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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201410850236.4 (22)申请日 2014.12.31 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 104498410 A (43)申请公布日 2015.04.08 (73)专利权人 西北农林科技大学 地址 712100 陕西省西安市杨凌示范区邰 城路3号 (72)发明人 林雁冰樊妙春赵亮韦革宏 (74)专利代理机构 西安恒泰知识产权代理事务 所 61216 代理人 李婷 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) A01N 63/00(2006。
2、.01) A01P 21/00(2006.01) B09C 1/00(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (56)对比文件 CN 102936574 A,2013.02.20, 位秀丽 等.西北部分重金属矿区天蓝苜蓿 根瘤菌生理生化特性及16S rDNA PCR-RFLP分 析. 干旱地区农业研究 .2009,第27卷(第2期), 全文. 陈雯莉 等.根瘤菌对土壤铜、 锌和镉形态分 配的影响. 应用生态学报 .2003,第14卷(第8 期),全文. 冀玉良 等.陕西商州铅锌尾矿区豆科植物 根瘤菌耐铅锌胁迫能力及其生理生化特征. 干 旱地区农业研究 .2014,第32卷(第4。
3、期),全文. 樊连梅 等.一株抗铜根瘤菌的分离鉴定及 其16SrDNA序列分析. 华北农学报 .2011,第26 卷(第2期),全文. 韦革宏 等.根瘤菌-豆科植物共生体系在重 金属污染环境修复中的地位、 应用及潜力. 微生 物学报 .2010,第50卷(第11期),全文. 审查员 赵鹏 (54)发明名称 一种耐重金属根瘤菌及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种耐重金属根瘤菌， 所述的 根瘤菌为中慢生根瘤菌HZ76， 所述的根瘤菌应用 于促进植物修复重金属污染土壤。 其中中慢生根 瘤菌HZ76菌株的有效菌数为(108109)CFU/mL。 所述的植物修复重金属污染土壤所采用的植物 为刺槐。 。
4、所述的重金属污染土壤中的重金属包括 Cu、 Zn、 Pb和Cd中的一种或多种。 本发明所述的 HZ76菌株能产吲哚乙酸， 有助于促进植物生长。 具有ACC脱氨酶基因， nod、 nif基因， 有助于提高 植物的结瘤率和含氮量。 产铁载体， 有助于提高 植物抗逆性。 利用植物促生细菌促进植物生长， 提高植物重金属Zn、 Pb、 Cu含量， 强化植物提取修 复效率。 权利要求书1页 说明书9页 附图2页 CN 104498410 B 2017.03.29 CN 104498410 B 1.一种耐重金属根瘤菌， 其特征在于： 所述的耐重金属根瘤菌为中慢生根瘤菌 (Mesorhizobium sp.)。
5、HZ76， 保藏编号为： CCTCC NO： M 2014667。 2.如权利要求1所述的耐重金属根瘤菌， 其特征在于： 所述的中慢生根瘤菌HZ76具有 ACC脱氨酶基因。 3.权利要求1所述的耐重金属根瘤菌用于与植物共生修复重金属污染的应用； 所述的重金属污染中的重金属包括Cu、 Zn、 Pb和Cd中的一种或多种； 所述的植物为豆科植物， 所述的豆科植物为草本豆科植物中的苜蓿、 含羞草或苕子， 所 述的豆科植物或者为木本豆科植物中的刺槐、 多花胡枝子或狼牙刺。 4.权利要求1所述的耐重金属根瘤菌用于促进植物生长的应用； 所述的植物为豆科植物， 所述的豆科植物为草本豆科植物中的苜蓿、 含羞草或。
6、苕子， 所 述的豆科植物或者为木本豆科植物中的刺槐、 多花胡枝子或狼牙刺。 5.权利要求1所述的耐重金属根瘤菌用于产ACC脱氨酶基因的应用。 6.权利要求1所述的耐重金属根瘤菌用于提高植物抗逆性的应用； 所述的植物为豆科植物， 所述的豆科植物为草本豆科植物中的苜蓿、 含羞草或苕子， 所 述的豆科植物或者为木本豆科植物中的刺槐、 多花胡枝子或狼牙刺。 7.如权利要求3所述的应用， 其特征在于： 所述的耐重金属根瘤菌配制成液体制剂， 其 中中慢生根瘤菌HZ76菌株的有效菌数为108109CFU/mL。 8.如权利要求3所述的应用， 其特征在于： 所述的Cu的浓度不高于1.4mM， 所述的Zn的浓 。
7、度不高于2.6mM， 所述的Pb的浓度不高于3.0mM， 所述的Cd的浓度不高于0.5mM。 权利要求书 1/1 页 2 CN 104498410 B 2 一种耐重金属根瘤菌及其应用 技术领域 0001 本发明属于农业和环境污染治理领域， 涉及根瘤菌， 具体涉及一种耐重金属根瘤 菌及其应用。 背景技术 0002 重金属在土壤中残留时间长， 危害作用大， 且容易经作物吸收后进入食物链进而 危害人类健康。 因此， 随着土壤重金属污染问题在全球范围内加剧， 如何经济、 高效的控制 并治理土壤污染成为国内外很多相关领域关注的焦点。 植物修复由于其成本低、 简便易行、 安全可靠、 环境友好等诸多优点， 。
8、近年来已成为修复重金属污染环境的重要手段。 然而， 由 于矿区废弃地存在的诸多限制因素， 如土壤贫瘠、 残留重金属浓度较高、 极端酸性、 大量营 养元素的极度缺乏等， 导致绝大所数矿山废弃地缺乏自然植被生长。 0003 根瘤菌是一类固氮微生物， 对土壤氮循环有着重要的作用， 而豆科植物不仅可以 与根瘤菌共生固氮， 从而克服矿区废弃地土壤贫瘠、 营养元素缺乏带来的障碍， 而且其还有 利于防治矿区废弃地风蚀及水蚀造成水土流失。 此外， 越来越多的研究报道发现， 许多抗重 金属的根瘤菌除了具有固氮作用外， 还具有其它促进植物生长的能力， 如分泌植物生长素 IAA、 ACC脱氨酶及产生铁载体等。 因此。
9、， 利用豆科植物-根瘤菌共生体系提高植物的修复效 率， 将是一种行之有效、 环境友好的修复手段。 发明内容 0004 针对现有技术存在的不足， 本发明的目的在于， 提供一种耐重金属根瘤菌， 用于促 进植物修复重金属污染， 使得重金属污染能够尽快去除。 0005 为了解决上述技术问题， 本发明采用如下技术方案予以实现： 0006 一种耐重金属根瘤菌， 所述的耐重金属根瘤菌为中慢生根瘤菌HZ76， 分类命名为 Mesorhizobium sp.HZ76， 保藏编号为： CCTCC NO： M 2014667。 0007 所述的中慢生根瘤菌HZ76具有ACC脱氨酶基因。 0008 如上所述的耐重金属。
10、根瘤菌用于与植物共生修复重金属污染的应用。 0009 如上所述的耐重金属根瘤菌用于促进植物生长的应用。 0010 如上所述的耐重金属根瘤菌用于产ACC脱氨酶基因的应用。 0011 如上所述的耐重金属根瘤菌用于提高植物抗逆性的应用。 0012 优选的， 所述的耐重金属根瘤菌配制成液体制剂， 其中中慢生根瘤菌HZ76菌株的 有效菌数为(108109)CFU/mL。 0013 优选的， 所述的重金属污染中的重金属包括Cu、 Zn、 Pb和Cd中的一种或多种。 0014 更优选的， 所述的Cu的浓度不高于1.4mM， 所述的Zn的浓度不高于2.6mM， 所述的Pb 的浓度不高于3.0mM， 所述的Cd。
11、的浓度不高于0.5mM。 0015 优选的， 所述的植物修复重金属污染所采用的植物为豆科植物， 所述的豆科植物 为草本豆科植物中的苜蓿、 含羞草或苕子， 所述的豆科植物或者为木本豆科植物中的刺槐、 说明书 1/9 页 3 CN 104498410 B 3 多花胡枝子或狼牙刺。 0016 本发明与现有技术相比， 具有如下技术效果： 0017 本发明所述的植物内生细菌HZ76菌株能耐受多种重金属， 重金属Cu、 Zn、 Pb、 Cd的 最小抑制浓度分别为， 1.4mM、 2.6mM、 3.0mM、 0.5mM。 0018 本发明所述的HZ76菌株能产吲哚乙酸， 有助于促进植物生长。 具有ACC脱氨。
12、酶基 因， nod、 nif基因， 有助于提高植物的结瘤率和含氮量。 产铁载体， 有助于提高植物抗逆性 (抗旱、 抗涝、 抗盐碱、 抗病虫害)。 0019 利用植物促生细菌促进植物生长， 提高植物重金属Zn、 Pb、 Cu含量， 强化植物提取 修复效率。 附图说明 0020 图1是不同重金属处理下刺槐地上部和地下部干重(g/盆)。 0021 图2是不同重金属处理下接种中慢生根瘤菌HZ76后刺槐结瘤数目(g/plant)。 0022 以下结合附图对本发明的具体内容作进一步详细解释说明。 具体实施方式 0023 需要说明的是本发明涉及的中慢生根瘤菌HZ76， 分类命名为Mesorhizobium 。
13、sp.HZ76， 该根瘤菌的菌种于2014年12月26日保藏于中国典型培养物保藏中心， 简称CCTCC， 并登记入册， 该生物菌种于2014年12月26日起保存30年。 中慢生根瘤菌HZ76保藏号为： CCTCC NO： M 2014667。 0024 本发明的根瘤菌的分离鉴定方法如下： 0025 中慢生根瘤菌HZ76为植物内生菌， 是从中国陕西省某铅锌冶炼厂区生长的刺槐 (Robinia pseudoacacia)根瘤中分离得到， 经鉴定为Mesorhizobium sp.。 主要生物学特性 为： G-， 幼龄时菌体为杆状， 无芽孢。 在YMA培养基上生长良好， 单个菌落为圆形， 边缘整齐，。
14、 直径12mm， 呈透明状。 0026 选取个大、 饱满的根瘤， 用剪刀将其剪下(带部分根)， 将根瘤放在亲水中浸泡4 5min， 洗去杂质， 再用95乙醇浸泡5min后用0.1的HgCl2表面灭菌5min， 然后用无菌水冲 洗10次。 在无菌操作的情况下， 将单个根瘤菌夹破后在YMA平板(甘露醇10.0g， MgSO47H2O 0.2g， K2HPO4 0.25g， KH2PO4 0.25g， NaCl 0.1g， 酵母粉3.0g， 蒸馏水1000mL， 琼脂1820g) 上划线， 在28培养箱中培养35d， 挑取单菌落在YMA平板上划线纯化后保存。 0027 将菌株接种到5mLTY培养液(。
15、酵母粉5.0g， 胰蛋白胨3g， CaCl20.7g， 蒸馏水1000mL) 中， 28、 150rpm/min震荡48h， 8000rpm/min离心， 每次5min， 收集菌体于1.5mL Eppendorf 管中， 按照CTAB法提取细菌总DNA， PCR扩增细菌的16S rDNA， 扩增产物经测序后与GenBank 中已知16S rDNA序列进行比对分析， 与Mesorhizobium loti的16S rDNA序列相似性达到 99.77， 将其鉴定为这个属。 0028 中慢生根瘤菌HZ76的16S序列： 0029 GCGCGAGCGGCAGACGGGTGAGTAACGCGTGGGAA。
16、TCTACCCATCTCTACGGAACAACTCCGGGAAACTGGAGCTAA TACCGTATACGTCCTTTTGGAGAAAGATTTATCGGAGATGGATGAGCCCGCGTTGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAA 说明书 2/9 页 4 CN 104498410 B 4 TGGCCTACCAAGGCGACGATCCATAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACT CCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGAGTGAT。
17、GAAGG CCCTAGGGTTGTAAAGCTCTTTCAACGGTGAAGATAATGACGGTAACCGTAGAAGAAGCCCCGGCTAACTTCGTGCC AGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGGGCTAGCGTTGTTCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGTAGGCGGATACTTAA GTCAGGGGTGAAATCCCGGGGCTCAACCCCGGAACTGCCTTTGATACTGGGTATCTCGAGTCCGGAAGAGGTGAGTG GAATTCCGAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTCGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCG。
18、GCTCACTGGTCCGGTAC TGACGCTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGGAAGCT AGCCGTTGGCAAGTTTACTTGTCGGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGCTTCCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATT AAAACTCAAAGGAATTTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGCAGAACCT TACCAGCCCTTGACATCCCGGTCGCGGTTTCCAGAGATGGATACCTTC。
19、AGTTCGGCTGGACCGGTGACAGGTGCTGC ATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGCCCTTAGTTGCCAG CATTCAGTTGGGCACTCTAAGGGGACTGCCGGTGATAAGCCGAGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGC CCTTACGGGCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTGGTGACAGTGGGCAGCGAGACCGCGAGGTCGAGCTAATCTCC AAAAGCCATCTCAGTTCGGATTGCACTCTGCAACTC。
20、GAGTGCATGAAGTTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCA TGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTGGTTTTACCCGAAGGCGCT GT。 0030 以下给出本发明的中慢生根瘤菌HZ76的一些性能研究结果： 0031 实验1： 重金属离子对中慢生根瘤菌HZ76的抑制浓度 0032 将中慢生根瘤菌HZ76菌株划线接种于含不同重金属浓度的YMA培养基， 28培养3 5d， 观察其能否生长及生长情况。 结果见表1。 HZ76菌株能耐受多种重金属(Cu、 Zn、 Pb、 Cd 的最小抑制浓度分别。
21、为1.4、 2.6、 3.0、 0.5mM)。 0033 表1菌株在含不同重金属浓度的YMA培养基上的生长情况 0034 0035 注： 上表中 “+” 表示生长，“” 表示不生长。 0036 实验2： 中慢生根瘤菌HZ76能产吲哚乙酸 0037 将有中慢生根瘤菌HZ76接种于盛有5mLTY培养液的试管中， 置于转速150rpm/min， 温度28的摇床培养， 培养3d后， 取根瘤菌悬浮液100 L置于白色塑料比色板上， 加100 L的 比色液(0.5mFeCl3 1mL， H2SO4 30mL， 蒸馏水50mL)， 15min后观察颜色变化。 粉红色为阳性， 表示菌株能够分泌IAA， 粉红色。
22、颜色越深表示分泌IAA能力越大； 无色为阴性， 表示菌株不能 分泌IAA。 结果表明中慢生根瘤菌HZ76能产吲哚乙酸， 其菌液与比色液反应后呈粉红色， 大 小呈+。 0038 实验3： 中慢生根瘤菌HZ76能产铁载体 0039 取0.012g CAS(刃天青)溶于10mLddH2O， 与2mL 1mmol/L FeCl3溶液混合均匀， 得溶 液A； 取0.015gHDTMA(十六烷基三甲基溴化铵)溶于8mLddH2O， 得到溶液B； 将A溶液缓慢加入 B溶液中， 充分混匀， 即得染液C。 10MM9盐溶液： Na2HPO4 30g， KH2PO4 1.5g,， NaCl 2.5g， 说明书 3。
23、/9 页 5 CN 104498410 B 5 NH4Cl 5g， ddH2O 500mL。 把10MM9盐溶液20mL,哌嗪二乙醇磺酸(pipes)6.04g加入盛有 150ml ddH2O的洁净三角瓶中， 混匀后用50NaOH调节pH至6.8， 再加入琼脂粉3.2g， 得到培 养基D。 将染液C、 培养基D及1mmol/LCaCl2、 1mmol/LMgSO47H2O、 20葡萄糖、 10酪蛋白氨 基酸(casamino acids)分别灭菌(115， 20min),置于50水浴锅内保温备用。 分别量取上 述1mmol/L CaCl2 0.2ml， 1mmol/L MgSO47H2O 4m。
24、l， 20葡萄糖2ml， 10酪蛋白氨基酸 6ml加入培养基D中， 再沿瓶壁加入染液C， 充分摇匀(但勿产生气泡)， 即得到蓝色定性检测 培养基。 然后按每皿30ml倒入培养皿中。 用接种环从中慢生根瘤菌HZ76菌株的斜面上挑取 菌苔在上述平板上划线接种， 置于28培养。 观察是否有变色圈出现。 结果表明中慢生根瘤 菌HZ76能产铁载体， 其在培养基上有黄色晕圈出现。 0040 实验4： 中慢生根瘤菌HZ76具有脱氨酶活性 0041 将中慢生根瘤菌HZ76接种YMA固体培养基上培养3d， 挑取单菌落， 制成菌悬液， 用 引物CODEHOPacdS3/r3扩增acdS基因， 如果能扩增出条带， 。
25、表明菌株具有ACC脱氨酶活性； 无 条带表明菌株不能产生ACC脱氨酶。 结果表明， 中慢生根瘤菌HZ76具有ACC脱氨酶基因， 其电 泳检测在670bp具有明显条带， 也即中慢生根瘤菌HZ76具有脱氨酶活性。 0042 实验5： 中慢生根瘤菌HZ76具有固氮结瘤能力 0043 将中慢生根瘤菌HZ76接种YMA固体培养基上培养3d， 挑取单菌落， 制成菌悬液， 分 别扩增菌株的nodA和nifH基因， 如果均能扩增出条带， 表明菌株具有结瘤固氮活性； 均无条 带表明菌株不能与宿主结瘤固氮。 结果表明， 均能扩增出nodA和nifH条带， 表明中慢生根瘤 菌HZ76具有固氮结瘤能力。 0044 以。
26、下给出本发明的中慢生根瘤菌HZ76应用的实验， 中慢生根瘤菌HZ76接种刺槐提 取基质中的铜、 锌、 铅、 隔。 0045 将YMA固体培养基培养72h所得的中慢生根瘤菌HZ76斜面菌种接种于YMA培养基 中， 培养48h后接种于含250mL TY液体培养液的三角瓶(三角瓶个数按照实际对菌液的需求 量确定)中。 置于160rpm/min、 28的摇床上震荡培养， 36h达到菌体对数生长期， 然后 6000rpm/min离心收集菌体。 用灭菌的蒸馏水洗涤菌体两次后， 稀释到108109CFU/mL作为 生物修复制剂。 0046 将蛭石和珍珠岩以重量比2： 1混合得种植基质， 装其入塑料花盆， 每。
27、盆500g。 按照 质量比将四种重金属的母液(CuSO4、 ZnSO4、 CdCl2、 PbNO3母液)分别加入到基质中， 含铜的基 质最终铜浓度为200mg/kg、 400mg/kg， 含锌的基质最终锌浓度为400mg/kg、 800mg/kg， 含铅 的基质最终铅浓度为400mg/kg、 800mg/kg， 含镉的基质最终隔浓度为10mg/kg、 50mg/kg。 0047 选用市售刺槐种子， 先用浓H2SO4浸泡1min， 倒掉液体， 再加入等体积的95乙醇浸 泡1min， 然后用50的次氯酸钠浸泡810min， 用无菌水洗56次， 最后将刺槐种子置于 1.4的水琼脂平板上28催芽。 催。
28、芽36h时， 将长势相同、 饱满的刺槐幼芽移栽到含不同重 金属的基质中， 每盆种植10棵。 0048 接种上述含有中慢生根瘤菌HZ76菌株的稀释液生物修复菌剂， 对照接等量无菌 水。 刺槐生长期间保持基质湿度为田间持水量的60。 播种50d收获， 洗去根部基质， 将植株 分为地上部和地下部， 在105杀青， 70烘干， 称量地上部和地下部干重， 植物样品磨碎后 用硝酸-高氯酸法消煮， 原子吸收分光光度计测定植株中重金属Cu、 Zn、 Pb、 Cd含量。 0049 需要说明的是图1、 图2和表2、 表3、 表4和表5中， CK、 Cd10、 Cd50、 Zn400、 Zn800、 说明书 4/9。
29、 页 6 CN 104498410 B 6 Pb400、 Pb800、 Cu200、 Cu400表示相应重金属在基质中的浓度， 如Cd10表示基质含Cd的浓度 为10mM/kg， 其中CK为没有加重金属的对照处理。 WJ表示不接菌处理， HZ76表示接种中慢生 根瘤菌HZ76。 0050 由图1、 表2可知接种中慢生根瘤菌HZ76处理后， 除Pb800处理外， 刺槐的生物量均 比对照提高， 其地上部干重均比地下部增加显著， CK地上部干重显著增加66， Cd10、 Zn400、 Zn800、 Pb400、 Cu400地上部干重分别显著增加81、 82、 98、 41、 94， Cu200、 C。
30、d50地上部干重显著增加达1.55倍和2倍； 地下部干重只有Zn800显著增加达1.95倍。 0051 由图2可知， 不同重金属的处理下， 中慢生根瘤菌HZ76均能与宿主刺槐结瘤， 表明 HZ76耐受重金属能力强。 由表3可知， 接中慢生根瘤菌HZ76处理后， 除Zn400地下部Zn含量有 增加外， Cd和Zn处理的刺槐地上部和地下部吸收重金属的能力均稍有减弱， 而Pb和Cu处理 的地上部重金属含量均高于对照， 其中Pb800和Cu400吸收重金属的能力是对照的2倍和1.6 倍。 由表4、 表5可知， 除了Cd10外， 接中慢生根瘤菌HZ76菌株处理后， 刺槐富集重金属量均有 增加， 其中Zn。
31、400、 Pb400、 Pb800、 Cu200处理下生物转运系数都超过了1.0， Cu400的生物转运 系数也达0.82， 表明在接表处理后， 刺槐对Zn、 Pb、 Cu均有良好的富集能力。 0052 本发明的根瘤菌还可以应用到促进除了刺槐之外的豆科植物修复重金属污染中， 鉴于篇幅， 在此不一一列出， 仅以刺槐为代表。 用于修复重金属污染土壤的豆科植物分为草 本和木本， 草本豆科植物有： 苜蓿、 含羞草、 苕子等， 木本豆科植物有： 刺槐、 多花胡枝子、 狼 牙刺等。 0053 本发明通过盆栽限菌试验， 确定耐重金属根瘤菌与宿主相互作用后会强化宿主对 何种重金属的富集能力。 该方法为野外实施。
32、操作中植物修复重金属污染土壤提供了一种针 对性较强的策略。 0054 表2不同重金属处理下中慢生根瘤菌HZ76对刺槐的促生效应 说明书 5/9 页 7 CN 104498410 B 7 0055 0056 表3不同重金属处理下中慢生根瘤菌HZ76对刺槐中重金属含量的影响 说明书 6/9 页 8 CN 104498410 B 8 0057 0058 表4不同重金属处理下中慢生根瘤菌HZ76对刺槐富集重金属能力的强化 说明书 7/9 页 9 CN 104498410 B 9 0059 0060 表5不同重金属处理下中慢生根瘤菌HZ76对刺槐生物转运系数的提高 说明书 8/9 页 10 CN 104498410 B 10 0061 说明书 9/9 页 11 CN 104498410 B 11 图1 说明书附图 1/2 页 12 CN 104498410 B 12 图2 说明书附图 2/2 页 13 CN 104498410 B 13 。