应的获取方法。
具体而言，本发明提供一种植物胚和糊粉层特异启动子OsEmb3，所述 植物胚和糊粉层特异启动子OsEmb3能够驱动外源基因在植物的胚和糊粉 层中特异性表达。
优选地，所述植物胚和糊粉层特异表达启动子OsEmb3包含SEQID No:1所示的DNA序列或与SEQIDNo:1所示序列互补的DNA序列，或者 由SEQIDNo:1所示的DNA序列或与SEQIDNo:1所示序列互补的DNA 序列构成。序列表中SEQIDNo:1所示的DNA序列为来源于日本晴水稻 (OryzasativaLcv.Nipponbare)的水稻胚特异表达启动子，本文中称为 OsEmb3或启动子OsEmb3。
优选地，所述植物胚和糊粉层特异启动子OsEmb3包含SEQIDNo:1 所示的DNA序列的变体、同源物或衍生物。所述植物胚和糊粉层特异启动 子OsEmb3还包括在高等严谨条件下能够与SEQIDNo:1所示的DNA序列 或SEQIDNo:1所示序列的互补DNA序列杂交的核苷酸序列。
另一方面，本发明提供一种表达盒、重组表达载体或转化子，其特征 在于，所述表达盒、重组表达载体或转化子包含所述的植物胚特异表达启 动子OsEmb3。在所述重组表达载体中，所述植物胚特异表达启动子连接于 待表达的基因序列的上游；优选地，待表达的基因为具有改善植物，尤其 是水稻在胚部位的性状能力的基因。更优选地，该重组表达载体为将SEQID No:1所示的序列即OsEmb3或启动子OsEmb3构建于pCAMBIA1391中得 到的重组表达载体，本文中称为pCAMBIA1391-OsEmb3。
本发明还提供一种上述启动子在改善植物胚部位的性状方面的应用。 所述植物胚特异表达启动子OsEmb3用于驱动外源基因在植物胚部位表达。 所述植物为单子叶植物，例如水稻、小麦、玉米、大麦、高梁或燕麦，优 选为水稻。
另一方面，本发明提供一种获取所述启动子的方法，所述方法包括如 下步骤：
步骤(1)制备正向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQIDNo:2 所示；
步骤(2)制备反向引物，所述反向引物的核苷酸序列如SEQIDNo:3 所示；
步骤(3)以水稻品种日本晴的DNA序列为模板，利用所述正向引物 和所述反向引物，采用高保真DNA聚合酶对日本晴的DNA序列中的一目 的片段进行PCR扩增，该目的片段的核苷酸序列如SEQIDNo:1所示；
步骤(4)对所述目的片段进行加A并连接PGEM-T-Easy载体；
步骤(5)，利用该载体转化大肠杆菌XL-Blue感受态细胞，使感受态 细胞激活，进而将目的片段转入到激活的感受态细胞中；
步骤(6)挑取单克隆菌液提质粒，用BamHI和EcoRI进行双酶切验 证，将经过鉴定的阳性克隆进行测序，验证正确的克隆即为所要获得的目 的片段——启动子OsEmb3，其核酸序列如SEQIDNo:1所示；
步骤(7)，利用AXYGEN胶回收试剂盒回收所述目的片段。
本发明中所提供的启动子的DNA序列如SEQIDNo:1所示，需要说明 的是SEQIDNo:1中，序列开头部分的“ATTTTTCCGTCACATCGTTTCA” 为获得启动子过程中使用的正向引物的留存序列，共计22bp；序列末尾部 分的“GCTGCAGGTGTGCTCGATCCCC”为获得启动子过程中使用的反向 引物的留存序列(该留存序列与反向引物的相应序列互补)，共计22bp；该 DNA序列中剩余的部分则为获自日本晴水稻中的DNA序列。需要强调的 是，本文中所提到的启动子既可以指上述整个DNA序列，也可以指去除上 述引物留存序列后的DNA序列。
本发明的发明人利用SEQIDNo:2所示的正向引物和SEQIDNo:3所示 的反向引物从日本晴水稻(OryzasativaLcv.Nipponbare)中分离克隆 OsEmb3基因上游包括转录起始位点在内的1972bp的DNA序列，并对其 进行了验证。
技术效果
本发明的启动子OsEmb3可与植物双元表达载体连接，用于取代组成 型启动子。该启动子能够调控基因在植株中的胚部位集中表达，在实际应 用中具有显著的价值。可以通过该启动子驱动外源基因在植物中表达，可 以提高和改善水稻的特性，从而培育出理想的转基因植物品种。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1为将OsEmb3启动子构建于pCAMBIA1391载体质粒中的示意图， 其中图1中A为pCAMBIA1391示意图，图1中B为pCAMBIA1391-OsEmb3 示意图，其中示出了利用OsEmb3启动子驱动位于其下游的Gus基因表达；
图2为对本发明启动子进行酶切验证的结果示意图；
图3成熟植株(90天)的根(a)、茎(b)、叶(c)、鞘(d)及成熟种子 的纵截面(e)和横截面(f)的Gus染色图。代表报告基因Gus活性的 蓝色在根、茎、叶等营养组织中均没有出现；在种子中，Gus仅在胚细胞 和糊粉层细胞内有表达，而在胚乳中没有明显表达。从图中可以看出 OsEmb3启动子是一种胚和糊粉层细胞特异型表达启动子(标尺＝2.5mm)。
具体实施方式
以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这 些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施 例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
含有酶切位点的OsEmb3启动子的获得
1、植物材料
日本晴水稻的成熟种子，由安徽省农科院水稻所生技室保存。
2、菌株及质粒
本研究所用的大肠杆菌菌株为XL1-blue；根癌农杆菌为EHA105，安 徽省农科院水稻所生技室所存；植物表达载体pCAMBIA1391购自澳大利 亚CAMBIA公司
3、试剂与药品
次氯酸钠(NaClO，有效氯浓度4％)，Tween20购自Sigma公司。潮霉 素B购自Roche公司；质粒DNA提取采用Axygen质粒小提试剂盒；DNA 片段回收试剂盒购自TIANGEN公司。引物合成和测序由北京六合华大基 因科技股份有限公司完成；KOD高保真聚合酶和定量PCR试剂盒购自大连 TaKaRa宝生物技术有限公司；PEASY-Tsimple和DNAmarker-Trans2K购自 Transgen公司；限制性内切酶购自NEB公司；T4DNA连接酶购自Promega 公司。
4、基因克隆
根据序列表SEQIDNo.1中OsEmb3的基因序列设计引物(与NCBI 中的记录一致)，以目的片段的DNA为模板，采用KOD-plus高保真酶进行 PCR扩增。反应体系和程序如下：
上述所列左侧为所添加试剂，右侧为反应条件和时间。
然后，回收片段大小和目的基因片段长度大小相近的片段，进行加A 并连接T载体，用于后续转化大肠杆菌XL1-blue。
5、转化
(1)准备LB(不含抗生素)和X-gal固体培养基。
(2)从-80℃冰柜中取出大肠杆菌XL-blue感受态细胞，冰浴中 融化。在无菌的离心管中加入2μl连接产物，其中一管加入2μlH2O作 为对照。取50μl感受态细胞与连接产物轻轻混匀，冰浴中放置20min。
(3)对上述混合物42℃热击90s，然后立即冰浴2min。加入 950μlLB液体培养基，37℃摇床振荡培养1h；
(4)12000r/min，离心1min，所得沉淀用100μlLB重悬。取适 量涂于固体培养基上，37℃倒置培养16-20h，有的菌落为白色，有的 变为蓝色，选取白色的菌落进行PCR鉴定，白色的菌落为插入了目的 片段的大肠杆菌。
6、质粒小量提取方法
用AXYGEN质粒DNA小量试剂盒提取相应的质粒，具体操作方法如 下：第一次使用时，将试剂盒中的RNaseA全部加入到BufferS1中，混匀， 4℃贮存。
(1)取约4mL过夜培养的含有大肠杆菌的LB液体，下文中称 为菌液，12000×g离心30s，弃上清。
(2)加250μlBufferS1悬浮细菌沉淀，悬浮需均匀，不应留有 小菌块。
(3)加250μlBufferS2，缓慢地上下翻转4-6次，混合均匀使 菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液。此步骤不宜超过5min。
(4)加350μlBufferS3，温和并充分地上下翻转混合6-8次， 12000×g离心10min。
(5)吸取步骤4中的上清并转移到吸附柱，室温静止2min， 12000×g离心1min，弃滤液。
(6)将吸附柱放回离心管，加500μlBufferW1，12000×g离心 30s，弃滤液。
(7)将吸附柱放回离心管，加700μlBufferW2，12000×g离心 30s，弃滤液；以同样的方法再用500μlBufferW2洗涤一次。弃滤液。
(8)将吸附柱置回2mL离心管中，12000×g离心2min。
(9)将吸附柱移入新的1.5mL离心管中，在吸附柱膜中加60μl 去离子水，室温静置2min。12000×g离心1min。将洗脱下来的溶液重 新回到吸附膜的中央，复洗一次，得到克隆质粒DNA。
7、对克隆载体的酶切鉴定
质粒DNA用限制性内切酶消化。电泳观察酶切片段的位置和大小，以 判断所鉴定的质粒是否有外源片段插入以及插入片段的大小。酶切反应体 系为20μl，组分如下：
上述组分混匀后，置37℃反应2-4h。电泳观察酶切结果，如图2。
8、植物表达载体构建
根据NCBI中日本晴基因OsEmb3的CDS序列设计扩增引物；构建植 物表达载体的引物如下：
正向引物：GGATCCATTTTTCCGTCACATCGTTTCA
反向引物：GAATTCGGGGATCGAGCACACCTGCAGC
分别以上面克隆正确的质粒为模板用带酶切位点的引物进行PCR扩增， 扩增的体系和程序同用cDNA基因克隆，加A连T转化大肠杆菌，选取正 确的T载体阳性克隆提取质粒。用限制性内切酶BamHI和EcoRI对含目的 片段的质粒和pCAMBIA1391质粒进行酶切，分别回收目的片段和1391质 粒的大片段进行连接。用progemaT4连接酶连接目的片段和1391载体大片 段，4℃冰箱过夜连接16-18h，将连接产物转化大肠杆菌。经过菌落PCR 筛选重组子和双酶切验证正确的，送北京六合华大基因科技股份有限公司 进行测序并将测序所得序列与NCBI中该基因序列比对。验证正确的克隆即 为所要获得的启动子，其核酸序列如SEQIDNo:1所示，并提取其质粒用 于转化农杆菌。
9、农杆菌感受态细胞的制备
(1)从-80℃超低温冰箱取出甘油冻存的农杆菌EHA105菌株， 在含10μg/mLRif的YEB培养基划线，28℃培养2-3d至长出单菌落。
(2)挑取单菌落接种于10mL含有10μg/mLRif的YEB培养基， 28℃，210r/min过夜培养。
(3)将所得菌液全部转移至250mL含10μg/mLRif的YEB培 养基中于28℃，210r/min继续培养4h左右，中间每隔一段时间测量一 次OD值，培养OD600至0.5-0.7。
(4)将菌液均分于6支50mL离心管，冰上静置30min，然后 于4℃，4000r/min离心5min。
(5)弃上清，将离心管倒扣于无菌滤纸上，以除净剩余菌液。
(6)加入3mL预冷的100mMCaCl2重悬菌体。
(7)将重悬菌液集中于2支离心管，配平，4℃，4000r/min离 心5min。
(8)弃上清，将离心管倒扣于无菌滤纸上，以除净剩余菌液；
(9)加入5mL预冷的100mMCaCl2重悬菌体。
(10)加入5mL预冷的50％甘油，混匀。
(11)冰浴10min，每管100μl分装于无菌离心管，液氮冷冻后， 存于超低温冰箱，备用。
10、植物表达载体转化根癌农杆菌EHA105
(1)从-80℃超低温冰箱取出农杆菌感受态细胞，冰上融化，加 入2μg表达载体质粒DNA混匀后，冰浴30min；
(2)迅速转入液氮速冻1min；
(3)从液氮中取出后再加入30℃预热的1mLYEP培养基(不 含抗生素)，于30℃摇床120r/min培养4h；
(4)4000r/min离心1min，弃上清；
(5)加入150μlYEP培养基重悬，将菌液均匀涂布于含50μg/mL Kan和10μg/mLRif的YEP固体平板培养基上；
(6)28℃恒温培养箱培养2-3d至长出单菌落，进行菌落PCR 鉴定。
(7)挑取阳性的菌落摇菌，并用甘油保存菌液备用。
(8)上文中回收的过程均采用AXYGEN回收试剂盒。
利用回收试剂盒回收的步骤如下：
(1)将获得的片段加入到琼脂糖凝胶中，在紫外灯下切下含有 目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面液体。计算凝胶重量， 该重量作为一个凝胶体积。
(2)加入3个凝胶体积的BufferDE-A，混合均匀后于75℃加 热，期间不断晃动，直至胶块完全熔化。
(3)加入0.5个BufferDE-A体积的BufferDE-B，混匀。当分 离的DNA片段小于400bp时，需再加入1个凝胶体积的异丙醇。
(4)吸取步骤3中的混合液，转移到DNA制备管中，DNA制 备管置于2mL离心管中，12000×g离心1min。弃滤液。
(5)将制备管重新置回2mL离心管中，加入500μlBufferW1， 12000×g离心30s，弃滤液。
(6)将制备管置回2mL离心管，加700μlBufferW2，12000×g 离心30s，弃滤液。以同样的方法再用500μlBufferW2洗涤一次， 12000×g离心1min。
(7)将制备管置回2mL离心管质粒中，12000×g离心2min。
(8)将制备管置于洁净的1.5mL离心管中，在制备膜中央加入 25-35μl去离子水，室温静置2min。12000×g离心1min洗脱DNA片段。
利用启动子驱动Gus报告基因在水稻中表达
步骤1：农杆菌介异的水稻遗传转化
(1)愈伤组织诱导消毒后的水稻种子用无菌水在30℃黑暗条 件下浸泡过夜，用解剖刀将胚剥下置于诱导培养基上，每皿均匀放置 12个胚，在30℃黑暗条件下放置2-3周诱导愈伤组织，至长出淡黄色 颗粒状愈伤。
(2)预培养从诱导培养基上挑选颗粒状、不带病斑的愈伤组 织置于新的诱导培养基上，于30℃黑暗条件下培养3-5d。
(3)侵染及共培养将预培养的愈伤组织转移至50mL无菌管 中，加入植物表达载体的农杆菌菌液浸泡20min，倒出菌液，并用无菌 滤纸将残余菌液吸干。后将愈伤均匀撒在共培养培养基上，于23℃黑 暗条件下培养2-3d。
(4)恢复将共培养的愈伤组织转移至恢复培养基上。23℃黑 暗条件下培养3-5d。
(5)筛选从筛选培养基上挑选不带菌斑颜色鲜亮呈淡黄色 颗粒状的抗性胚性愈伤组织，每皿30粒接种于筛选培养基，30℃黑暗 条件下培养2-3周，至长出新的抗性颗粒状愈伤。
(6)分化每一转化事件(筛选时由一粒愈伤组织繁殖产生的 所有愈伤组织)挑选三个独立的胚性愈伤组织到分化培养基某一区域， 30℃光照培养室(16h光照/8h黑暗)条件下培养3-4周，待幼苗长出。
(7)生根每一区域挑选两棵健壮的幼苗移栽至生根培养基， 30℃组织培养室光周期(16h光照/8h黑暗)培养三周左右，进行鉴定 并移栽至田间。
步骤2、Gus组织化学染色
Gus能与显色底物X-Gluc反应，显现蓝色，因而可以通过组织化学染 色定性的研究Gus的表达水平和表达模式。
(1)Gus染色底物的配制
50mL0.5M磷酸缓冲液(pH7.0)，50μl100mM铁氰化钾，50μl100mM 亚铁氰化钾，1mL0.5MEDTA，250μl1mmg/mLX-Gluc。
(2)染色步骤
a、染色：将待测样品浸到Gus染液中，37℃保温箱中放置24h-36h。
b、脱色：加入100％乙醇浸泡直至完全脱色。可用含有30％甘油 和70％乙醇的溶液保存。
c、在显微镜下拍记录。
按上述方法进行Gus染色，结果如图3所示，代表报告基因Gus活性 的蓝色在根、茎、叶等营养组织中均没有出现；在种子中，Gus仅在胚细胞 和糊粉层细胞内有表达，而在胚乳中没有明显表达。这些数据表明OsEmb3 启动子是一种胚和糊粉层细胞特异型表达启动子。
本实施例中，缓冲液、试剂、细菌培养基配方、大肠杆菌感受态制备 参见《分子克隆实验指南》(第三版)。
以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员 可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属 于本发明所附权利要求的范围。