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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201711438517.9 (22)申请日 2017.12.27 (71)申请人 沈阳药科大学 地址 110016 辽宁省沈阳市沈河区文化路 103号 (72)发明人 孙进何仲贵刘岩 (74)专利代理机构 沈阳杰克知识产权代理有限 公司 21207 代理人 靳玲 (51)Int.Cl. C07D 403/12(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 一类具有生物粘附作用的马来酰亚胺型前 药及其在口服药物传递中的应用 (57)摘要 本发明属于医。
2、药技术领域， 涉及一类以粘蛋 白为靶点的马来酰亚胺型前药在促进生物粘附 及其提高口服药物吸收中的应用。 所述的马来酰 亚胺型前药的结构式如(I)所示： 其中， n28； X为O、 N； 该前药化合物载药量高， 稳定性好， 安 全， 可用于口服给药。 其所携带的马来酰亚胺基 团能够在胃肠道中与粘液层中的粘蛋白特异性 结合， 形成粘蛋白-前药复合物， 延长药物在胃肠 道中的滞留时间， 提高吸附-吸收部位的浓度梯 度， 促进被动扩散， 从而提高口服吸收。 本发明是 一类新型的具有生物粘附作用的马来酰亚胺型 前药用于提高药物的口服吸收。 权利要求书2页 说明书6页 附图7页 CN 108164512 。
3、A 2018.06.15 CN 108164512 A 1.一类具有生物粘附作用的马来酰亚胺型前药， 其特征在于， 其结构通式如( )所示 n28； X为O、 N； Drug为自身或将其结构修饰后携带有羟基或氨基的抗肿瘤药物残基。 2.如权利要求1所述的一类具有生物粘附作用的马来酰亚胺型前药， 其特征在于， 所述 的马亚酰亚胺型前药是以肠道粘蛋白的巯基为靶点， 基于共价键合粘附为基础的， 以马来 酰亚胺为靶头载体的新型前体药物。 3.如权利要求1或2所述的一类具有生物粘附作用的马来酰亚胺型前药， 其特征在于， 所述抗肿瘤药物为5-氟尿嘧啶、 吉西他滨、 地西他滨、 阿霉素、 阿糖胞苷、 阿扎胞。
4、苷， 紫杉醇、 多西他赛中的任一物质或它们的衍生物。 4.如权利要求1-3任何一项所述的一类具有生物粘附作用的马来酰亚胺型前药， 其特 征在于， 所述的前药以酯键或酰胺键为连接键。 5.如权利要求1-4任何一项所述的一类具有生物粘附作用的马来酰亚胺型前药， 其特 征在于， 所述的马来酰亚胺型前药为： 1-(6-马来酰亚胺基己酰氧甲基)-5-氟尿嘧啶。 6.如权利要求5所述的一类具有生物粘附作用的马来酰亚胺型前药的制备方法， 其特 征在于， 采用如下步骤制备： (a)6-氨基己酸和马来酸酐于冰醋酸中加热反应， 得白色中间 体6-马来酰亚胺基己酸( )， 反应式如下： (b)5-氟尿嘧啶与甲醛分子。
5、缩合得到的中间体1,3-二羟甲基-5-氟尿嘧啶(),反应式 如下： (c)将6-马来酰亚胺基己酸、 N-甲基吗啡啉和HATU溶于乙腈中， 冰浴活化后与中间体 ()混合， 室温条件下反应， 薄层色谱监测， 分离纯化得终产物1-(6-马来酰亚胺基己酰氧 甲基)-5-氟尿嘧啶()， 反应式如下： 权利要求书 1/2 页 2 CN 108164512 A 2 7.如权利要求6所述的制备方法， 其特征在于， 催化剂HATU可以替换为1-(3-二甲氨基 丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、 二环己基碳二亚胺、 1-羟基苯并三唑等缩合剂， N-甲基吗啡 啉可以替换为三乙胺、 4-二甲氨基吡啶和N-乙基二异丙胺等。
6、有机碱。 8.一种药物组合物， 包含权利要求1-5任何一项所述的一类具有生物粘附作用的马来 酰亚胺型前药作为活性成分。 9.权利要求1-5中任何一项所述的一类具有生物粘附作用的马来酰亚胺型前药或权利 要求8所述的组合物在制备口服药物传递系统中的应用。 10.权利要求1-5中任何一项所述的一类具有生物粘附作用的马来酰亚胺型前药或权 利要求8所述的组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。 11.权利要求10所述的应用， 其特征在于， 所述的肿瘤为胃癌、 结肠癌、 肝癌、 肺癌、 卵巢 癌、 白血病或中枢神经系统肿瘤。 权利要求书 2/2 页 3 CN 108164512 A 3 一类具有生物粘附作用的马来。
7、酰亚胺型前药及其在口服药物 传递中的应用 技术领域 0001 本发明属于前体药物制剂新用途技术领域， 涉及一类具有生物粘附作用的马来酰 亚胺型前药及其在口服药物传递中的应用。 背景技术 0002 恶性肿瘤严重威胁着人类的生命和健康,其发病率和死亡率正在逐年增加。 目前 大多数抗肿瘤药物主要是通过注射给药的方式应用于患者， 由于注射途径本身存在的缺 陷， 诸如疼痛、 给药不便及患者顺应性差， 并且会产生严重的心脏、 肝及肾的毒副作用。 口服 给药作为一种方便、 安全的给药方式， 患者顺应性好， 并且避免了注射带来的毒副作用。 药 物的口服吸收受多种因素影响， 如药物的溶解性、 渗透性及肝脏的首过。
8、效应等， 因此如何提 高抗肿瘤药物的生物利用度成为临床口服化疗的关键所在。 0003 肠道黏液层是由肠上皮杯状细胞和黏液腺分泌产生的可溶性凝胶层组成， 其在维 持肠道内环境稳定方面起到了至关重要的作用， 同时也严重阻碍了外源性药物的口服吸 收。 粘蛋白由一条肽链主干和若干条糖链组成， 其糖基侧链含有唾液酸的羧基和巯基基团。 通过将母药分子化学修饰连接马来酰亚胺基基团， 合成可与胃肠道内粘蛋白特异性结合的 前体药物。 该粘蛋白-前药复合物， 可增加药物与胃肠黏膜的接触， 延长药物在胃肠道中的 滞留时间， 提高吸附-吸收部位的浓度梯度， 促进被动扩散， 从而提高口服吸收。 发明内容 0004 本发。
9、明的目的是提供一种以肠道粘蛋白为靶点， 以马来酰亚胺为靶头载体的新型 前药， 在胃肠道内与粘蛋白快速结合， 延长药物在胃肠道中的滞留时间， 促进药物的肠吸 收， 提高药物的血药浓度， 进而显著提高药物的口服生物利用度。 0005 本发明所述的马来酰亚胺型前药的结构如式( )所示： 0006 0007 其中： X为O、 N； Drug为自身或将其结构修饰后携带有羟基或氨基的抗肿瘤药物残 基； n可为28。 0008 所述抗肿瘤药物选自5-氟尿嘧啶、 吉西他滨、 地西他滨、 阿糖胞苷、 阿扎胞苷， 紫杉 醇、 多西他赛及其衍生物等。 0009 本发明所述的马来酰亚胺型前药是通过如下方法制备得到的：。
10、 0010 (a)6-氨基己酸和马来酸酐于冰醋酸中加热反应， 得白色中间体6-马来酰亚胺基 己酸( )， 反应式如下： 说明书 1/6 页 4 CN 108164512 A 4 0011 0012 (b)5-氟尿嘧啶与甲醛分子缩合得到的中间体1,3-二羟甲基-5-氟尿嘧啶() , 反应式如下： 0013 0014 (c)将6-马来酰亚胺基己酸、 N-甲基吗啡啉和HATU溶于乙腈中， 冰浴活化后与中间 体()混合， 室温条件下反应， 薄层色谱监测， 分离纯化得终产物1- (6-马来酰亚胺基己酰 氧甲基)-5-氟尿嘧啶()， 反应式如下： 0015 0016 本发明可通过改变羧酸部分碳链长度， 即。
11、改变n值的大小， 以改善药物的脂溶性。 0017 本发明优选的马来酰亚胺型前药为1-(6-马来酰亚胺基己酰氧甲基)-5-氟尿嘧啶 (EMC-5-FU)， 其结构如下， 此时， n2。 0018 0019 所述的马来酰亚胺型前药利用巯基与马来酰亚胺基团可发生迈克尔加成反应实 现粘蛋白与前药的共价结合， 从而提高了药物在粘液层中的滞留。 0020 本发明还提供了所述的马来酰亚胺型前药在口服药物传递系统中的应用， 具体地 是指在提高口服药物生物利用度药物中的应用。 0021 本发明还提供了一种药物组合物， 以所述的马来酰亚胺型前药作为活性成分。 该 前药或其药物组合物可以进一步与药学上可接受的载体制。
12、备成临床上可接受的制剂， 所述 的制剂可以为片剂、 胶囊剂、 颗粒剂等。 0022 本发明的优势在于： 0023 1本发明基于巯基与马来酰亚胺基团可发生迈克尔加成反应实现粘蛋白与前药的 共价结合， 设计以粘蛋白靶点的口服新型前药。 0024 2拓宽了以粘蛋白为靶点的口服载体前药的应用范围， 包括BCS III、 IV类抗肿瘤 药物， 通过提高药物在黏液层中的滞留时间， 提高渗透性， 进而提高口服生物利用度。 0025 3本发明使只能以注射方式给药的抗肿瘤药物口服成为可能， 降低了风险增加了 患者顺应性。 说明书 2/6 页 5 CN 108164512 A 5 0026 4.本发明首次将以肠道。
13、粘蛋白为靶点的载体前药应用于口服药物传递， 为解决部 分抗肿瘤药物通透性差， 口服生物利用度低等问题提供了一种新的思路。 附图说明 0027 图1为本发明实施例1的1-(6-马来酰亚胺基己酰氧甲基)-5-氟尿嘧啶结构的 1HNMR谱图。 0028 图2为本发明实施例2的1-(6-马来酰亚胺基己酰氧甲基)-5-氟尿嘧啶前药在不同 pH条件下浓度百分比随时间变化曲线图。 0029 图3为本发明实施例2的1-(6-马来酰亚胺基己酰氧甲基)-5-氟尿嘧啶前药在人工 胃液和人工肠液中浓度百分比随时间变化曲线图。 0030 图4为本发明实施例3的1-(6-马来酰亚胺基己酰氧甲基)-5-氟尿嘧啶前药、 粘蛋。
14、 白及其孵育混合物的1HNMR谱图。 0031 图5为本发明实施例4的1-(6-马来酰亚胺基己酰氧甲基)-5-氟尿嘧啶前药与粘蛋 白体外结合时间曲线图。 0032 图6为本发明实施例5的5-氟尿嘧啶及1-(6-马来酰亚胺基己酰氧甲基)-5- 氟尿 嘧啶溶液剂在体原位肠灌流的(Ka)柱状图。 0033 图7为本发明实施例5的5-氟尿嘧啶及1-(6-马来酰亚胺基己酰氧甲基)-5- 氟尿 嘧啶溶液剂在体原位肠灌流的(Papp)柱状图。 0034 图8为本发明实施例6的5-氟尿嘧啶和等剂量1-(6-马来酰亚胺基己酰氧甲基)-5- 氟尿嘧啶经口服给药后在SD大鼠体内的5-氟尿嘧啶血浆浓度对时间的曲线图。。
15、 0035 图9为本发明实施例6的5-氟尿嘧啶经静脉注射给药后在SD大鼠体内的 5-氟尿嘧 啶血浆浓度对时间的曲线图。 具体实施方式 0036 下面通过实施例的方式进一步说明本发明， 以1-(6-马来酰亚胺基己酰氧甲基)- 5-氟尿嘧啶为例， 但并不因此将发明限制在所述的实施例范围之中。 0037 实施例1 0038 1-(6-马来酰亚胺基己酰氧甲基)-5-氟尿嘧啶的制备 0039 (a)取马来酸酐9.806g(100mmol)和6-氨基己酸13.118g(100mmol)溶于100mL 冰 醋酸中， 120下反应3-4h， 旋蒸除去有机试剂， 利用甲苯带水， 乙酸乙酯萃取后将有机层合 并， 。
16、加入无水硫酸钠搅拌除水， 柱层析得白色中间体( )。 0040 (b)取5-氟尿嘧啶8.45g(65mmol)溶于一定体积37甲醛溶液， 于50下反应约 4h， 减压浓缩反应液得透明液体中间体()。 0041 (c)取6-马来酰亚胺基己酸11.4g(54mmol)、 HATU 26.7g(70mmol)和N-甲基吗啡啉 14.85mL(135mmol)溶于150mL无水乙腈中， 冰浴条件下活化。 将() 用乙腈溶解后缓慢转 移至上述反应液中， 抽真空氮气保护， 25搅拌下反应 8-10h， TLC监测反应完全。 将反应液 用乙酸乙酯萃取， 饱和食盐水洗后将有机层合并， 加入无水硫酸钠搅拌除水，。
17、 旋干， 柱层析 得终产物()。 0042 采用核磁共振测定1HNMR氢谱来确定实施例1中前药的结构， 选用的溶剂为C2D6OS 说明书 3/6 页 6 CN 108164512 A 6 结果如图1。 0043 实施例2 0044 平衡溶解度及油水分配系数的测定 0045 将过量的1-(6-马来酰亚胺基己酰氧甲基)-5-氟尿嘧啶加入到水、 pH 1.2PBS 及 不同含量的PEG400水溶液中， 涡旋5min后放入37的恒温振荡箱中振摇 72h， 使溶解达到 平衡。 将混悬液以12000r离心10min， 取上清液过滤， 经适当稀释后， 高效液相色谱仪测定药 物浓度， 计算其在不同介质中的平衡。
18、溶解度， 结果如表1所示。 0046 表1 0047 0048 分别称取5-氟尿嘧啶及1-(6-马来酰亚胺基己酰氧甲基)-5-氟尿嘧啶适量于水饱 和的正辛醇中(正辛醇饱和的水)， 分别将上述溶液与正辛醇饱和的水(水饱和的正辛醇)等 体积混合， 于37振荡器中恒温振荡24h， 取出后， 经乙腈稀释， 测定水相及油相中的药物浓 度， 根据公式计算其油水分配系数， 结果如表2 所示。 0049 表2 0050 0051 根据结果可知， 相对于母药分子,由于脂肪烃连的延长， 马来酰亚胺型前药的油水 分配系数增大了近40倍。 结果表明前药分子具有更高的脂溶性， 更易被胃肠道吸收。 0052 实施例3 0。
19、053 1-(6-马来酰亚胺基己酰氧甲基)-5-氟尿嘧啶的稳定性研究 0054 称取1-(6-马来酰亚胺基己酰氧甲基)-5-氟尿嘧啶适量， 加入适量水溶解制成浓 度约为200 g/ml的储备液。 取适量储备液， 并分别以pH 1.2、 4.5、 6.8 和7.4的磷酸盐缓冲 液稀释， 充分混匀， 一式三份。 采用经典恒温法将其放于37恒温振荡器中， 于0、 0.25、 0.5、 1、 2、 4、 8和12h取样， 过0.45 m滤膜， 高效液相色谱进样10 L。 0055 根据中国药典2015版制备人工胃液(SGF)及肠液(SIF)。 取适量储备液， 分别用人 工胃液及肠液稀释混匀， 一式三份。
20、。 于0、 0.25、 0.5、 1、 2、 4、 8和12h定时取样100 L， 加入300 L乙腈沉淀蛋白， 涡旋3min， 离心12000rpm 10min， 取上清液， HPLC测定药物浓度变化。 0056 1-(6-马来酰亚胺基己酰氧甲基)-5-氟尿嘧啶在不同pH下的磷酸盐中的稳定性结 果如图2所示。 由图可知， pH值对药物的稳定性有一定的影响。 溶液酸性或碱性越强， 药物稳 定性越差。 OH-和H+均可催化该前药分子酯键水解， OH-催化水解能力更强， 并随pH的增加， 水 说明书 4/6 页 7 CN 108164512 A 7 解速度显著加快。 其在人工胃液和人工肠液的稳定性。
21、结果如图3所示。 该前药在人工肠液和 人工胃液中12h均能稳定存在， 在人工肠液中降解受碱性环境和胰蛋白酶的双重影响， 而其 在胃液环境中水解主要受pH的影响。 0057 实施例4 0058 马来酰亚胺型前药、 粘蛋白及其混合物的共价结合分析 0059 采用核磁共振法验证迈克尔加成反应的发生。 取适量1-(6-马来酰亚胺基己酰氧 甲基)-5-氟尿嘧啶及粘蛋白溶解于重水(D2O)中， 制成2mg/mL EMC-5-FU 溶液、 20mg/mL粘 蛋白溶液以及相同浓度药物与粘蛋白的混合溶液。 室温条件下剧烈搅拌一段时间后， 利用 核磁共振仪进行测定， 记录图谱。 0060 1-(6-马来酰亚胺基己。
22、酰氧甲基)-5-氟尿嘧啶,粘蛋白以及前药/粘蛋白混合溶液 的核磁图如图4所示。 图4a中化学位移在 6.75-6.85ppm处的特征峰为马来酰亚胺上乙烯 基上氢的特征峰， 粘蛋白(图4b)在此位移处并无特征峰。 在图4c粘蛋白/前药混合溶液中， 可看到相似的乙烯基质子峰， 但峰强度明显减小， 因而表明双键被打开， 前药与粘蛋白间成 功发生了迈克尔加成反应实现共价结合。 0061 实施例5 0062 1-(6-马来酰亚胺基己酰氧甲基)-5-氟尿嘧啶与粘蛋白的体外结合试验 0063 取1-(6-马来酰亚胺基己酰氧甲基)-5-氟尿嘧啶溶液与一定浓度的粘蛋白溶液涡 旋混匀后于37恒温振荡器中进行孵育。。
23、 分别于0.15、 0.5、 1、 3、 6及12h 定时取样500 L， 置 于超滤离心管中(MW10000),离心(4000rpm， 15min)， 收集底部滤液， HPLC测定游离的药物 含量变化， 根据公式计算不同时间药物与粘蛋白的结合情况。 0064 0065 Ct为总的药物浓度； Cu为游离的药物浓度。 0066 该马来酰亚胺型前药与粘蛋白的结合曲线如图5所示， 在0.5h时药物与粘蛋白的 结合率已达18.66， 随后呈现一个缓慢的上升趋势。 结果表明， 在实验初期， 马来酰亚胺对 粘蛋白存在很强的生物粘附作用， 这是由于粘蛋白表面暴露着一部分游离巯基， 可与药物 快速作用， 并且。
24、由于粘蛋白自身的交联、 缠绕， 尚有部分巯基未暴露在表面， 可在接触后期 与粘蛋白发生相互作用。 0067 实施例6 0068 大鼠在体肠单向灌流试验 0069 实验前将大鼠禁食过夜(自由饮水)， 用质量分数为20的乌拉坦(1.0g/kg) 腹腔 注射将其麻醉， 固定于手术台上， 用红外灯维持体温。 用供试液饱和管路1 h， 收集出液口流 出的药液， 直至与进口处药液浓度相等， 以消除实验过程中管路对药物的吸附作用产生的 干扰。 沿腹中线剪开34cm的开口， 打开腹腔， 分离出待考察肠段(十二指肠、 空肠、 回肠和 结肠)约10cm， 用预热至37的生理盐水冲洗肠内容物， 于两端切口处插管结扎。
25、。 用浸有生 理盐水的脱脂棉覆盖伤口保湿， 并用红外灯保温。 进口处用装有供试液的已知重量的锥形 瓶进行灌流， 流速为0.2mL/min， 出口处每隔15min用另一已知重量的EP管收集流出液(同时 迅速更换下一个供试液锥形瓶和收集液EP管)， 称量此时锥形瓶和EP管的重量， HPLC测定药 物的浓度， 实验持续时间为90min。 实验结束后处死大鼠， 剪下被灌流肠段， 测量其长度(l) 说明书 5/6 页 8 CN 108164512 A 8 和内径(r)。 根据公式计算Ka和Papp。 0070 0071 0072 Cin为流入管中供试液中药物的浓度； Cout为流出管中药物的浓度； Vi。
26、n是流入的供 试液的体积； Vout为收集管中流出液的体积(灌流液的密度为1kg/L)； Q 为灌流速度。 0073 具体实验结果如图6、 7所示。 与5-氟尿嘧啶溶液剂组相比， 1-(6-马来酰亚胺基己 酰氧甲基)-5-氟尿嘧啶前药在十二指肠、 空肠、 回肠、 结肠四个肠段内的吸收速率常数(Ka) 与表观渗透系数(Papp)均明显提高(P0.05)， 其中在十二指肠和空肠段的显著性水平为P 0.01。 结果表明5-氟尿嘧啶经过马来酰亚胺修饰后能显著增加药物在肠道内粘液层粘附， 延长滞留时间进而穿过粘液层到达肠细胞而被吸收。 0074 实施例7 0075 1-(6-马来酰亚胺基己酰氧甲基)-5。
27、-氟尿嘧啶前药口服药代动力学研究 0076 取健康SD大鼠15只， 随机分为3组， 每组5只。 实验前禁食12h， 自由饮水。 其中A组尾 静脉注射5-氟尿嘧啶溶液(6mg/kg)， B组灌胃给药5-氟尿嘧啶溶液(12mg/kg)， C组灌胃给药 1-(6-马来酰亚胺基己酰氧甲基)-5-氟尿嘧啶溶液(给药剂量等效于5-FU为12mg/kg)。 分别 于0.0833、 0.25、 0.5、 1、 2、 4、 6、 8、 12、 24h均通过眼眶取血0.3mL至经肝素处理后的试管中， 立即经过高速离心10min(10000rpm)， 取上清， -20冰箱保存， 之后用UPLC-MS/MS测定血药 。
28、浓度， 计算相关药动学参数。 0077 大鼠体内药代动力学实验结果如图8、 9和表3所示， 结果表明5-氟尿嘧啶灌胃给药 后迅速达峰， 说明药物快速由肠道吸收入血， 此后药物迅速降解， 2h 后血药浓度几乎降为 0。 相对于母药， 马来酰亚胺修饰的前药的药-时曲线下面积 (AUC0-24h)明显提高。 1-(6-马来 酰亚胺基己酰氧甲基)-5-氟尿嘧啶溶液剂的 AUC0-24h是5-氟尿嘧啶的2.62倍； t1/2是对照 组的23.2倍， 表明马来酰亚胺修饰后能够明显增加5-氟尿嘧啶的口服生物利用度， 提高半 衰期， 延长药物在血液中的循环时间。 0078 表3 5-氟尿嘧啶及1-(6-马来酰。
29、亚胺基己酰氧甲基)-5-氟尿嘧啶溶液的大鼠体内 的药动学参数 0079 说明书 6/6 页 9 CN 108164512 A 9 图1 说明书附图 1/7 页 10 CN 108164512 A 10 图2 说明书附图 2/7 页 11 CN 108164512 A 11 图3 说明书附图 3/7 页 12 CN 108164512 A 12 图4 说明书附图 4/7 页 13 CN 108164512 A 13 图5 图6 说明书附图 5/7 页 14 CN 108164512 A 14 图7 图8 说明书附图 6/7 页 15 CN 108164512 A 15 图9 说明书附图 7/7 页 16 CN 108164512 A 16 。