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1、(10)授权公告号 CN 101503682 B (45)授权公告日 2011.04.06 CN 101503682 B *CN101503682B* (21)申请号 200810137564.4 (22)申请日 2008.11.12 CGMCC No.2577 2008.07.04 C12N 9/68(2006.01) C12R 1/645(2006.01) (73)专利权人 齐齐哈尔大学 地址 161006 黑龙江省齐齐哈尔市建华区文 化大街 42 号齐齐哈尔大学生命科学与 工程学院 (72)发明人 刘晓兰 郑喜群 邓永平 李巍 时晰 李瑶 (74)专利代理机构 齐齐哈尔鹤城专利事务所 2。
2、3207 代理人 叶仲刚 KR 20050021146 A,2005.03.07, 全文 . CN 1229852 A,1999.09.29, 全文 . Hua-ping Li 等 .A Novel Extracellular Protease with Fibrinolytic Activity from the Cultrue Supernatant of Cordyceps sinensis:Purification and Characterization. Phytotherapy Research.2007, 第 21 卷 1234-1241. (54) 发明名称 一种真菌纤溶酶及。
3、其培制方法 (57) 摘要 本发明公开了一种真菌纤溶酶及该纤溶酶的 培制方法，以蛹虫草菌株为菌种，经液体发酵培 养、分离和提纯制成 ；该纤溶酶相对分子量为 21000 左右 ；该蛹虫草纤溶酶具有很好的溶栓性 能，且无明显的急性毒性，具有在临床上开展试 验、开发应用的前景，也为稀薄的纤溶酶家族增 添了一名新的成员 ；尤其是经严格筛选得到的 纤溶酶蛹虫草优选菌株 C.LSG-1，生长条件比较 粗放，产酶周期短，在产酶同时能收获大量蛹虫 草菌丝体，是一株生产性能优良的菌种 ；本发 明的蛹虫草纤溶酶是一种胞外酶，在制备中特别 有利于后续的分离和纯化 ；由于本发明产品是 以来源广泛的玉米蛋白为主要培养基。
4、，不仅原料 成本低廉，而且也为这些原有资源的开发利用提 供了新的途径。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 王璟 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 1 页 CN 101503682 B1/1 页 2 1. 一种真菌纤溶酶， 其特征是 ： 该纤溶酶是经以下方式培制而成的 ： 以保藏号为 CGMCC N0.2577， 分类学命名为 Cordyceps militaris 的蛹虫草菌株 C.LSG-1 为菌种， 将菌株接入斜面培养基 ： 葡萄糖 1， 琼脂 2.5， 马铃薯汁 20， 蛋白胨 0.5，。
5、 KH2PO40.1， MgSO40.05， pH 自然， 23恒温培养 10d， 将培养物转接入与斜面培养 基成分相同的平板培养基， 23恒温培养 10d ； 发酵培养基含蔗糖 1.25， 玉米蛋白 5， KH2PO40.01、 KCl 0.005、 MgSO40.001、 CuSO40.001， 装液量为 40mL/250mL 三角瓶， 发 酵培养基的初始pH值自然， 液体发酵条件 ： 接菌量为直径1cm的菌苔圆片1片 ； 2128， 180rpm/min 发酵 5 天得液体发酵培养物 ； 粗提纯蛹虫草纤溶酶 ： 将液体发酵培养物 10000rpm/min、 4、 离心 10min， 离心。
6、上清液 经 20饱和度的硫酸铵盐析后为粗酶液 ； 精提纯蛹虫草纤溶酶 ： 采用现代色谱技术对粗酶液进行精提纯， A、 Phenyl Sepharose HP 疏水相互作用层析 ： 采用梯度洗脱方式将样品盐饱和度调到 40， 上样后用 40 0 硫酸铵溶液梯度洗脱， 收集有纤溶活性组分 ； B、 Superdex75 预装柱凝胶过滤层析， 收集有纤溶活性组分 ； 上述方法制备的蛹虫草纤溶酶可以直接溶解血纤维蛋白， 相对分子质量为 21000 左 右， pH 为中性时能保存较好的活力。 权 利 要 求 书 CN 101503682 B1/3 页 3 一种真菌纤溶酶及其培制方法 技术领域 0001 。
7、本发明涉及一种真菌纤溶酶， 本发明还涉及一种该真菌纤溶酶的培制方法。 背景技术 0002 众所周知， 血栓类疾病多年来一直是危害人类健康、 导致患者死亡的最主要病因 之一。现代医学治疗血栓最常用的手段就是依靠纤溶酶或其激活剂进行溶栓， 所使用的溶 栓剂药物现也已经进行了三代更新。目前， 处于正在研制当中的第三代溶栓药剂其来源主 要有两种 ： 一是利用蛋白质工程， 如分子定点突变， 结构域的删除、 增加、 拼接或融合等手段 对现有的溶栓剂进行分子改造。二是开发来源于各种生物的血栓溶解物质， 目前人们已经 成功地从蛇毒、 蚯蚓、 微生物以及吸血昆虫和海洋生物中提取到了多种具有纤溶活性的产 品。 本。
8、申请人于2006年成功地培育出了一种专利申请号为200610163497.6的生物纤溶酶， 该纤溶酶培养所使用的菌种是由本申请人于 1999 年 3 月在中国北方酱类发酵中间制品中 分离、 筛选获得， 并于 2006 年 10 月 12 日向中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 心 (CGMCC) 提供保藏， 保藏号为 CGMCC No.1836 的菌株。通过多项认真的研究试验证实， 该 纤溶酶能够直接溶解纤维蛋白和激活纤溶酶原间接溶解纤维蛋白， 并显现出良好和稳定的 酶活力， 具有很大的技术和市场开发潜力。 当然， 由于该项目所使用菌种是一种很难从自然 界中重复获得品种， 因此其资源相对。
9、有限， 而且为了使其能够长期保持原有的优良特性， 在 使用中还需对其进行不断地驯化和管理， 这对其大面积地推广应用都会造成一定的限制。 因此近年来本申请人一直都在努力寻找一些在自然界中更容易获得的类似菌种， 本发明就 是该项研究进展的部分内容。 发明内容 0003 本发明的发明目的在于提供一种真菌纤溶酶， 该纤溶酶具有很好的溶解血纤维蛋 白性能。本发明的另一个发明目的还在于提供一种该纤溶酶的培制方法。 0004 本发明产品蛹虫草纤溶酶在培养过程中所使用的菌种为蛹虫草， 其中优选菌种为 C.LSG-1 菌株， 该菌株已由本申请人于 2008 年 7 月 4 日向中国微生物菌种保藏管理委员会 普通。
10、微生物中心提供了菌种保藏， 保藏号为 CGMCC NO.2577。其分类学命名为 Cordyceps militaris。 0005 蛹虫草在我国又被称为北冬虫夏草或武氏虫草， 与冬虫夏草类似， 是一种很珍贵 的中药和高级滋补品， 具有提高免疫功能， 护肝清肺、 止咳化痰、 抗疲劳、 抗缺氧、 抗病毒等 功效， 具有重要的医用价值。 由于蛹虫草其资源相对冬虫夏草丰富， 再加上有部分的人工培 育， 被广泛用作传统名贵中药冬虫夏草的代用品。 近年来蛹虫草作为一种珍贵的药、 食兼用 菌已经引起相当多人的极大关注， 有关的开发报道也相当多见。目前该领域的主要进展有 三方面， 一是有大量的应用产品在不断。
11、开发， 其中以滋补保健品最为多见， 也包括少量的治 疗性药品。二是培养繁育技术研究不断， 其核心目的是为了丰富和扩大资源。三是重要成 分提取研究的起步， 主要用于科研及医药基础研究。 从目前所涉及的技术手段来看， 利用该 说 明 书 CN 101503682 B2/3 页 4 原料采用微生物学发酵方法获得新型药物方面虽然潜力极大， 但是已经取得的进展相对很 小。 0006 本发明产品是以蛹虫草菌株为菌种， 经过斜面培养、 平板培养、 液体发酵培养、 分 离和提纯， 最后培制出本发明的纤溶酶产品。该蛹虫草纤溶酶酶分子可以直接溶解血纤维 蛋白， 相对分子质量为 21000 左右， pH 为中性时能。
12、保存较好的活力。 0007 本发明产品制备的具体步骤 ： 0008 1、 以蛹虫草菌株为菌种， 经过斜面培养、 平板培养、 液体发酵培养生产蛹虫草纤溶 酶 ； 0009 2、 培养方法 ： 斜面培养平板培养液体发酵培养 ； 0010 将蛹虫草菌株接入斜面培养基 ： 葡萄糖 1， 琼脂 2.5， 马铃薯汁 20， 蛋白胨 0.5， KH2PO4 0.1， MgSO4 0.05， pH 自然， 23恒温培养 10d。将培养物转接入平板培养 基 ( 培养基成分同斜面培养基 )23恒温培养 10d。 0011 发酵培养基含蔗糖 1.25， 玉米蛋白 5， KH2PO4 0.01、 KCl 0.005、。
13、 MgSO4 0.001、 CuSO4 0.001， 装液量为 40mL/250mL 三角瓶， 发酵培养基的初始 pH 值自然。液 体发酵条件 ： 接菌量为直径 1cm 的菌苔圆片 1 片 ； 21 28， 180rpm/min 发酵 5 天得液体 发酵培养物。 0012 3、 粗提纯蛹虫草纤溶酶 ： 将液体发酵培养物 10000rpm/min、 4、 离心 10min， 离心 上清液经 20饱和度的硫酸铵盐析后为粗酶液。 0013 4、 精提纯蛹虫草纤溶酶 ： 采用现代色谱技术对粗酶液进行精提纯， 主要采用以下 方法得到色谱纯的蛹虫草纤溶酶 ： 0014 A、 Phenyl Sepharos。
14、e HP疏水相互作用层析 ： 采用梯度洗脱方式 ： 将样品盐饱和度 调到 40， 上样后用 40 0 硫酸铵溶液梯度洗脱， 收集有纤溶活性组分 ； 0015 B、 Superdex75 预装柱凝胶过滤层析， 收集有纤溶活性组分。 0016 本发明的优点 ： 该蛹虫草纤溶酶具有很好的溶栓性能， 且无明显的急性毒性， 因而 具有在临床上开展试验、 开发应用的前景， 也为稀薄的纤溶酶家族增添了一名新的成员。 本 发明所优选的菌株是经过严格筛选得到的高产纤溶酶蛹虫草菌株 C.LSG-1， 生长条件比较 粗放， 产酶周期短， 在产酶同时能收获大量蛹虫草菌丝体， 是一株生产性能优良的菌种。本 发明的蛹虫草。
15、纤溶酶是一种胞外酶， 在制备中特别有利于后续的分离和纯化。由于本发明 产品是以来源广泛的玉米蛋白为主要培养基， 不仅原料成本低廉， 而且也为这些原有资源 的开发利用提供了新的途径。 附图说明 0017 图 1 为利用血纤维蛋白蛋白平板法证实本发明产品纤溶酶溶纤作用的图片 0018 本发明产品蛹虫草纤溶酶在培养过程中所使用的优选菌种 C.LSG-1 菌株已由本 申请人于 2008 年 7 月 4 日向中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心提供了菌种 保藏， 保藏号为 CGMCC N0.2577。其分类学命名为 Cordyceps militaris。 0019 具体实施例 0020 实施例 。
16、1 ： 0021 1、 菌种 ： 蛹虫草菌株 C.LSG-1， 保藏号为 CGMCC NO.2577 说 明 书 CN 101503682 B3/3 页 5 0022 2、 培养基及培养条件 ： 0023 (1) 斜面培养基 ： 葡萄糖 1， 琼脂 2.5， 马铃薯汁 20， 蛋白胨 0.5， KH2PO40.1， MgSO4 0.05， pH 自然。培养条件 ： 23恒温培养 10d。(20马铃薯汁制备 ： 称去皮马铃薯 200g， 切成碎块， 加蒸馏水 1000ml， 煮沸 30min， 以双层纱布过滤取汁备用 ) 0024 (2) 平板培养基 ： 葡萄糖 1， 琼脂 2.5， 马铃薯汁 。
17、20， 蛋白胨 0.5， KH2PO40.1， MgSO4 0.05， pH 自然。培养条件 ： 23恒温培养 10d。 0025 (3) 液体发酵培养基 ： 蔗糖 1.25， 玉米蛋白 5， KH2PO4 0.01、 KCl0.005、 MgSO4 0.001、 CuSO4 0.001， 装液量为 40mL/250mL 三角瓶， 发酵培养基的初始 pH 值自 然。液体发酵条件 ： 接菌量为直径 1cm 的菌苔圆片 1 片 ； 21 28， 180rpm/min 发酵 5 天 得液体发酵培养物。 0026 实施例 2 0027 1、 斜面培养同实施例 1 0028 2、 液体发酵培养同实施例 。
18、1 0029 3、 蛹虫草纤溶酶的分离纯化 ： 液体发酵产物经过 20饱和度硫酸铵盐析、 Phenyl Sepharose HP 疏水相互作用层析、 Superdex75 凝胶过滤层析， 收集有纤溶活性组分。 0030 实施例 3 0031 蛹虫草纤溶酶纤溶活性证明 ： 0032 采用血纤维蛋白平板法检验此酶对血纤维蛋白的溶解性。 0033 血纤维蛋白平板法 0034 血纤维蛋白平板含有血纤维蛋白原 ( 市售的血纤维蛋白原中可能含有纤维蛋白 ) 和凝血酶， 可溶性纤维蛋白原在凝血酶作用形成纤维蛋白单体， 血纤维蛋白单体自发缔结， 多聚化形成可见的血纤维蛋白凝胶， 将纤溶酶液加到此平板凝胶表面， 经过短时间培养后 该酶即将血纤维蛋白溶解， 在平板凝胶表面形成肉眼可见的透明圈。见图 1。 0035 本发明所用菌株可以使用现有的市售产品， 优选使用的经过严格筛选得到的高产 纤溶酶蛹虫草菌株 C.LSG-1， 其生长条件比较粗放， 产酶周期短， 在产酶同时能收获大量蛹 虫草菌丝体， 是一株生产性能优良的菌种。 说 明 书 CN 101503682 B1/1 页 6 图 1 蛹虫草纤溶酶溶解纤维蛋白作用图 说 明 书 附 图 。