《小花清风藤中的一种化合物及其制备方法与应用.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《小花清风藤中的一种化合物及其制备方法与应用.pdf（9页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201711441167.1 (22)申请日 2017.12.27 (71)申请人 江西本草天工科技有限责任公司 地址 330006 江西省南昌市东湖区阳明路 56号 申请人 江西中医药大学 (72)发明人 李志峰冯育林王琦欧阳辉 李俊何明珍杨世林樊东辉 (74)专利代理机构 北京集佳知识产权代理有限 公司 11227 代理人 常亮 (51)Int.Cl. C07H 15/203(2006.01) C07H 1/08(2006.01) A61K 31/704(2006.01) A。
2、61P 1/16(2006.01) (54)发明名称 小花清风藤中的一种化合物及其制备方法 与应用 (57)摘要 本申请属于医药技术领域， 公开了小花清风 藤中的一种化合物及其制备方法与应用。 所述化 合物其为2-甲基-2-羟甲基-5,6-二羟基-7-(3- 甲基-3-羟基-1-丁烯基)-1H-茚-1-酮-3-O-葡萄 糖苷。 本发明所述化合物的制备方法操作简单， 可以分离获得纯的化合物。 实验表明， 本发明所 述化合物可显著降低脂肪酸引起的肝细胞内三 酰甘油含量、 caspase3活力， 升高MDA含量， 降低 肝细胞凋亡率， 可以用于防治非酒精性脂肪肝损 伤。 因此本发明提供了所述化合物在。
3、制备治疗非 酒精性脂肪肝损伤的药物中的应用。 权利要求书2页 说明书6页 CN 108164574 A 2018.06.15 CN 108164574 A 1.一种化合物， 其为2-甲基-2-羟甲基-5,6-二羟基-7-(3-甲基-3-羟基-1-丁烯基)- 1H-茚-1-酮-3-O-葡萄糖苷， 结构式如式I所示， 2.权利要求1所述化合物的制备方法， 其特征在于， 包括以下步骤： (1)取小花清风藤， 加入乙醇溶液提取收集提取液； (2)提取液加入乙醇增溶后去除不溶物， 得到上清液； (3)取步骤(2)得到的上清液经大孔树脂柱， 先用30乙醇-水洗脱5个柱体积， 得到流 份1； 再用50乙醇-。
4、水洗脱5个柱体积， 浓缩， 干燥， 得到流份2； 取流份2经200-300目的硅胶 柱层析， 用二氯甲烷和甲醇的混合溶液依次按体积比20:1、 10:1、 5:1、 2:1梯度洗脱， 每个梯 度洗脱4个柱体积， 共得到16个流份； 取二氯化碳和甲醇的体积比为5:1洗脱的4个流份， 合 并， 经凝胶柱层析， 用甲醇洗脱得到12个流份， 取流份7-9合并， 再经ODS中低压柱层析， 用甲 醇和水的混合溶液依次按体积比1:9、 3:7、 4:6、 5:5、 7:3、 1:0洗脱， 得到5个流份； 取甲醇和 水的混合液体积比为4:6洗脱得到的流份， 用制备高效液相色谱， 色谱条件为： ODS色谱柱， 。
5、甲醇-水19:81为流动相， 保留时间为85min， 分离得到纯的化合物。 3.根据权利要求2所述的制备方法， 其特征在于， 步骤(1)所述的乙醇溶液为5-95 的乙醇水溶液； 所述的提取方法为冷浸法、 渗漉法、 微波提取法、 超声提取法、 回流提取法或 连续回流提取法。 4.根据权利要求2所述的制备方法， 其特征在于， 步骤(1)所述的提取为提取三次， 提取 时间分别为3小时、 2小时、 2小时。 5.根据权利要求2所述的制备方法， 其特征在于， 步骤(2)所述加入乙醇增溶为加入乙 醇使提取物含醇量达5-50浓度范围的溶液。 6.根据权利要求2所述的制备方法， 其特征在于， 步骤(3)所述的。
6、大孔树脂为AB-8、 D101、 HP-20、 XAD-4、 HPD100、 DM301、 HPD400型树脂； 所述上清液与树脂体积比为1:2。 7.权利要求1所述化合物在制备治疗非酒精性脂肪肝损伤的药物中的应用。 8.根据权利要求1所述应用， 其特征在于， 所述非酒精性脂肪肝损伤为脂肪酸引起的肝 损伤。 9.一种药物制剂， 其特征在于： 包括治疗有效量的权利要求1所述化合物及其药学上可 权利要求书 1/2 页 2 CN 108164574 A 2 接受的载体。 10.根据权利要求9所述的药物制剂， 其特征在于， 其为口服制剂或注射制剂。 权利要求书 2/2 页 3 CN 108164574。
7、 A 3 小花清风藤中的一种化合物及其制备方法与应用 技术领域 0001 本发明属于医药技术领域， 具体涉及小花清风藤中的一种化合物及其制备方法与 应用， 尤其是涉及在制备治疗非酒精性脂肪肝损伤的药物中的应用。 背景技术 0002 非酒精性脂肪肝(NAFLD)又称非酒精性脂肪性肝病、 假性酒精性肝病， 是一种肝组 织学改变与酒精性肝病相类似， 但无过量饮酒史的临床病理综合征， 其病理变化随病程的 进展而表现有单纯性脂肪肝、 脂肪性肝炎、 脂肪性肝纤维化和肝硬化。 随着肥胖及其相关代 谢综合征全球化的流行趋势， 非酒精性脂肪性肝病现已成为欧美等发达国家和我国富裕地 区慢性肝病的重要病因， 普通成。
8、人NAFLD患病率1030， 其中1020为非酒精性脂 肪性肝炎(NASH)， 后者10年内肝硬化发生率高达25。 0003 非酒精性脂肪性肝病除可直接导致失代偿期肝硬化、 肝细胞癌和移植肝复发外， 还可影响其他慢性肝病的进展， 并参与2型糖尿病和动脉粥样硬化的发病。 代谢综合征相关 恶性肿瘤、 动脉硬化性心脑血管疾病以及肝硬化为影响非酒精性脂肪性肝病患者生活质量 和预期寿命的重要因素。 为此， 非酒精性脂肪性肝病是当代医学领域的新挑战， 近期内非酒 精性脂肪性肝病对人类健康的危害仍将不断增加。 0004 小花清风藤为清风藤科清风藤属藤本植物小花清风藤Sabia parviflora Wall。
9、.ex Roxb.的干燥茎。 贵州产小花清风藤为布依族、 苗族的民间药， 主要分布在贵州的 兴义市、 安龙县、 册亨县、 望谟县等地， 其根茎、 叶均可入药， 有祛风除湿、 消炎止痛、 清热利 湿、 止血的作用， 用于湿热黄疸， 外伤出血， 治疗甲型和乙型病毒性肝炎疗效显著， 且副作用 小。 小花清风藤其相关品种， 临床多用于肝脏部位的相关疾病， 然而， 目前小花清风藤中主 要活性成分不明， 其肝部疾病的作用物质仍不清楚。 发明内容 0005 本发明的目的是对小花清风藤的化学成分进行深入研究， 提供小花清风藤中的一 种化合物及其制备方法与应用。 0006 小花清风藤中的一种化合物， 其为2-甲。
10、基-2-羟甲基-5,6-二羟基-7-(3-甲基-3- 羟基-1-丁烯基)-1H-茚-1-酮-3-O-葡萄糖苷， 结构式如式I所示， 说明书 1/6 页 4 CN 108164574 A 4 0007 0008 本发明还提供了式I所示化合物的制备方法， 包括以下步骤： 0009 (1)取小花清风藤， 加入乙醇溶液提取收集提取液； 0010 (2)提取液加入乙醇增溶后去除不溶物， 得到上清液； 0011 (3)取步骤(2)得到的上清液经大孔树脂柱， 先用30乙醇-水洗脱5个柱体积， 得 到流份1； 再用50乙醇-水洗脱5个柱体积， 浓缩， 干燥， 得到流份2； 取流份2经200-300目的 硅胶柱。
11、层析， 用二氯甲烷和甲醇的混合溶液依次按体积比20:1、 10:1、 5:1、 2:1梯度洗脱， 每 个梯度洗脱4个柱体积， 共得到16个流份； 取二氯化碳和甲醇的体积比为5:1洗脱的4个流 份， 合并， 经凝胶柱层析， 用甲醇洗脱得到12个流份， 取流份7-9合并， 再经ODS中低压柱层 析， 用甲醇和水的混合溶液依次按体积比1:9、 3:7、 4:6、 5:5、 7:3、 1:0洗脱， 得到5个流份； 取 甲醇和水的混合液体积比为4:6洗脱得到的流份， 用制备高效液相色谱， 色谱条件为： ODS色 谱柱， 甲醇-水19:81为流动相， 保留时间为85min， 分离得到纯的化合物。 0012。
12、 其中， 作为优选， 步骤(1)所述的乙醇溶液为5-95的乙醇水溶液。 更优选为 70乙醇水溶液。 0013 作为优选， 本发明所述制备方法中所述的提取方法为冷浸法、 渗漉法、 微波提取 法、 超声提取法、 回流提取法或连续回流提取法。 0014 作为优选， 步骤(1)所述的提取为提取三次， 提取时间分别为3小时、 2小时、 2小时。 0015 小花清风藤提取后的提取液过滤， 合并提取液， 减压浓缩至无醇味， 得到提取物。 0016 作为优选， 步骤(2)所述加入乙醇增溶为加入乙醇使提取物含醇量达5-50浓 度范围的溶液。 更优选为使提取物含醇量达20浓度范围的溶液。 0017 作为优选， 步。
13、骤(3)所述的大孔树脂为AB-8、 D101、 HP-20、 XAD-4、 HPD100、 DM301、 HPD400型树脂。 0018 作为优选， 所述上清液与树脂体积比为1:2。 0019 实验表明， 本发明式I所示化合物可显著降低脂肪酸引起的肝细胞内三酰甘油含 量、 caspase3活力， 升高MDA含量， 降低肝细胞凋亡率。 因此本发明提供了式I所示化合物在 制备治疗非酒精性脂肪肝损伤的药物中的应用。 0020 作为优选， 所述非酒精性脂肪肝损伤为脂肪酸引起的肝损伤。 说明书 2/6 页 5 CN 108164574 A 5 0021 本发明还提供了一种药物制剂， 包括治疗有效量的式I。
14、所示化合物及其药学上可 接受的载体。 0022 本领域技术人员可将所述式I所示化合物直接或间接加入制备不同剂型时所需的 药学上可接受的各种常用辅料， 如填充剂、 崩解剂、 润滑剂、 粘合剂等， 以常规药物制剂方 法， 制成常用口服制剂或注射制剂。 0023 优选的， 所述口服制剂为片剂、 胶囊剂、 颗粒剂、 脂肪乳剂、 微囊、 滴丸。 0024 优选的， 所述注射制剂为注射液或粉针剂。 0025 由上述技术方案可知， 本发明提供了小花清风藤中的一种化合物及其制备方法与 应用。 所述化合物其为2-甲基-2-羟甲基-5,6-二羟基-7-(3-甲基-3-羟基-1-丁烯基)-1H- 茚-1-酮-3-O。
15、-葡萄糖苷。 本发明所述化合物的制备方法操作简单， 可以分离获得纯的化合 物。 实验表明， 本发明所述化合物可显著降低脂肪酸引起的肝细胞内三酰甘油含量、 caspase3活力， 升高MDA含量， 降低肝细胞凋亡率， 可以用于防治非酒精性脂肪肝损伤。 因此 本发明提供了所述化合物在制备治疗非酒精性脂肪肝损伤的药物中的应用。 具体实施方式 0026 本发明公开了小花清风藤中的一种化合物及其制备方法与应用。 本领域技术人员 可以借鉴本文内容， 适当改进工艺参数实现。 特别需要指出的是， 所有类似的替换和改动对 本领域技术人员来说是显而易见的， 它们都被视为包括在本发明。 本发明的方法及产品已 经通过。
16、较佳实施例进行了描述， 相关人员明显能在不脱离本发明内容、 精神和范围内对本 文所述的方法进行改动或适当变更与组合， 来实现和应用本发明技术。 0027 为了进一步理解本发明， 下面将结合本发明实施例， 对本发明实施例中的技术方 案进行清楚、 完整地描述， 显然， 所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例， 而不是全部 的实施例。 基于本发明中的实施例， 本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所 获得的所有其他实施例， 都属于本发明保护的范围。 0028 如无特殊说明， 本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品， 均可以通过商业渠 道购买获得。 0029 实施例1、 小花清风藤中的新化合物的。
17、制备方法 0030 (1)取干燥的小花清风藤药材， 加入12倍量的浓度70乙醇， 回流提取三次， 时间 分别为3小时、 2小时、 2小时， 过滤， 合并提取液， 减压浓缩至无醇味， 得到提取物； 0031 (2)取步骤(1)的提取物加入乙醇使含醇量为20， 用离心机离心除去不溶物， 得 到上清液。 0032 (3)取步骤(2)得到的上清液经HP-20型大孔树脂柱吸附(药材:树脂1:2吸附)， 先用30乙醇-水洗脱5个柱体积， 得到流份1； 再用50乙醇-水洗脱5个柱体积， 浓缩， 干 燥， 得到流份2。 取流份2经200-300目的硅胶柱层析， 用二氯甲烷和甲醇的混合液依次按体 积比20:1、。
18、 10:1、 5:1、 2:1梯度洗脱， 每个浓度洗脱4个柱体积， 每个体积接4个流份， 每个流 份500ml， 共得到16个流份， 反复经硅胶柱层析(二氯甲烷、 甲醇)， 得到16个流份， 取二氯化 碳和甲醇的体积比为5:1洗脱的4个流份， 合并， 经凝胶柱层析， 用甲醇洗脱10次， 依次得到 12个流份， 每个流份50ml， 取流份7-9合并， 再经ODS中低压柱层析， 用甲醇和水的混合液依 次按体积比1:9、 3:7、 4:6、 5:5、 7:3、 1:0(纯甲醇)洗脱， 取甲醇和水的混合液体积比为4:6洗 说明书 3/6 页 6 CN 108164574 A 6 脱得到的流份， 最后用。
19、制备高效液相色谱， 色谱条件为： ODS色谱柱， 乙腈-水19:81为流动 相， 保留时间为85min， 分离得到纯的化合物(收率1128mg， 纯度99.5)。 0033 化合物的结构解析： 主要利用光谱技术， 包括紫外、 红外、 质谱、 核磁共振(1H-NMR 、 13C-NMR、 2D-NMR)鉴定其结构， 再经TOF高分辨质谱精确确定其分子量及分子式。 0034 其波谱数据及解析过程如下： 0035 (1)白色无定形粉末， 高分辨率质谱ESI-TOF-MS： 483.1936M-H-， 确定分子式为 C23H32O11， NMR谱中 C:200.5(C-1)， 表明结构中存在羰基； C。
20、:17.3， 27.2， 27.0， H:1.14， 1.50， 1.52(each 3H,s)为三个甲基信号， C:120.8， 141.7， 149.7， 136.1， 120.8， 121.1， H: 7.50(1H,s)， 表明结构有一个五取代苯环， C:120.8(C-11)， 130.8(C-12)， H:6.43(1H,d,J 9.7Hz,H-11),5.80(1H,d,J9.9Hz,H-12)， 表明结构有一个顺式双键， C:103.5,72.5, 76.6,70.1,76.9,61.3， 表明结构中有一个葡萄糖基团。 然后结合HMBC、 HSQC等二维核磁共 振波谱数据， 确。
21、定化合物的最终结构， 结构式如式I所示， 化学名为2-甲基-2-羟甲基-5,6- 二羟基-7-(3-甲基-3-羟基-1-丁烯基)-1H-茚-1-酮-3-O-葡萄糖苷。 0036 0037 波谱数据如下： 0038 1H NMR(600MHz,CD3OD) :1.14， 1.50， 1.52(each,3H,s,-CH3),3.52(1H,dd,J 9.2,7.6Hz,H-3),3.62(1H,d,J4.3Hz,H-4a),3.58(1H,d,J4.3Hz,H-4b),4.02(1H,d,J 11.0Hz,H-10a),3.82(1H,d,J11.0Hz,H-10b),6.43(1H,d,J9.。
22、7Hz,H-11),5.80(1H, d,J9.9Hz H-12),7.18(1H,s,H-7),7.20(1H,d,J7.2Hz,H-1 ),4.29(1H,t,J3.8Hz, H-2 ),3.46(1H,m,H-3 ),3.27(1H,m,H-4 ),3.21(1H,m,H-5 ),3.79(1H,m,H-6 a),3.67 (1H,m,H-6 b)； 0039 13C NMR(150MHz,CD3OD):200.5(C-1),120.8(C-1a),50.2(C-2),74.3(C-3),28.5 (C-4),121.1(C-4a),141.7(C-5),149.7(C-6),136.1。
23、(C-7),120.8(C-8),17.3(C-9),64.8 (C-10),120.8(C-11),130.8(C-12),78.1(C-13),27.2,27.0(C-14,15),103.5(C-1 ),72.5 (C-2 ),76.6(C-3 ),70.1(C-4 ),76.9(C-5 ),61.3(C-6 )。 0040 实施例2、 药效实验研究 0041 一、 实验材料与动物 0042 1.药物和试剂 说明书 4/6 页 7 CN 108164574 A 7 0043 人正常肝细胞株L-02细胞(上海慧颖生物科技有限公司)， 胎牛血清(杭州四季青 生物工程材料有限公司)， RPMI。
24、 Medium 1640培养基(Solarbio公司)， 油酸(OA,O7501)、 棕 榈酸(PA,P9767)均购自SIGMA公司， 生化检测试剂盒(南京建成生物工程研究所有限公司)， 胰酶-EDTA消化液(Solarbio公司)。 0044 2.实验仪器 0045 倒置显微镜(Olympus-ckx41)， 生物安全柜(Heal Force)， AL204型电子分析天平 (Mettler Toledo仪器(上海)有限公司)， MTV-100型多管漩涡混合仪(杭州奥盛仪器有限公 司)。 0046 3.受试药物及处理方法 0047 取实施例1制备得到的化合物， 加DMSO稀释成浓度为0.1m。
25、mol/ml的溶液。 0048 二、 实验方法 0049 1.细胞培养 0050 L-02细胞用含有5胎牛血清的1640培养液， 于37、 含5CO2的培养箱中培养 48h， 细胞7080融合时用于实验。 0051 2.FFAs混合物(游离脂肪酸混合物)及实施例1制备得到的化合物处理细胞 0052 将油酸或棕榈酸溶解于异丙醇中， 制备为500mmol/L的储存液。 将细胞接种于96孔 板中， 每孔约5000个细胞， 培养24h， 吸去旧的培养基， 然后将细胞随机分成5组： 空白组、 模 型组(250mmol/L FFAs， 油酸 棕榈酸2 1)， 给药组(高、 中、 低剂量)， 每组6个复孔，。
26、 空白组 加100 l新鲜培养液(含有5胎牛血清的1640培养液)， 模型组及给药组加入100 l含有 250mmol/LFFAs的培养液， 继续培养24h， 吸去培养液， 空白组及模型组加100 l新的培养液， 给药高、 中、 低剂量组分别加入100 l含有15， 30， 60 mol/L的实施例1制备得到的化合物的 培养液， 继续培养24h。 0053 3.生化指标测定 0054 收集各处理组细胞， 组织细胞酶法测定肝细胞三酰甘油含量， 巴比妥酸法测定肝 细胞丙二醛(malondialdehyde， MDA)含量， 分光光度计法测定肝细胞半胱氨酸蛋白酶3 (casepase3)活力。 具体。
27、操作步骤按试剂盒说明书进行。 0055 4.肝细胞凋亡检测 0056 细胞于最后培养24h后每孔加入10 lMTT(5mg/ml)， 继续培养4h后， 吸去培养液， 加 入150 lDMSO， 用酶标仪测定490n下的吸光度。 0057 5.统计学方法 0058实验数据以表示， 使用SPSS 19.0统计软件进行t检验比较， P0.05为有统计 学意义。 0059 三、 实验结果 0060 1.实施例1制备得到的化合物对肝细胞内三酰甘油含量、 caspase3活力、 MDA的影 响， 结果见表1。 0061表1对肝细胞内三酰甘油含量、 caspase3活力、 MDA的影响 0062 组别三酰甘。
28、油( mol/L protein)caspase3活力(U/g protein)MDA(mg/g) 空白组39.94.82.460.330.890.01 说明书 5/6 页 8 CN 108164574 A 8 模型组306.354.05.380.640.540.03 给药组(低)254.838.7*5.010.37*0.680.02* 给药组(中)231.236.5*4.540.47*0.710.05* 给药组(高)190.250.3*4.050.54*0.820.03* 0063 注： *代表与模型组相比较， 差异显著(*P0.05) 0064 结果显示， 肝细胞内三酰甘油含量， 给药组较。
29、模型组显著降低(P0.05)。 而肝细 胞caspase3活力， 给药组较模型组显著降低(P0.05)。 MDA含量给药组较模型组显著升高。 0065 2.实施例1制备得到的化合物对肝细胞凋亡的影响， 结果见表1。 0066 表2对肝细胞凋亡率的影响 0067 组别凋亡率 空白组0 模型组45.2 给药组(低)34.2* 给药组(中)28.6* 给药组(高)23.9* 0068 注： *代表与模型组相比较， 差异显著(*P0.05) 0069 结果显示， 肝细胞凋亡率给药组较模型组显著降低。 0070 以上实验结果表明， 本发明实施例1制备得到的化合物可显著降低脂肪酸引起的 肝细胞内三酰甘油含量、 caspase3活力， 升高MDA含量， 降低肝细胞凋亡率。 因此， 可以开发 成为用于防治非酒精性脂肪肝损伤的药物或保健品。 说明书 6/6 页 9 CN 108164574 A 9 。