技术领域
本发明涉及一种1，2，3-三氮唑类氨肽酶N抑制剂及其制备方法和应用，属于有机化合物合成与医药应用技术领域。
背景技术
氨肽酶N(APN，CD13)是锌离子依赖性金属蛋白酶，参与底物N端氨基酸的降解，以同源二聚体的形式存在于细胞膜，研究证明，氨肽酶N在肿瘤发生、发展、侵袭转移、凋亡及肿瘤血管生成中发挥重要的作用。(1)氨肽酶N在肿瘤细胞表面高水平表达。该酶可降解细胞外基质，从而促进肿瘤细胞侵袭与转移。肿瘤转移是肿瘤难以治愈的一个重要原因。细胞外基质在维持细胞连接的稳定性和细胞间信号传导中起着非常重要的作用。(2)氨肽酶N能够刺激血管内皮细胞释放肿瘤微血管形成相关因子，促进肿瘤细胞血管生成。新生血管能够为肿瘤组织提供营养支持，并运走代谢废物。APN在新生血管内皮细胞和亚内皮细胞高表达，可方便内皮细胞入侵周围其他组织。血管生成是肿瘤生长和转移的第一步。(3)氨肽酶N(CD13)是肿瘤干细胞的表面标志物，与肝癌干细胞的生存有着重大关系(J Clin Invest2010,120(9),3326-3339)。肿瘤干细胞是导致肿瘤化疗耐药、复发和转移的重要原因。(4)APN参与T淋巴细胞依赖的炎症反应。能够表达于抗原递呈细胞表面，降解免疫活性物质(如白介素-8)；还降低了T细胞表面对其抗原的识别能力，同时削弱了巨噬细胞和NK细胞对肿瘤细胞的识别和杀伤能力，使机体免疫力下降。
乌苯美司是至今为止唯一一个上市的药物，具有β-氨基酸的类二肽结构，作为免疫增强剂用于白血病的治疗。其是从橄榄网状链霉菌(Streptomyces olivorecticuli)的培养液中分离得到的，全合成代价昂贵，因而来源有限。现在已经报道的APN抑制剂，大多数为肽，对体内酶的降解比较敏感，由于体内多种氨肽酶、羧基肽酶或者二肽肽酶的存在，选择性差，很难开发成具有临床应用价值的氨肽酶N抑制剂。另外，肽类抑制剂由于含有多个手性中心，合成难度大，大多来源于天然产物，来源的有限不利于深入的科学研究和将来的大规模生产。因此，开发有效的易合成的氨肽酶N抑制剂显得非常有必要。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种1，2，3-三氮唑类氨肽酶N抑制剂及其制备方法，本发明还提供该化合物的制药用途。
本发明的技术方案为：
一、1，2，3-三氮唑类氨肽酶N抑制剂
具有如下通式(I)或(II)所示结构的化合物，以及其光学异构体、非对映异构体和消旋体混合物，其药学上可接受的盐，溶剂合物或前药：
其中，
X是脂肪烃基，芳香烃基；
R1是芳基，取代芳基，杂芳基，取代杂芳基，杂环基，取代杂环基；
*是S或R构型，或其消旋体。
根据本发明优选的，
其中：X是
R1是苯基，取代苯基，吡啶基，萘基；
*是S构型。
根据本发明进一步优选的，上述化合物为下列之一：
二、1，2，3-三氮唑类氨肽酶N抑制剂的制备方法
本发明的1，2，3-三氮唑类氨肽酶N抑制剂的制备方法为如下之一：
(1)具有通式(I)或(II)结构的化合物的制备方法如下：
1)亮氨酸甲酯盐酸盐1与三光气反应生成异氰酸酯，然后与炔丙胺在碱性条件下生成中间体2，后与羟胺钾反应生成中间体3；不同醛4经过硼氢化钠还原、甲磺酰化、叠氮钠亲核取代生成中间体7；不同取代的芳胺9经过重氮化、叠氮钠亲核取代，生成中间体10(10a-10v)；2-硝基苯甲醛12经过硼氢化钠还原、硫化钠还原生成中间体14；然后经过重氮化、叠氮钠亲核取代，生成中间体15；中间体15与不同酰氯酰化生成中间体10(10aa-10ii)；中间体7或10分别与中间体3发生click反应，生成目标化合物8或11；反应式1如下：
上述反应式1中的试剂和条件：(a)三光气，碳酸氢钠，二氯甲烷，水，0℃，1.5小时；(b)炔丙胺，三乙胺，二氯甲烷，25℃，12小时；(c)羟胺钾，甲醇，25℃，0.5小时；(d)硼氢化钠，甲醇，0℃，1小时；(e)甲基磺酰氯，二氯甲烷，三乙胺，0℃，12小时；(f)叠氮钠，N’N-二甲基甲酰胺，25℃，12小时；(g)中间体3，五水硫酸铜，抗坏血酸钠，体积比4：1的二甲基亚砜/水，25℃，2小时；(h)i：亚硝酸钠，质量分数3.7％盐酸，0℃，0.5小时，ii：叠氮钠，0℃，0.5小时；(i)硫化钠，水，100℃，3小时；(j)各种酰氯，三乙胺，无水四氢呋喃，50℃，3小时。
(2)具有通式(I)结构的化合物的制备方法如下：
醛或酮16经过硼氢化钠还原、甲磺酰化，叠氮钠亲核取代生成中间体19；中间体19与中间体3发生click反应生成目标化合物20；反应式2如下：
上述反应式2中的试剂和条件：(a)硼氢化钠，甲醇，0℃，1小时；(b)甲基磺酰氯，二氯甲烷，三乙胺，0℃，12小时；(c)叠氮钠，N’N-二甲基甲酰胺，25℃，12小时；(d)中间体3，五水硫酸铜，抗坏血酸钠，体积比4：1的二甲基亚砜/水，25℃，2小时。
根据本发明优选的，具有通式I结构的化合物的制备方法如下：
化合物8a-8w，8aa-8ii和20a-20e的制备，以化合物8a为例。
(S)-2(3-((1-苄基-1H-1，2，3-三唑-4-基)甲基)脲基)-N-羟基-4-甲基戊酰胺(8a)的制备方法，步骤如下：
1)甲基(丙-2-炔基-1-基氨基甲酰基)-L-亮氨酸(2)的制备
L-亮氨酸甲酯盐酸盐1 1.81g溶解于二氯甲烷40mL和饱和碳酸氢钠40mL的混合溶剂中，分次加入三光气0.98g，0℃下反应1.5小时，分取有机相，无水硫酸镁干燥15分钟，滤过，0℃下，滤液滴加到炔丙胺0.55g和三乙胺1.21g的无水二氯甲烷溶液100mL中，滴毕，25℃反应12小时；浓缩，残渣溶于乙酸乙酯100mL，质量分数3.7％盐酸100mL洗三次，饱和碳酸氢钠100mL洗三次，饱和氯化钠100mL洗三次，无水硫酸镁干燥过夜，滤过，浓缩，得到粗品；粗品用乙酸乙酯/石油醚重结晶，得到白色固体1.87g，收率：83％；
2)(S)-N-羟基-4-甲基-2-(3-(丙-2-炔基-1-基)脲基)丙酰胺(3)的制备
羟胺钾甲醇溶液的制备：氢氧化钾28.00g和盐酸羟胺23.35g分别溶于70mL和120mL的重蒸甲醇中，获得溶液A和溶液B；溶液A滴加到溶液B中，0℃下搅拌40分钟；滤过，得到新制的羟胺钾的甲醇溶液；化合物2 2.26g溶解于上述溶液20mL，25℃反应0.5小时，浓缩，残渣溶于水，质量分数3.7％盐酸调pH至6；乙酸乙酯100mL萃取三次，合并有机相，有机相用饱和碳酸氢钠100mL洗三次，饱和氯化钠100mL洗三次，无水硫酸镁干燥，滤过，浓缩；残渣加入二氯甲烷50mL，-18℃放置过夜，析出固体，滤过，真空干燥，得到白色固体1.20g，收率：53％；
3)苯甲醇(5a)的制备
苯甲醛4a 1.06g溶于甲醇10mL，0℃下分次加入硼氢化钠0.57g，0℃下反应1小时，浓缩，残渣溶于乙酸乙酯100mL；有机相用水100mL洗三次，饱和氯化钠100mL洗三次，无水硫酸镁干燥，滤过，浓缩，得到无色油2.01g，粗品不经过进一步纯化，直接投入下一步反应；
化合物5b-5w，5aa-5ii和17a-17e的制备方法与化合物5a类似；
4)苄基甲磺酸酯(6a)
化合物5a 1.08g和三乙胺1.52g溶解于无水二氯甲烷100mL，0℃下滴加入甲磺酰氯1.36g的无水二氯甲烷20mL溶液，0℃下反应12小时，浓缩，残渣溶于乙酸乙酯100mL，质量分数3.7％盐酸100mL洗三次，饱和碳酸氢钠100mL洗三次，饱和氯化钠100mL洗三次，无水硫酸镁干燥过夜，浓缩，得到黄色油1.77g；粗品不经过进一步纯化，直接投入下一步反应；
化合物6b-6w，6aa-6ii和18a-18e的制备方法与化合物6a类似；
5)叠氮基甲基苯(7a)
化合物6a 1.86g溶于N’N-二甲基甲酰胺10mL，分次加入叠氮钠0.72g，25℃反应12小时，反应液倾入冰水中，乙酸乙酯100mL萃取三次，有机相用水100mL洗三次，饱和氯化钠100mL洗三次，无水硫酸镁干燥过夜，浓缩，得到无色油1.18g，粗品不经过进一步纯化，直接投入下一步反应；
化合物7b-7w，7aa-7ii和19a-19e的制备方法与化合物7a类似；
6)((S)-2(3-((1-苄基-1H-1，2，3-三唑-4-基)甲基)脲基)-N-羟基-4-甲基戊酰胺(8a)
化合物3 0.45g和化合物7a 0.29g溶解于二甲基亚砜16mL，加入抗坏血酸钠59.4mg的水2mL溶液和五水硫酸铜25mg的水2mL溶液，25℃反应2小时，反应液倾入水中，乙酸乙酯100mL萃取三次，合并有机相，饱和氯化钠100mL洗三次，无水硫酸镁干燥过夜，浓缩得到无色油；残渣溶于二氯甲烷20mL，25℃搅拌2小时，生成的沉淀滤过，得到白色固体0.35g，收率：48％；
化合物8b-8w，8aa-8ii和20a-20e的制备方法与化合物8a类似。
根据本发明优选的，具有通式II结构的化合物的制备方法如下：
(1)化合物11a-11v的制备方法，以化合物11a为例。
(S)-N-羟基-4-甲基-2-(3-((1-苯基-1H-1，2，3-三唑-4-基)甲基)脲基)戊酰胺(11a)的制备方法，步骤如下：
1)叠氮基苯(10a)
苯胺9a 0.93g溶于质量分数3.7％盐酸，0℃下加入亚硝酸钠0.74g，0℃反应0.5小时，然后加入叠氮钠0.72g，0℃继续反应0.5小时，乙酸乙酯50mL萃取三次，有机相无水硫酸镁干燥，滤过，浓缩，得到黄色油，粗品不经过进一步纯化，直接投入下一步反应；
化合物10b-10v的制备方法与化合物10a类似；
2)(S)-N-羟基-4-甲基-2-(3-((1-苯基-1H-1，2，3-三唑-4-基)甲基)脲基)戊酰胺(11a)
化合物3 0.45g和化合物10a 0.26g溶于二甲基亚砜16mL，加入抗坏血酸钠59.4mg的水2mL溶液和五水硫酸铜25mg的水2mL溶液，25℃反应2小时，反应液倾入水中，乙酸乙酯100mL萃取三次，合并有机相，饱和氯化钠100mL洗三次，无水硫酸镁干燥过夜，浓缩得到无色油，残渣溶于二氯甲烷20mL，25℃搅拌2小时，生成的沉淀滤过，得到白色固体0.33g，收率：47％。
化合物11b-11v的制备方法与化合物11a类似。
(2)化合物11aa-11ii的制备方法，以化合物11aa为例。
(S)-2-(4-((3-(1-羟胺基)-4-甲基-1-氧代戊烷-2-基)脲基)甲基)-1H-1，2，3-三唑-1-基)苄基乙酸酯(11aa)的制备方法，步骤如下：
1)(2-硝基苯基)甲醇(13)
2-硝基苯甲醛12 1.51g溶于甲醇10mL，0℃下分次加入硼氢化钠0.57g，0℃下反应1小时，浓缩，残渣溶于乙酸乙酯100mL，有机相用水50mL洗三次，饱和氯化钠50mL洗三次，无水硫酸镁干燥过夜，滤过，浓缩得到黄色固体1.45g，粗品不经过进一步纯化，直接投入下一步反应；
2)(2-氨基苯基)甲醇(14)
化合物13 1.53g加入到硫化钠21.60g的水100mL溶液，100℃反应3小时，水相用乙酸乙酯50mL萃取三次，有机相用水50mL洗三次，饱和氯化钠50mL洗三次，无水硫酸镁干燥过夜，滤过，浓缩，得到白色固体1.05g，粗品不经过进一步纯化，直接投入下一步反应；
3)(2-叠氮基苯基)甲醇(15)
化合物14 1.23g溶于质量分数3.7％盐酸，0℃下加入亚硝酸钠0.74g，0℃反应0.5小时，然后加入叠氮钠0.72g，0℃继续反应0.5小时，乙酸乙酯50mL萃取三次，有机相无水硫酸镁干燥，滤过，浓缩，得到黄色油，粗品不经过进一步纯化，直接投入下一步反应；
4)2-叠氮基苄基乙酸酯(10aa)
化合物15 1.49g和三乙胺1.51g溶于无水四氢呋喃50mL，0℃滴加乙酰氯0.94g的无水四氢呋喃10mL溶液，50℃反应3小时，浓缩，残渣溶于乙酸乙酯50mL，有机相用质量分数3.7％盐酸50mL洗三次，饱和碳酸氢钠洗三次，饱和氯化钠洗三次，无水硫酸镁干燥过夜，滤过，浓缩，得到黄色油状物1.07g，粗品不经过进一步纯化，直接投入下一步反应；
化合物10bb-10ii的制备方法与化合物10aa类似；
5)(S)-2-(4-((3-(1-羟胺基)-4-甲基-1-氧代戊烷-2-基)脲基)甲基)-1H-1，2，3-三唑-1-基)苄基乙酸酯(11aa)
化合物3 0.45g和化合物10aa 0.42g溶于二甲基亚砜16mL，加入抗坏血酸钠59.4mg的水2mL溶液和五水硫酸铜25mg的水2mL溶液，25℃反应2小时，反应液倾入水中，乙酸乙酯100mL萃取三次，合并有机相，饱和氯化钠100mL洗三次，无水硫酸镁干燥过夜，浓缩得到无色油，残渣溶于二氯甲烷20mL，25℃搅拌2小时，生成的沉淀滤过，真空干燥，得到白色固体0.44g，收率：53％。
化合物11bb-11ii的制备方法与化合物11aa类似。
反应式1的目标化合物结构式如下：
反应式2的目标化合物结构式如下：
所述化合物的具体操作步骤在实施例中将加以详细说明。
本领域技术人员可以对上述步骤进行变动以提高收率，他们可根据本领域的基本知识确定合成路线，如选择反应物，溶剂和温度，可以通过使用各种常规保护基以避免副反应的发生从而提高效率。这些常规的保护方法可参见例如T.Greene，Protecting Groups in Organic Synthesis。
三、1，2，3-三氮唑类氨肽酶N抑制剂的用途
本发明还提供了1，2，3-三氮唑类氨肽酶N抑制剂在制备预防或治疗与氨肽酶活性异常相关的疾病的药物中的应用；所述的与氨肽酶活性异常相关的疾病包括：各种血液瘤或实体瘤，炎症，多发性硬化症，各种组织溃疡或组织溃疡性病症，牙周病，大疱性表皮松懈症，疟疾。
此外，本发明还包括一种适于口服或胃肠外给药的药物组合物，包含通式I或II所述的化合物和一种或多种药学上可接受载体或赋形剂。
附图说明
图1是抑制人脐静脉内皮细胞管状结构形成的代表性图片。
图2是抑制管状结构形成的抑制率柱形图；统计学分析，*P<0.05，8v(100μM)组对乌苯美司(100μM)组。
图3是抑制大鼠主动脉环微血管生成的代表性图片。
图4是抑制大鼠主动脉环微血管生成的抑制率柱形图；统计学分析，*P<0.05，8v(100μM)组对乌苯美司(100μM)组。
图5是小鼠H22肝癌肺转移的肺叶表面结节的代表性图片。
图6是小鼠H22肝癌肺转移的肺叶表面结节数柱形图；统计学分析，*P<0.05，8v(60mg/kg)用药组对空白组，乌苯美司(60mg/kg)用药组对空白组。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，但不限于此。
实施例1.(1)化合物8a-8w，8aa-8ii和20a-20e的制备，以化合物8a为例。
(S)-2(3-((1-苄基-1H-1，2，3-三唑-4-基)甲基)脲基)-N-羟基-4-甲基戊酰胺(8a)的制备方法，步骤如下：
1)甲基(丙-2-炔基-1-基氨基甲酰基)-L-亮氨酸(2)的制备
L-亮氨酸甲酯盐酸盐1(1.81g，10mmol)溶解于二氯甲烷(40mL)和饱和碳酸氢钠(40mL)的混合溶剂中。分次加入三光气(0.98g，3.3mmol)。0℃下反应1.5小时。分取有机相，无水硫酸镁干燥15分钟。滤过，0℃下，滤液滴加入炔丙胺(0.55g，10mmol)和三乙胺(1.21g，12mmol)的无水二氯甲烷(100mL)中。滴毕，25℃反应12小时。浓缩，残渣溶于乙酸乙酯(100mL)。质量分数3.7％盐酸(3×100mL)洗，饱和碳酸氢钠(3×100mL)洗，饱和氯化钠(3×100mL)洗，无水硫酸镁干燥过夜。滤过，浓缩，得到粗品。粗品用乙酸乙酯/石油醚重结晶，得到白色固体1.87g。收率：83％，mp：102.9-104.2℃；1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ6.37(d，J＝8.4Hz，1H)，6.25(t，J＝5.7Hz，1H)，4.17(q，J＝8.4Hz，1H)，3.78(dd，J＝5.7Hz，J＝2.4Hz，2H)，3.61(s，3H)，3.05(t，J＝2.4Hz，1H)，1.68-1.54(m，1H)，1.47-1.42(m，2H)，0.89-0.84(m，6H)；ESI-MS m/z 227.4[M+H]+。
2)(S)-N-羟基-4-甲基-2-(3-(丙-2-炔基-1-基)脲基)丙酰胺(3)的制备
羟胺钾甲醇溶液的制备：氢氧化钾(28.00g，509mmol)和盐酸羟胺(23.35g，343mmol)分别溶于70mL和120mL的重蒸甲醇中，获得溶液A和溶液B。溶液A滴加到溶液B中，0℃下搅拌40分钟。滤过，得到新制的羟胺钾的甲醇溶液。化合物2(2.26g，10mmol)溶解于上述溶液(20mL)。25℃反应0.5小时。浓缩。残渣溶于水，质量分数3.7％盐酸调pH至6。乙酸乙酯(3×100mL)萃取，合并有机相。有机相用饱和碳酸氢钠(3×100mL)洗，饱和氯化钠(3×100mL)洗。无水硫酸镁干燥。滤过，浓缩。残渣加入二氯甲烷(50mL)，-18℃放置过夜。析出固体，滤过，真空干燥，得到白色固体1.20g。收率：53％，mp：124.5-126.2℃；1H NMR(600MHz,DMSO-d6)：δ10.68(s，1H)，8.80(s，1H)，6.24(t，J＝5.7Hz，1H)，6.16(d，J＝8.4Hz，1H)，4.05(q，J＝8.4Hz，1H)，3.78(dd，J＝5.7Hz，J＝2.4Hz，2H)，3.05(t，J＝2.4Hz，1H)，1.54-1.50(m，1H)，1.34-1.32(m，2H)，0.89-0.84(m，6H)；ESI-MS m/z 226.3[M-H]-。
3)苯甲醇(5a)的制备
苯甲醛4a(1.06g，10mmol)溶于甲醇(10mL)，0℃下分次加入硼氢化钠(0.57g，15mmol)。0℃下反应1小时。浓缩，残渣溶于乙酸乙酯(100mL)。有机相用水(3×100mL)洗，饱和氯化钠(3×100mL)洗，无水硫酸镁干燥。滤过，浓缩，得到无色油(2.01g)，粗品不经过进一步纯化，直接投入下一步反应。
化合物5b-5w，5aa-5ii和17a-17e的制备方法与化合物5a类似。
4)苄基甲基磺酸酯(6a)
化合物5a(1.08g，10mmol)和三乙胺(1.52g，15mmol)溶解于无水二氯甲烷(100mL)，0℃下滴加入甲磺酰氯(1.36g，12mmol)的无水二氯甲烷(20mL)溶液。0℃下反应12小时。浓缩，残渣溶于乙酸乙酯(100mL)，质量分数3.7％盐酸(3×100mL)洗，饱和碳酸氢钠(3×100mL)洗，饱和氯化钠(3×100mL)洗，无水硫酸镁干燥过夜。浓缩，得到黄色油(1.77g)。粗品不经过进一步纯化，直接投入下一步反应。
化合物6b-6w，6aa-6ii和18a-18e的制备方法与化合物6a类似。
5)叠氮基甲基苯(7a)
化合物6a(1.86g，10mmol)溶于N’N-二甲基甲酰胺(10mL)，分次加入叠氮钠(0.72g，11mmol)。25℃反应12小时。反应液倾入冰水中，乙酸乙酯(3×100mL)萃取。有机相用水(3×100mL)洗，饱和氯化钠(3×100mL)洗，无水硫酸镁干燥过夜。浓缩，得到无色油(1.18g)。粗品不经过进一步纯化，直接投入下一步反应。
化合物7b-7w，7aa-7ii和19a-19e的制备方法与化合物7a类似。
6)(S)-2(3-((1-苯基-1H-1，2，3-三唑-4-基)甲基)脲基)-N-羟基-4-甲基戊酰胺(8a)
化合物3(0.45g，2mmol)和化合物7a(0.29g，2.2mmol)溶解于二甲基亚砜(16mL)，加入抗坏血酸钠(59.4mg，0.3mmol)的水(2mL)溶液和五水硫酸铜(25mg，0.1mmol)的水(2mL)溶液。25℃反应2小时。反应液倾入水中，乙酸乙酯(3×100mL)萃取。合并有机相，饱和氯化钠(3×100mL)洗，无水硫酸镁干燥过夜。浓缩得到无色油。残渣溶于二氯甲烷(20mL)，25℃搅拌2小时。生成的沉淀滤过，得到白色固体0.35g。收率：48％，mp：184.8-186.2℃。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)：δ10.67(s，1H)，8.79(s，1H)，7.90(s，1H)，7.37(t，J＝6.6Hz，2H)，7.32(t，J＝6.6Hz，1H)，7.30(d，J＝6.6Hz，2H)，6.36(t，J＝6Hz，1H)，6.11(d，J＝8.4Hz，1H)，5.56(s，2H)，4.21-4.20(m，2H)，4.06(q，J＝8.4Hz，1H)，1.51-1.49(m，1H)，1.33-1.30(m，2H)，0.86-0.82(m，6H)；13C-NMR(100MHz,DMSO-d6)：δ169.9，157.6，146.6，136.5，129.1，128.5，128.3，122.9，53.1，49.5，42.9，35.4，24.6，23.2，22.6；HRMS(AP-ESI)m/z calcd for C17H25N6O3[M+H]+361.1988，found 361.1992。
化合物8b-8w，8aa-8ii和20a-20e的制备方法与化合物8a类似。
实施例2.化合物11a-11v的制备方法，以化合物11a为例。
(S)-N-羟基-4-甲基-2-(3-((1-苯基-1H-1，2，3-三唑-4-基)甲基)脲基)戊酰胺(11a)的制备方法，步骤如下：
1)叠氮基苯(10a)
苯胺9a(0.93g，10mmol)溶于质量分数3.7％盐酸，0℃下加入亚硝酸钠(0.74g，10.7mmol)。0℃反应0.5小时，然后加入叠氮钠(0.72g，11mmol)。0℃继续反应0.5小时。乙酸乙酯(3×50mL)萃取，有机相无水硫酸镁干燥。滤过，浓缩，得到黄色油，粗品不经过进一步纯化，直接投入下一步反应。
化合物10b-10v的制备方法与化合物10a类似。
2)(S)-N-羟基-4-甲基-2-(3-((1-苯基-1H-1，2，3-三唑-4-基)甲基)脲基)戊酰胺(11a)
化合物3(0.45g，2mmol)和化合物10a(0.26g，2.2mmol)溶于二甲基亚砜(16mL)，加入抗坏血酸钠(59.4mg，0.3mmol)的水(2mL)溶液和五水硫酸铜(25mg，0.1mmol)的水(2mL)溶液。25℃反应2小时。反应液倾入水中，乙酸乙酯(3×100mL)萃取。合并有机相，饱和氯化钠(3×100mL)洗三次，无水硫酸镁干燥过夜。浓缩得到无色油。残渣溶于二氯甲烷(20mL)，25℃搅拌2小时。生成的沉淀滤过，得到白色固体0.33g，收率：47％。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)：δ10.69(s，1H)，8.81(s，1H)，8.58(s，1H)，7.90-7.87(m，2H)，7.62-7.57(m，2H)，7.51-7.46(m，1H)，6.48(t，J＝5.7Hz，1H)，6.18(d，J＝8.7Hz，1H)，4.34-4.31(m，2H)，4.08(q，J＝8.7Hz，1H)，1.66-1.43(m，1H)，1.37-1.32(m，2H)，0.88-0.84(m，6H)；13C-NMR(75MHz，DMSO-d6)：δ169.4，157.2，146.9，136.6，129.8，128.5，120.6，119.9，49.1，42.3，34.8，24.1，22.7，22.1；HRMS(AP-ESI)m/z calcd for C16H23N6O3[M+H]+347.1832，found 347.1826。
化合物11b-11v的制备方法与化合物11a类似。
实施例3.化合物11aa-11ii的制备方法，以化合物11aa为例。
(S)-2-(4-((3-(1-(羟基胺)-4-甲基-1-氧代戊烷-2-基)脲基)甲基)-1H-1，2，3-三唑-1-基)苄基乙酸酯(11aa)的制备方法，步骤如下：
1)(2-硝基苯基)甲醇(13)
2-硝基苯甲醛12(1.51g，10mmol)溶于甲醇(10mL)，0℃下分次加入硼氢化钠(0.57g，15mmol)。0℃下反应1小时。浓缩，残渣溶于乙酸乙酯(100mL)。有机相用水(3×50mL)洗，饱和氯化钠(3×50mL)洗，无水硫酸镁干燥过夜。滤过，浓缩得到黄色固体(1.45g)。粗品不经过进一步纯化，直接投入下一步反应。
2)(2-氨基苯基)甲醇(14)
化合物13(1.53g，10mmol)加入到硫化钠(21.60g，90mmol)的水(100mL)溶液。100℃反应3小时。水相用乙酸乙酯(3×50mL)萃取。有机相用水(3×50mL)洗，饱和氯化钠(3×50mL)洗，无水硫酸镁干燥过夜。滤过，浓缩得到白色固体(1.05g)。粗品不经过进一步纯化，直接投入下一步反应。
3)(2-叠氮基苯基)甲醇(15)
化合物14(1.23g，10mmol)溶于质量分数3.7％盐酸，0℃下加入亚硝酸钠(0.74g，10.7mmol)。0℃反应0.5小时，然后加入叠氮钠(0.72g，11mmol)。0℃继续反应0.5小时。乙酸乙酯(3×50mL)萃取，有机相无水硫酸镁干燥。滤过，浓缩，得到黄色油，粗品不经过进一步纯化，直接投入下一步反应。
4)2-叠氮基苄基乙酸酯(10aa)
化合物15(1.49g，10mmol)和三乙胺(1.51g，15mmol)溶于无水四氢呋喃(50mL)，0℃滴加乙酰氯(0.94g，12mmol)的无水四氢呋喃(10mL)溶液。50℃反应3小时。浓缩，残渣溶于乙酸乙酯(50mL)。有机相用质量分数3.7％盐酸(3×50mL)洗，饱和碳酸氢钠(3×50mL)洗，饱和氯化钠(3×50mL)洗，无水硫酸镁干燥过夜。滤过，浓缩，得到黄色油状物(1.07g)。粗品不经过进一步纯化，直接投入下一步反应。
化合物10bb-10ii的制备方法与化合物10aa类似。
5)(S)-2-(4-((3-(1-羟胺基)-4-甲基-1-氧代戊烷-2-基)脲基)甲基)-1H-1，2，3-三唑-1-基)苄基乙酸酯(11aa)
化合物3(0.45g，2mmol)和化合物10aa(0.42g，2.2mmol)溶于二甲基亚砜(16mL)，加入抗坏血酸钠(59.4mg，0.3mmol)的水(2mL)溶液和五水硫酸铜(25mg，0.1mmol)的水(2mL)溶液。25℃反应2小时。反应液倾入水中，乙酸乙酯(3×100mL)萃取。合并有机相，饱和氯化钠(3×100mL)洗，无水硫酸镁干燥过夜。浓缩得到无色油。残渣溶于二氯甲烷(20mL)，25℃搅拌2小时。生成的沉淀滤过，真空干燥，得到白色固体0.44g，收率：53％。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ10.68(s，1H)，8.80(s，1H)，8.26(s，1H)，7.67-7.49(m，4H)，6.48(t，J＝5.7Hz，1H)，6.19(d，J＝9Hz，1H)，4.99(s，2H)，4.40-4.28(m，2H)，4.08(q，J＝9Hz，1H)，1.96(s，3H)，1.60-1.32(m，1H)，1.24-1.17(m，2H)，0.88-0.84(m，6H)；13C-NMR(75MHz，DMSO-d6)：δ169.8，169.3，157.1，146.0，135.5，131.1，129.9，129.8，129.3，125.8，124.1，61.6，49.1，42.3，34.7，24.1，22.7，22.1，20.4；HRMS(AP-ESI)m/z calcd for C19H27N6O5[M+H]+419.2043，found 419.2039。
化合物11bb-11ii的制备方法与化合物11aa类似。
实施例4.体外抑制氨肽酶N的活性实验
1)实验材料：
猪源氨肽酶N购自Biocol公司，底物L-亮氨酰-p-硝基苯胺购自Sigma公司。
缓冲液的配制，12.89g Na2HPO4.12H2O和2.18g NaH2PO4.2H2O，溶解于1000mL容量瓶中，加新煮沸放冷的蒸馏水定容，得到pH为7.2的50mM磷酸盐缓冲溶液，室温放置备用。
底物溶解在二甲基亚砜中配成16mmol/mL的溶液，备用。
氨肽酶N溶解在缓冲液中，配成0.15IU/mL的溶液，冰箱4℃放置，备用。
2)实验方法：
表1.体外抑酶实验各种加入试剂配比
在96孔板中，按照上表中的量加入酶，底物，抑制剂和磷酸盐缓冲液。在37℃孵育0.5小时。于405nm处测定吸光度，按照如下公式计算抑制率：
根据化合物的浓度和抑制率，利用origin 8.0软件拟合曲线，得到IC50值。
3)实验结果：
本发明所述通式(I)和(II)结构中部分化合物和阳性药乌苯美司的氨肽酶N抑制活性如下表2所示：
表2.部分化合物的氨肽酶N抑制活性
[a]实验结果表示为平均值±标准差，来自三次独立的实验。
体外抑酶实验结果显示：大部分化合物在微摩尔或者亚微摩尔水平表现了氨肽酶N的抑制活性。所有化合物的活性均优于阳性药乌苯美司(Bestatin)。其中，化合物8b，8e，8h，8k，8l，8s，8t，8w，8aa，8bb，8cc，11a，11b，11e，11h，11k-11q，11s，11u，11v，11aa-11ee，11hh和20d的活性优于乌苯美司一个数量级；化合物8v，11ff和11ii的活性优于乌苯美司两个数量级。
实施例5.体外抑制肿瘤细胞增殖实验
1)实验材料：
细胞株：
处于对数生长期的人白血病K562细胞株，人肝癌PLC/PRF/5细胞株，人前列腺癌PC-3细胞株，人卵巢透明细胞癌ES-2细胞株，人乳腺癌A549细胞株，人乳腺癌MDA-MB-231细胞株，人结肠癌HCT116细胞株。
试剂：MTT溶于1×PBS配成5mg/mL的溶液，二甲基亚砜。
2)实验方法：
取对数生长期的细胞(100μL)铺于96孔板底部(悬浮细胞8,000细胞/孔，贴壁细胞4,000细胞/孔)，待细胞贴壁伸展后(悬浮细胞直接加入抑制剂)加入不同浓度的抑制剂(100μL)，37℃，5％CO2孵育48小时。然后加入MTT(20μL)溶液，继续孵育4小时。离心。加入二甲基亚砜(200μL)，混匀15分钟。570nm处测定吸光度。细胞增殖抑制率按照如下公式计算：
根据抑制剂的浓度和相应抑制率，利用origin 8.0软件拟合曲线，得到IC50值。
3)实验结果：
本发明所述通式(I)和(II)结构中部分化合物和阳性药乌苯美司的抑制多种肿瘤细胞株增殖的活性如下表3所示：
表3.部分化合物的抗肿瘤细胞增殖活性
[a]实验结果表示为平均值±标准差，来自三次独立的实验。
细胞增殖活性显示：化合物8v和8w对七种细胞株的抑制作用明显优于阳性药乌苯美司，具有抗肿瘤细胞增殖的作用。
实施例6.体外抗血管生成实验
(1)体外抑制人脐静脉内皮细胞管状结构形成实验
1)实验模型：体外人脐静脉内皮细胞管状结构形成；
2)实验材料：原代分离的人脐静脉内皮细胞，基质胶(Matrigel，购自BD Bioscience公司)，M199细胞培养基；
3)实验方法：
50μL基质胶加入到96孔板中，37℃放置0.5小时，待胶凝固后，加入50μL含人脐静脉内皮细胞(20,000个细胞/孔)和不同浓度抑制剂的M199培养基。37℃，5％CO2孵育4小时。显微镜下观察和拍照，随机选取五个视野对管状结构分支点进行计数，计算平均值，与乌苯美司组进行比较。本实验重复三次。
4)实验结果：
实验结果见附图1和附图2。化合物8v对人脐静脉内皮细胞管状结构形成的抑制呈现剂量依赖性。化合物8v在10μM时，抑制管状结构形成的作用与阳性药乌苯美司在100μM时相当；化合物8v在100μM时，几乎完全抑制管状结构的形成。化合物8v显示了体外抗血管生成的作用，具有进一步开发的价值。
(2)体外抑制大鼠主动脉环微血管生成实验
1)实验模型：体外大鼠主动脉环微血管生成；
2)实验材料：8-10周龄的大鼠，基质胶(Matrigel，购自BD Bioscience公司)，M199细胞培养基；
3)实验方法：
分取大鼠主动脉，切成1mm左右的主动脉环，备用。基质胶(100μL)加入到96孔板，37℃放置0.5小时，待胶凝固后，加入分取的主动脉环，然后覆盖基质胶(100μL)。37℃放置0.5小时，待胶凝固后，加入不同浓度的抑制剂，37℃，5％CO2孵育9天。显微镜下观察拍照，用Image-pro Plus 6.0软件对图片进行处理，计算抑制率。细胞培养基每三天更换一次。本实验重复三次。
4)实验结果：
实验结果见附图3和附图4。化合物8v对大鼠主动脉环微血管生成的抑制作用具有剂量依赖性。化合物8v在10μM时，抑制微血管生成的作用与阳性药乌苯美司在100μM时相当；化合物8v在100μM时，几乎完全抑制微血管的生成。化合物8v显示了体外抗血管生成的作用，具有进一步开发的价值。
实施例7.体内抑制肿瘤肺转移实验
1)实验模型：小鼠H22肝癌细胞肺转移；
2)实验材料：6周龄的昆明小鼠，小鼠H22肝癌细胞；
3)实验方法：
小鼠尾静脉注射悬浮于1×PBS(0.1mL)的H22细胞(7.5×106/0.1mL)。注射完成后，小鼠随机分成空白组和用药组。用药组腹腔注射抑制剂或乌苯美司，剂量为60mg/kg/d。空白组腹腔注射1×PBS。用药12天后，拉颈处死小鼠，分取肺叶，Bouin’s固定液固定，计数肺叶表面的肺结节，计算抑制率。
4)实验结果：
实验结果见附图5和附图6。化合物8v和乌苯美司在腹腔注射、剂量为60mg/kg/d时，对H22肺转移的抑制作用分别为71％和64％。化合物8v用药组未见明显的肝脾毒性。化合物8v显示了体内抑制肿瘤转移的作用，具有进一步的开发价值。