技术领域
本发明涉及一种重组PRRS病毒HV-nsp9及其应用。
背景技术
在生物体中，每种氨基酸至少对应一个密码子,最多的有六种对应的密码子,编码同一种氨基酸的密码子称为同义密码子。研究表明,生物体内普遍存在同义密码子非均衡使用的现象,例如:某一物种或某一基因通常倾向于使用一种或几种特定的同义密码子,这些密码子被称为最优密码子(optimal codon),此现象被称为密码子偏好性(codon bias)。同样的，密码子对的使用也有偏好性，但是密码子对的偏好性并不依赖于密码子的偏好性。例如，精氨酸(arginine,Arg)可以被六种密码子编码，谷氨酸(glutamic acid,Glu)可以被两种密码子编码，所以氨基酸对Arg-Glu可以被十二种同义密码子对编码，如果根据密码子的偏好性计算每个同义密码子对在人类基因组中的出现次数，那么理论上密码子对CGC-GAA的出现次数为2,397次，但实际只出现了268次，所以CGC-GAA在人类基因组中是非偏好性密码子对；而密码子对AGA-GAA编码Arg-Glu的理论次数是2,644次，但其实际出现次数则是4,195次，因此AGA-GAA是人类基因组中的偏好性密码子对。
尽管到目前为止人们并不清楚密码子对偏好性的形成原因，但是密码子对的使用却是可以影响翻译效率的。2008年，Coleman等人把脊髓灰质炎病毒(poliovirus)的核衣壳(capsid)基因进行了突变，在不改变氨基酸序列及RNA二级结构的前提下，在基因内进行同义密码子置换，使得偏好性的密码子对被置换为非偏好性的密码子对，化学合成突变后的片段，然后利用反向遗传学手段将合成的片段连入病毒全长cDNA克隆，这种致弱病毒的方法称为合成病毒致弱工程(synthetic attenuated virus engineering,SAVE)。置换后病毒capsid基因的翻译速率显著下降，并且含有突变序列的重组病毒在体外细胞上的复制能力和在小鼠中的致病力都明显降低，在攻毒试验中，重组病毒能够有效的保护野生型毒株对于免疫小鼠的再次感染。这种病毒弱化的方法具有广泛的应用性，2010和2013年，分别有人用同样的方法改造了流感病毒，获得了致弱效果明显的流感病毒弱毒株。最重要的是，在这种致弱病毒的工程中，病毒的弱化是由成百上千个点突变引起的，因此其发生返强的可能性极低。
猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syn—drome，简称PRRS)，俗称蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcinereproductive and respiratory syndrome viruse，PRRSV)引起的一种高发病率、高死亡率、低治愈率的猪病。目前，世界上广泛使用商品化的PRRS疫苗包括弱毒疫苗和灭活疫苗。灭活的PRRSV疫苗没有效果或者是只能对同源毒株的感染提供有限的保护；弱毒疫苗持续散播病毒，尤其有回复突变以致毒力返强的可能性，弱毒疫苗的返强性一直是人们担心的一个安全问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种可以作为弱毒疫苗毒株的重组PRRS病毒。
本发明要求保护的重组PRRS病毒HV-nsp9，其基因组对应的cDNA序列为将序列表序列1自5’末端第7683—9527位的序列替换为序列表序列3自5’末端第158—2002位的序列所获得的序列。
序列表序列1自5’末端第7683—9527位的序列为序列表序列3自5’末端第158—2002位的序列的DNA片段，也是本发明需要保护的；
同时，含有该片段的重组质粒、重组菌或重组细胞，也是本发明需要保护的。具体地说，所述重组质粒为将质粒pcDNA3.1-HV中对应于序列表序列1自5’末端第7683—9527位的序列替换为序列表序列3自5’末端第158—2002位的序列得到的质粒。质粒pcDNA3.1-HV是将序列表中的序列1所示的HV毒株的基因组全长序列克隆到了真核表达载体pcDNA3.1中得到的。
上述重组质粒在制备重组PRRS病毒HV-nsp9或PRRS疫苗中的应用，以及重组PRRS病毒HV-nsp9在制备PRRS疫苗中的应用，也是本发明需要保护的内容。
实验证明，将野生型PRRSV高致病毒株HV基因组的全长cDNA克隆中对应于序列表序列1自5’末端第7683—9527位的序列改造为序列表序列3自5’末端第158—2002位后获得的重组病毒HV-nsp9，与野生型PRRSV高致病毒株HV相比，在PAM（猪肺泡巨噬细胞）上生长的速度均明显下降。重组PRRS病毒HV-nsp9在猪体内的致病力明显减弱，且经HV-nsp9免疫后的小猪再次感染不同PRRS病毒后，小猪的精神状态良好，食欲正常，健康，且体内PRRS病毒量显著低于未经免疫的小猪，说明本发明所提供的重组PRRS病毒可以开发为弱毒疫苗毒株。
附图说明
图1为重组PRRS病毒感染猪PAM细胞后不同时间的病毒滴度结果。
图2为重组PRRS病毒感染猪PAM细胞后84小时诱导的细胞病变结果。
图3为接种HV-wt或HV-nsp9后小猪的直肠温度变化。
图4为接种HV-wt或HV-nsp9后小猪的存活率变化。
图5为接种HV-wt或HV-nsp9后小猪血清中PRRS病毒滴度变化。
图6为实时荧光定量PCR检测接种HV-wt或HV-nsp9两周后小猪各组织的中PRRS病毒滴度变化。
图7为接种HV-wt或HV-nsp9两周后小猪部分组织切片的苏木精—伊红染色结果。
图8为免疫HV-nsp9和未免疫的小猪在接种不同PRRS病毒后的存活率变化。
图9为免疫HV-nsp9和未免疫的小猪在接种不同PRRS病毒后的直肠温度变化。
图10为免疫HV-nsp9和未免疫的小猪在接种不同PRRS病毒后血清中PRRS病毒滴度变化。
图11为实时荧光定量PCR检测免疫HV-nsp9和未免疫的小猪在接种不同PRRS病毒两周后小猪各组织的中PRRS病毒滴度变化。
图12为免疫HV-nsp9和未免疫的小猪血清中和抗体滴度变化。
图13为流式细胞仪检测不同PRRS毒株对免疫HV-nsp9和未免疫的小猪淋巴细胞进行再刺激后的INFγ和DC8+的水平。
图14为在PAM细胞上对HV-nsp9连续传代过程中观察细胞病变的部分结果。其中，p1、p10和p20分别代表第1、10和20代。
图15为第1代、第10代和第20代的HV-nsp9中的nsp2和nsp9基因的CPB值。其中，p1、p10和p20分别代表第1、10和20代。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所用的野生型PRRSV高致病毒株HV：Genbank号为JX317648，公众可从中国农业大学获得。
下述实施例中的实验数据如无特殊说明，均为三次重复的平均值，并用t检测进行统计学分析，当P<0.05时差异显著。
下述实施例中基因的CPB值等于基因内每个密码子对的CPS值的算术平均值，公式为：
公式I
所述密码子对的CPS值即密码子对指数(codon pair score,CPS)，表示单个密码子对在基因组中的使用偏好性，一个密码子对的CPS值等于其在基因组中的实际出现次数与理论出现次数之间比值的自然对数，公式为：
密码子对在猪的基因组中的实际出现次数通过直接统计获得，而其理论出现次数则需要计算，为上面的公式I），应用这种算法可以排除基因组中氨基酸的出现频率与密码子的偏好性的影响。一个密码子对的CPS值大于零，表示其在猪的基因组中是偏好性密码子对，而CPS值小于零的密码子对则是非偏好性密码子对。应用公式I计算猪的基因组中3,721个密码子对（不包括终止密码子对）的CPS值。
实施例1、重组PRRS病毒的获得
一、目标区段的选择和改造
在PRRSV复制过程中，病毒的RNA依赖的RNA聚合酶即nsp9发挥着核心作用；nsp2是病毒最大的复制蛋白，且在高致病性PRRSV与美洲经典毒株之间差别最大；本发明选取了PRRSV的nsp2及nsp9的基因进行密码子对偏好性弱化，由于每个基因内都含有一些与基因组复制有关的调控序列，因此，我们分别选取上述2个基因内可容忍大规模突变和缺失的片段进行改造（如表1所示），即保持蛋白的氨基酸序列不变，进行同义密码子的置换，每置换一次密码子，计算一次置换后片段的CPB值，以确保置换后病毒片段的CPB值下降，应用这种程序分别将nsp2以及nsp9指定片段的CPB值下降到-0.2或者-0.4，以低于猪基因组中基因的CPB值（经计算在-0.2～0.3之间呈正态分布）。由于基因的CPB值越大，表示这个基因中偏好性的密码子对所占的比重越大，反之，非偏好性的密码子对的比重越大；当基因的CPB值下降到低于猪基因组中基因的CPB值分布范围时，则该基因的表达量会降低，从而达到弱化病毒的目的。完成全部置换后应用RNA structure软件分析PRRSV原始片段与突变后片段的二级结构及序列自由能，确定突变片段RNA的二级结构与原始序列相比没有发生较大改变。
表1、PRRSV密码子对偏好性弱化的基因片段
二、感染性cDNA克隆的构建及病毒拯救
1、DNA片段的人工合成
为将DNA片段酶切连接入含有野生型PRRSV高致病毒株HV全长cDNA（Genbank号为JX317648）的质粒pcDNA3.1-HV（pcDNA3.1购自invitrogen公司,pcDNA3.1-HV构建方法见下文）相应的酶切位点间，分别人工合成两端含有野生病毒序列并包括适当的酶切识别的序列，序列表序列2—4所示的DNA段，其两端的酶切识别序列的位置如下：
序列表序列2的第3—8位为HpaI的酶切识别序列（GTTAAC），序列表序列4的第1683—1688位为MfeI的酶切识别序列（CAATTG）；
序列表序列3的第10—21位和序列表序列4的第10—21位为BstXI的酶切识别序列（CCANNNNNNTGG），序列表序列3的第2238—2243位和序列表序列4的第2238—2243位为BclI的酶切识别序列（TGATCA）；
2、感染性cDNA克隆的构建
将序列表序列2所示的DNA片段用HpaI和MfeI双酶切，获得DNA片段1-nsp2；
将序列表序列3所示的DNA片段用BstXI和BclI双酶切，获得DNA片段2-1-nsp9；
将序列表序列4所示的DNA片段用BstXI和BclI双酶切，获得DNA片段2-2-nsp9；
将DNA片段1-nsp2与经过HpaI和MfeI双酶切的质粒pcDNA3.1-HV的骨架片段相连，获得重组质粒P-nsp2；
将DNA片段2-1-nsp9与经过BstXI和BclI双酶切的质粒pcDNA3.1-HV的骨架片段相连，获得重组质粒P-nsp9；
将DNA片段2-2-nsp9与经过BstXI和BclI双酶切的质粒pcDNA3.1-HV的骨架片段相连，获得重组质粒P-nsp9-2；
将片段2-1-nsp9与经过BstXI和BclI双酶切的重组质粒P-nsp2的骨架片段相连，获得重组质粒P-nsp29。
pcDNA3.1-HV的构建方法为：对HV毒株的基因组全长序列（如序列表中的序列1所示）进行分析，挑选出了6个用于分段拼接基因组全长序列的酶切位点（分别为Smi I、Xho I、Afl II、Cla I、EcoR V和Not I；其中Xho I、Afl II、Cla I和EcoR V是基因组中原有的，包含在扩增出的序列内；Smi I和Not I酶切位点是在病毒基因组两端分别设计添加的片段）。该6个酶切位点将基因组全长分为5个片段，将序列表中的序列1所示的HV毒株的基因组全长序列克隆到了真核表达载体pcDNA3.1（购自invitrogen公司）的骨架中，得到了pcDNA3.1-HV。其中，用于扩增的引物对HP1F、HP1R（用于扩增片段1），HP2F、HP2R（用于扩增片段2），HP3F、HP3R（用于扩增片段3），HP4F、HP4R（用于扩增片段4）和HP5F、HP5R（用于扩增片段5）的序列如下：
HP1F TAAATTTAA ATGACGTATAGGTGTTGGCTCT
HP1R GCGTGCGAGGTAACATCA
HP2F TTCTCCCAAAGATGATTCTCG
HP2R GGCAGCGGTACTTAAACAAG
HP3F GCCCTTAACAGAAACAGATGG
HP3R TACGACGGTAGATGCTCCTC
HP4F GGGAAGAAGAAGACTAGGACAAT
HP4R TCAGGGTGAACGGTAGAGC
HP5F GCCCTGTCATTGAACCAACT
HP5R TTATTAGCGGCCGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAATTAC
GGCCGCATGGTT
3、病毒拯救
将重组质粒P-nsp2、P-nsp9、P-nsp9-2、和P-nsp29分别转染293FT细胞（购自美国ATCC细胞库），转染后72小时反复冻融细胞收集细胞裂解液，将细胞裂解液与猪肺泡巨噬细胞（简称PAM）的培养液混合并连续传3-5代，获得培养上清液。取该上清液，使用鼠抗PRRSV N蛋白特异性抗体SDOW-17（购自Rural Technologies）对重组PRRS病毒进行间接免疫荧光检测。结果，重组质粒P-nsp2、P-nsp9和P-nsp29均为阳性，即能在PAM中成功拯救出PRRSV；重组质粒P-nsp9-2、为阴性，即不能在PAM中拯救出PRRSV。
三、重组PRRS病毒一步生长曲线的测定
将野生型PRRSV高致病毒株HV（以下简称为HV-wt）、重组PRRS病毒HV-nsp2、HV-nsp9和HV-nsp29分别以MOI=0.01（即感染时病毒与PAM细胞数量的比值为0.01）感染PAM，感染后12h,24h,36h,48h,60h,72h和84h取少量细胞培养上清测定病毒滴度（结果如图1和表2所示）。同时在白光下观察细胞病变并拍照（部分结果如图2所示）。
上述病毒滴度测定的方法具体如下：
在96孔细胞培养板（含RPMI1640培养液）中接种PAM细胞，37℃、5%CO2培养箱中培养24h；在1.5ml EP管中用RPMI1640培养液将病毒液作连续10倍的梯度稀释，从10-1至10-7；将稀释好的病毒液接种到细胞培养板中，每一稀释度接种8孔，每孔接种100μl；设不接种病毒的正常细胞对照8孔；接种病毒后的12h,24h,36h,48h,60h,72h和84h，取少量细胞培养上清，使用鼠抗PRRSV N蛋白特异性抗体SDOW-17（购自Rural Technologies）对PRRS病毒进行间接免疫荧光检测，统计病毒阳性孔的数量，计算每毫升病毒液中病毒半数组织感染量(TCID50/ml)。
上述病毒繁殖的方法如下：
将PAM接种到细胞培养瓶（含RPMI1640培养液）中贴壁培养24h，吸去上清液，接入病毒液；37℃吸附60分钟，期间每隔15分钟轻轻晃动培养瓶，以使病毒液与PAM细胞充分接触；然后补加RPMI1640培养液，37℃培养36h后，在-80℃和室温之间冻融细胞三次,以裂解细胞；将细胞裂解液转移至50ml离心管，4℃、5000g离心10分钟，上清液即为病毒液，将上清液分装至1.5ml EP管，保存于-80℃备用。
表2、各重组PRRS病毒感染PAM后不同时间的病毒滴度结果（log10（TCID50/ml））
PRRSV 12h 24h 36h 48h 72h 84h HV-wt 0 4.5 5.83 6.94 7.11 7.11 HV-nsp2 0 4.61 5.61 6.39 6.72 6.5 HV-nsp9 0 2.17* 3.17* 3.56* 3.72* 3.83* HV-nsp29 0 2.55* 2.61* 3.17* 3.72* 3.89*
P<0.05为差异显著
表2和图1显示，野生型PRRSV高致病毒株HV在PAM上生长迅速，感染后48小时病毒滴度达到峰值107TCID50/ml，重组PRRS病毒复制速度都明显低于野生型PRRSV高致病毒株HV，在感染PAM后48小时，重组PRRS病毒HV-nsp2（即nsp2的突变）的病毒滴度比野生型PRRSV高致病毒株HV大约低3-5倍，而重组PRRS病毒HV-nsp9（即nsp9的突变）和重组PRRS病毒HV-nsp29（即nsp2和nsp9的突变）的病毒滴度比野生型PRRSV高致病毒株HV下降了1,000-10,000倍。
另外，在感染PAM后不同时间观察细胞病变，发现野生型PRRSV高致病毒株HV感染后可以迅速诱导PAM裂解，HV-nsp2也可以诱导部分PAM裂解，但同样量的HV-nsp9以及HV-nsp29感染后直到84小时，细胞也并未出现明显的病变（图2）。
步骤三的结果表明，与野生型PRRSV高致病毒株HV相比，nsp2和nsp9的基因中密码子对偏好性弱化使重组PRRS病毒在体外复制能力都发生了明显下降。
实施例2、重组PRRS病毒在猪体内的致病力
从PRRSV和2型猪圆环病毒(PCV2)阴性的养猪场购得16头健康的4周龄普通大白猪，通过ELISA和荧光实时定量PCR进一步确认所有猪均为PRRSV和PCV2抗体阴性，PRRSV、猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)、PCV2以及伪狂犬病毒(pseudorabies virus,PRV）核酸阴性。将所有猪随机分成2组(每组8头)并滴鼻接种毒量为105TCID50/ml的病毒液2ml，每个鼻孔1ml。其中1组接种野生型PRRSV高致病毒株HV，另1组猪接种重组病毒HV-nsp9。
1、接种病毒后每天观察小猪是否出现咳嗽、呼吸困难、厌食、腹泻、站立不稳、颤抖等临床症状；每两天监测直肠温度，结果如下：
接种野生型PRRSV高致病毒株HV的小猪很快发生典型的蓝耳病症状，包括皮肤发绀、高热、呼吸困难、咳嗽、厌食、球结膜水肿、颤抖、站立不稳等。在接种野生型PRRSV高致病毒株HV后6天，小猪的直肠温度都上升到40℃左右，接种后8天，直肠温度继续上升到41℃以上（图3），它们在接种病毒后12天全部死亡（图4）；
接种HV-nsp9病毒的小猪中，有2头在感染后8-12天直肠温度上升到39.5℃左右，随后即降到正常温度范围（37-39℃之间），并没有出现高热症状，另外3头在整个实验过程中都没有发热（图3），所有小猪都健康存活到实验结束（指接种后的34天），接种后的过程中精神状态良好，皮毛正常，食欲良好，无死亡（图4）。
2、在接种病毒后4,8,12,16,24及34天采集猪前腔静脉血，收集血清，检测其中的病毒滴度，结果如图5所示。接种病毒后4天，野生型PRRSV高致病毒株HV在血清中的滴度即上升到106TCID50/ml，而血清中仅有少量的HV-nsp9病毒，接种病毒后12天，野生型PRRSV高致病毒株HV的血清病毒滴度进一步上升，达到107.4TCID50/ml，HV-nsp9在血清中的滴度尽管也在接种后14天达到峰值，但其只有103.8TCID50/ml，比野生型PRRSV高致病毒株HV的滴度下降了大约10,000倍；接种病毒14天之后，HV-nsp9的滴度逐渐下降，到接种后34天，血清中已经几乎检测不到病毒HV-nsp9的存在。
上述检测血清中病毒滴度的方法如下：
每250μl加750μl Trizol(invitrogen)，反复用枪吹打，室温静置5分钟；在上述EP管中，加入0.2ml氯仿，盖上EP管盖子，在手中用力震荡15秒，室温静置10分钟，12000g(4℃)离心15分钟；取上层水相置于新EP管中,加入0.5ml异丙醇，室温静置10分钟,12000g(4℃)离心10分钟；小心弃上清，加1ml75%乙醇进行洗涤，7500g(4℃)离心5分钟，弃上清；让沉淀的RNA在室温下自然干燥；最后加入20μl DEPC水溶解RNA，用Nanodrop1000(Thermo scientific)定量RNA。
取5μl RNA做RT-PCR。于250μl PCR管中加入5μl RNA与1μl Random Primer(10μm,TaKaRa)，混匀；70℃5分钟，迅速置冰上冷却2分钟；向上述混合物中加入以下组分：M-MLV5×Reaction Buffer5μl，dNTP(2.5mM each)5μl，Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor25units,M-MLV RT(Promega)200units，最后加DEPC水补齐体积到25μl；轻轻混匀，37℃60分钟；将PCR管转移至70℃，15分钟；置于冰上冷却，cDNA产物保存于-20℃。
Real-Time PCR使用TaKaRa的SYBR Premix Ex TaqTM II(Perfect Real Time)反应体系。 Premix Ex TaqTM(2×)10μl,PCR引物ORF7F(AATAACAACGGCAAGCAGCA)、ORF7R(GCACAGTATGATGCGTCGGC)(10μm)各0.8μl,ROX Reference Dye II(50×)0.4μl，cDNA模板2μl，无菌双蒸水6μl，总体积20μl。在ABI7900Real-Time PCR System上反应，采取两步法PCR扩增标准程序：95℃30s；95℃5s、60℃30s(40个循环)。每次实验都含有一条用梯度稀释的100–107TCID50/ml PRRSV颗粒作的标准曲线，用SDS2.2.2for7900软件分析处理数据。
3、接种病毒14天后，每组各剖检3头小猪，其中，接种野生型PRRSV高致病毒株HV的小猪在其出现不能站立以及停止饮食等症状（等是指皮肤发绀、高热、呼吸困难、咳嗽、厌食、球结膜水肿、颤抖、站立不稳）时进行剖检。剖检时观察各个器官的病理变化并取样，1份样品用10%的中性福尔马林固定后组织切片进行苏木精—伊红染色分析组织病变，另1份样品用液氮速冻后保存于-80℃用于提取组织总RNA进行实时荧光定量PCR测定组织中的PRRS病毒RNA含量（结果如图6所示）。
上述PRRS病毒RNA含量的测定方法如下：
每5mg组织加1ml Trizol(invitrogen)研磨，反复用枪吹打，室温静置5分钟；在上述EP管中，加入0.2ml氯仿，盖上EP管盖子，在手中用力震荡15秒，室温静置10分钟，12000g(4℃)离心15分钟；取上层水相置于新EP管中,加入0.5ml异丙醇，室温静置10分钟,12000g(4℃)离心10分钟；小心弃上清，加1ml75%乙醇进行洗涤，7500g(4℃)离心5分钟，弃上清；让沉淀的RNA在室温下自然干燥；最后加入20μl DEPC水溶解RNA，用Nanodrop1000(Thermo scientific)定量RNA。
取500ng RNA做RT-PCR。于250μl PCR管中加入500ng RNA与1μl Random Primer(10μm,TaKaRa)，混匀；70℃5分钟，迅速置冰上冷却2分钟；向上述混合物中加入以下组分：M-MLV5×Reaction Buffer5μl，dNTP(2.5mM each)5μl，Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor25units,M-MLV RT(Promega)200units，最后加DEPC水补齐体积到25μl；轻轻混匀，37℃60分钟；将PCR管转移至70℃，15分钟；置于冰上冷却，cDNA产物保存于-20℃。
Real-Time PCR使用TaKaRa的SYBR Premix Ex TaqTM II(Perfect Real Time)反应体系。 Premix Ex TaqTM(2×)10μl,PCR引物ORF7F(AATAACAACGGCAAGCAGCA)、ORF7R(GCACAGTATGATGCGTCGGC)(10μm)各0.8μl,ROXReference Dye II(50×)0.4μl，cDNA模板2μl，无菌双蒸水6μl，总体积20μl。在ABI7900Real-Time PCR System上反应，采取两步法PCR扩增标准程序：95℃30s；95℃5s、60℃30s(40个循环)。每次实验都含有一条用梯度稀释的100–107TCID50/ml PRRSV颗粒作的标准曲线，用SDS2.2.2for7900软件分析处理数据。
图6结果显示，在心、肝、脾、肾、脑、胸腺、扁桃体、支气管淋巴结、颌下淋巴结、腹股沟淋巴结及肠系膜淋巴结中，HV-nsp9的病毒RNA量都显著低于野生型PRRSV高致病毒株HV，尤其是在病毒的主要靶器官肺中，野生型PRRSV高致病毒株HV的病毒RNA量比HV-nsp9高1,000倍。
接种野生型PRRSV高致病毒株HV的小猪体内，出现了明显的间质性肺炎，胸腺严重萎缩，淋巴结肿大，以及肾脏出现血点等病理损伤。而接种HV-nsp9后小猪未见任何病理变化。苏木精—伊红染色试验进一步证实野生型PRRSV高致病毒株HV的感染导致了严重的组织病理损伤，包括肺部的淋巴细胞浸润造成的肺泡隔膜增厚（增生性间质肺炎）；脑、肺、肾等器官的淋巴细胞浸润造成的血管周的袖口状白血球聚集（血管炎）；肾脏细胞密度变大，结构被破坏，皮质与髓质之间界限模糊（部分结果如图7所示）。但是在HV-nsp9感染的小猪中仅观察到了轻微的增生性间质肺炎，脑和胸腺内并未出现严重的炎症反应（部分结果如图7所示）。
上述实验结果表明，重组PRRS病毒HV-nsp9在小猪体内的致病性显著减弱。
实施例3、重组PRRS病毒HV-nsp9的保护性实验
1、猪的免疫
从PRRSV和2型猪圆环病毒(PCV2)阴性的养猪场购得12头健康的4周龄普通大白猪，通过ELISA和荧光实时定量PCR进一步确认所有猪均为PRRSV和PCV2抗体阴性，PRRSV、猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)、PCV2以及伪狂犬病毒(pseudorabies virus,PRV）核酸阴性。将所有猪随机分成3组(每组4头)，取其中两组作为免疫组（分别命名为A组和B组）分别滴鼻免疫毒量为105TCID50/ml的重组病毒HV-nsp9病毒液2ml,每个鼻孔1ml,剩余一组为对照组（命名为CK组）不免疫，同等条件下养殖。
2、攻毒
免疫后42天，将A组和CK组各小猪滴鼻接种毒量为2×106TCID50/ml的野生型PRRSV高致病毒株HV的病毒液2ml,每个鼻孔1ml；将B组各小猪滴鼻接种毒量为2×106TCID50/ml的野生型PRRSV高致病毒株JX(Genbank号为JX317649，公众可从中国农业大学获得）的病毒液2ml,每个鼻孔1ml。
3、攻毒后的鉴定
1）从步骤2的攻毒后开始，每天观察小猪是否出现咳嗽、呼吸困难、厌食、腹泻、站立不稳、颤抖等临床症状；每两天监测直肠温度；结果如下：
CK组中，接种野生型PRRSV高致病毒株HV后依然出现严重的蓝耳病症状；免疫组中，不管攻以同源毒株—HV，还是异源毒株—JX，小猪都精神状态良好，食欲正常，健康的活到实验结束（图8），实验过程中没有出现发热（图9）、皮肤发绀、厌食等临床症状；
2）从步骤2的攻毒后4、8、12天，采集前腔静脉血，分离血清，检测血清的病毒滴度（方法与实施例2中的步骤2相同），结果如图10所示，经过重组病毒HV-nsp9免疫后，同源毒株和异源毒株的滴度都非常低，大约只有103.2TCID50/ml，比CK组中低了大约1,000倍。
3）从步骤2的攻毒后，当小猪出现不能站立以及停止饮食等症状（等是指皮肤发绀、高热、呼吸困难、咳嗽、厌食、球结膜水肿、颤抖、站立不稳）时进行剖检，其余的健康猪养到攻毒后14天剖检。剖检时观察各个器官的病理变化并取样，用液氮速冻后保存于-80℃用于提取组织总RNA进行实时荧光定量PCR测定组织中的PRRS病毒RNA含量，方法同实施例2的步骤3，结果如图11所示，在各个组织内，经过重组病毒HV-nsp9免疫后的A组和B组中的病毒量都显著低于CK组。
4、攻毒前的鉴定
1）血清中和抗体滴度测定
在免疫后的8、16、24、34天，采集前腔静脉血，分离血清，检测血清中和抗体滴度，结果如图12所示，在免疫后8天，血清中会出现少量的中和抗体，随着时间的延长，中和抗体的滴度逐渐升高。
上述血清中和抗体滴度测定的具体方法如下：
将待测血清在56℃热灭活，用RPMI1640培养液进行2倍梯度稀释，稀释后的体积为50μl,然后分别与50μl的含100TCID50的野生型PRRSV高致病毒株HV的培养液在37℃孵育60分钟，在将该孵育后的混合液100μl接种至含猪PAM的96孔板中，48小时后，使用鼠抗PRRSV N蛋白特异性抗体SDOW-17（购自Rural Technologies）对PRRS病毒进行间接免疫荧光检测，统计病毒阳性孔的数量，计算每毫升病毒液中病毒半数组织感染量(TCID50/ml)。当病毒半数组织感染量与对照（没有加血清只接相同量的病毒的细胞培养孔）相比减少90%时视为被中和，中和抗体滴度取log2值表示。
2）流式细胞术检测血清中特异性CD8+阳性T细胞的反应
在免疫后的34天，从CK组和A组中随机取3只猪，分别抽取外周血，分离淋巴细胞，再分别用毒株HV或者JX(10μg/ml)作为抗原在37℃对淋巴细胞进行再刺激6小时，然后加入浓度为10μg/ml的蛋白转运抑制剂Brefeldin A作用2小时以封闭细胞因子的分泌。400g离心5分钟收集淋巴细胞细胞，用FITC标记的抗CD8α的抗体或者同型对照抗体在4℃染色30分钟。PBS洗细胞一次后用4%的多聚甲醛室温固定细胞20分钟，400g离心5分钟收集细胞。加入用0.1%皂素稀释的RPE标记的抗IFN-γ的抗体或者同型对照抗体在4℃染色过夜。洗涤后将细胞重悬于0.5%多聚甲醛并用流式细胞仪检测，结果用FlowJo软件分析，结果如图13所示是指从没有免疫过的猪体内采血分离的细胞用HV和JX刺激。右上角的百分数值表示IFN-γ和CD8+双阳性的细胞占总的细胞的百分比。）。
与对照组相比，免疫之后，同源和异源抗原的再刺激都能诱导明显的IFN-γ反应。这说明，HV-nsp9的免疫能够诱导小猪产生保护性免疫应答。
步骤1—4的结果说明，HV-nsp9的免疫能够保护动物对于同源和异源高致病性PRRSV的再次感染。
实施例4、重组PRRS病毒具有遗传稳定性和极低的返强可能性
由于现有的PRRSV疫苗的最大问题是其具有返强的可能性，因此开发具有遗传稳定性并且易于与野毒株区分的新一代PRRSV弱毒疫苗迫在眉睫。我们应用密码子对弱化手段致弱高致病性PRRSV，在其致弱过程中有数百个点突变，这使得其可以通过测序的方法与野生型毒株进行区分。同时，由于HV-nsp9的致弱是由数百个点突变引起的，理论上来讲它发生返强的可能性是极低的，并在进一步的实验中得到证实，具体实验方法和结果如下：
在PAM细胞上对HV-nsp9连续传代，传代过程中保持每次接毒量一致，在病毒繁殖过程中观察细胞病变，连续传到第20代。在传代过程中，HV-nsp9病毒的复制能力和诱导细胞病变的能力没有发生明显变化（部分结果如图14所示）；
对第10代和第20代的HV-nsp9中的nsp9基因进行测序，与第一代HV-nsp9的序列比对发现，第10代和第20代的nsp9基因没有发生回复突变，分别计算它们的CPB值发现，与第一代序列相比，CPB值几乎没有发生变化（图15）。
结果表明，HV-nsp9具有遗传稳定性和极低的返强的可能性，具有开发成PRRSV弱毒疫苗的潜力。