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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710523547.3 (22)申请日 2017.06.30 (71)申请人 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 地址 100081 北京市海淀区中关村南大街 12号 (72)发明人 李君明刘磊舒金帅王佳彤 白金瑞冯晶晶 (74)专利代理机构 北京华仲龙腾专利代理事务 所(普通合伙) 11548 代理人 黄玉珏 (51)Int.Cl. C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) (54)发明名称 番茄果实干汁性状的特异性序列及其分子 标记物与鉴定。
2、方法 (57)摘要 本发明公开了一种番茄果实干汁性状的特 异性序列， 该序列如SEQIDNO： 1所示， 还提供了 鉴定上述性状的方法与分子标记物， 包括如SEQ IDNO： 2所示的上游引物， 如SEQIDNO： 3所示的 下游引物， 也提供了鉴定上述性状的方法： (1)以 待鉴定番茄的基因组DNA为模板， 用所述分子标 记物进行PCR扩增； (2)对扩增产物进行琼脂糖凝 胶电泳检测， 如果待鉴定番茄的PCR扩增产物含 有如SEQIDNO： 1所示的DNA片段， 则即可鉴定出 该待鉴定番茄为有汁番茄， 反之则为干汁番茄。 利用本发明进行番茄果实干汁性状的分子标记 辅助选择， 可提高选择效率，。
3、 加快育种进程； 本发 明只需通过简单的DNA提取、 PCR特异性扩增、 琼 脂糖凝胶电泳检测即可完成对样品的鉴别。 权利要求书2页 说明书6页 序列表1页 附图1页 CN 107338246 A 2017.11.10 CN 107338246 A 1.一种番茄果实干汁性状的特异性序列， 其特征在于， 该序列如SEQ ID NO： 1所示。 2.一种鉴定番茄果实干汁性状的分子标记物， 其特征在于， 该分子标记物包括上游引 物和下游引物， 上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO： 2所示， 下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO： 3所示。 3.一种鉴定番茄果实干汁性状的方法， 包括如下步骤。
4、： 检测待鉴定番茄的基因组DNA中 是否含有SEQ ID NO： 1的DNA片段； 如果所述待鉴定番茄的基因组DNA中含有SEQ ID NO： 1的DNA片段， 所述待鉴定番茄为 普通有汁番茄； 如果所述待鉴定番茄的基因组DNA中不含有SEQ ID NO： 1的DNA片段， 所述待鉴定番茄 为干汁番茄。 4.根据权利要求3所述鉴别番茄果实干汁性状的方法， 其特征在于， 该方法包括如下步 骤： (1)以待鉴定番茄的基因组DNA为模板， 用权利要求2所示核苷酸序列的分子标记物进行 PCR扩增， 得到其扩增产物； (2)对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测， 如果所述待鉴定番茄的PCR扩增产物含有权 利。
5、要求1如SEQ ID NO： 1所示的DNA片段， 则即可鉴定出该待鉴定番茄为有汁番茄， 反之则为 干汁番茄； 所述步骤(1)中PCR反应温度程序是： 94预变性4min； 94变性30s， 55退火30s， 72 延伸45s， 30个循环； 72延伸8min。 所述步骤(2)中琼脂糖凝胶电泳检测程序是： 将引物对的PCR产物进行1.5琼脂糖凝 胶电泳检测， Goldview染色， 缓冲液为0.5TBE， 4Vcm-1恒压下电泳40min， Bio-Rad凝胶 成像系统观察并照相。 5.根据权利要求3所述鉴定番茄果实干汁性状的方法， 其特征在于， 所述步骤(2)中对 扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。
6、检测， 电泳条带仅显示358bp条带， 则待鉴定番茄为干汁番 茄。 6.根据权利要求3所述鉴定番茄果实干汁性状的方法， 其特征在于， 所述步骤(2)中对 扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测， 电泳条带显示497bp条带或显示497bp与358bp两个条 带， 则待鉴定番茄为有汁番茄。 7.根据权利要求3所述鉴定番茄果实干汁性状的方法， 其特征在于， 所述步骤(1)中扩 增试剂盒包括： 权利要求书 1/2 页 2 CN 107338246 A 2 所述待鉴定番茄的基因组DNA模板的质量浓度为25ng/ l， 上游引物的质量浓度为 50ng/ l， 下游引物的质量浓度为50ng/ l， dNTPs混合。
7、物的浓度摩尔质量浓度为10mM， MgC12 溶液的摩尔质量浓度为25mM， Taq DNA聚合酶的质量浓度为5U/ l， 以上组成试剂盒的各成 分质量浓度、 摩尔浓度均为各成分溶解于相对应溶剂的质量浓度、 摩尔浓度。 权利要求书 2/2 页 3 CN 107338246 A 3 番茄果实干汁性状的特异性序列及其分子标记物与鉴定方法 技术领域 0001 本发明属于遗传学与生物学技术领域， 具体为番茄果实干汁性状特异性序列及其 分子标记物与鉴定方法。 背景技术 0002 番茄具有较高的营养价值和经济价值， 是重要的鲜食产品和加工原料， 已成为继 玉米、 水稻、 小麦与马铃薯等之后的世界第七大作物。
8、， 全球年工业产值可达500亿美元。 番茄 果实不仅含有对人体有益的碳水化合物、 纤维素和矿质元素等， 并且含有多种维生素， 以及 决定果实风味的多种糖、 有机酸和挥发性有机化合物。 番茄因其重要的农业价值、 丰富的营 养价值、 优越的植物学特性和基础研究优势， 成为研究肉质果特别是肉质浆果及其发育的 模式植物， 解释了众多果实的生理、 发育和代谢等机理， 如关于肉质果实的器官发生、 发育 和成熟， 以及感官品质和营养的分子基础等。 0003 利用不断发展的理论和技术， 培育满足生产和市场需求的优良品种， 是番茄育种 的根本目的。 随着遗传学的发展， 遗传标记的得到广泛应用和推广， 分为形态标。
9、记、 细胞学 标记、 生化标记等表现型标记和DNA片段标记等基因型标记。 DNA片段标记能够直接反映生 物个体或种群间基因组的某种差异， 具有不受环境和基因表达的影响， 而且具有数量丰富， 遗传稳定， 操作简单等优点。 从20世纪80年代后期开始， 分子标记辅助选择技术和基因工程 技术为核心的生物育种技术得到了快速的发展。 常用的分子标记有基于Southern杂交的限 制性片段长度多态性标记(RFLP)， 基于PCR技术的DNA扩增方法的随机扩增多态性DNA标记 (RAPD)， 特定序列扩增标记(SCAR)和简单重复序列标记(SSR)， 以及基于PCR与酶切相结合 的扩增片段长度多态性标记(A。
10、FLP)、 切割扩增的多态性序列标记(CAPS)和单核苷酸多态性 (SNP)等。 PCR是聚合酶链式反应的英文缩写(Polymerase Chain Reaction)， PCR反应可以 扩增一个DNA片段。 PCR技术已经被广泛用于生物学、 分子生物学、 生物化学、 生物医学等学 科。 0004 心室胶状物是番茄等肉质浆果的典型特征， 在果实的形成、 发育、 风味组成与质地 变化等均发挥着重要作用。 普通番茄成熟后， 果实心室组织发育成凝胶状的心室胶状物 (locular gel)。 心室胶状物作为番茄果实中除果皮外的第二大丰富组织， 是风味品质的重 要构成因素。 干汁番茄材料(all fl。
11、esh， alf)果实不形成心室胶状物， 果实仍能正常发育成 熟， 干汁番茄果实干物质含量高， 可提高果实的耐贮运性， 减缓番茄切片的降解速度， 用于 制干番茄及汉堡夹心等。 干汁番茄材料的研究可为深入理解番茄风味品质的形成及遗传改 良提供理论依据， 并可为解析番茄果实心室胶状物的形成和发育的分子机制奠定基础。 然 而， 现有技术中采用分子标记技术直接鉴定番茄是否为干汁番茄却鲜有报道。 发明内容 0005 为解决现有技术中上述问题， 本发明提供了番茄果实干汁性状的特异性序列及其 分子标记物与鉴定方法， 实现的目的为， 提供一种在番茄苗期快速筛选和鉴定番茄果实干 说明书 1/6 页 4 CN 1。
12、07338246 A 4 汁性状的方法和检测技术， 可于植株早期快速稳定地筛选和鉴定番茄果实的干汁性状。 0006 为了实现上述目的， 本发明公开的技术方案为： 本发明提供了一种番茄果实干汁 性状的特异性序列， 该序列如SEQ ID NO： 1所示。 0007 本发明还公开了鉴定番茄果实干汁性状的分子标记物， 该分子标记物包括上游引 物、 下游引物， 上游引物的的核苷酸序列如SEQ ID NO： 2所示， 下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO： 3。 0008 鉴别番茄果实干汁性状的方法， 包括如下步骤： 检测待鉴定番茄的基因组DNA中是 否含有SEQ ID NO： 1的DNA片段。 00。
13、09 如果所述待鉴定番茄的基因组DNA中含有SEQ ID NO： 1的DNA片段， 所述待鉴定番 茄为普通有汁番茄； 0010 如果所述待鉴定番茄的基因组DNA中不含有SEQ ID NO： 1的DNA片段， 所述待鉴定 番茄为干汁番茄。 0011 采用上述特异性基因序列与分子物， 鉴定番茄果实干汁性状的方法， 包括如下步 骤： (1)以待鉴定番茄的基因组DNA为模板， 用所述分子标记物进行PCR扩增得到其扩增产 物； 0012 (2)对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测， 如果所述待鉴定番茄的PCR扩增产物含 有如SEQ ID NO： 1所示的DNA片段， 则即可鉴定出该待鉴定番茄为有汁番茄； 反。
14、之则为干汁 番茄。 0013 所述步骤(1)中PCR反应温度程序是： 94预变性4min； 94变性30s， 55退火 30s， 72延伸45s， 30个循环； 72延伸8min。 0014 所述步骤(2)中琼脂糖凝胶电泳检测程序是： 将引物对的PCR产物进行1.5琼脂 糖凝胶电泳检测， Goldview染色， 缓冲液为0.5TBE， 4Vcm-1恒压下电泳40min， Bio-Rad 凝胶成像系统观察并照相。 0015 所述步骤(2)中对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测， 电泳条带仅显示358bp条 带， 则待鉴定番茄为干汁番茄。 0016 所述步骤(2)中对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测， 。
15、电泳条带显示497bp条带或 显示497bp与358bp两个条带， 则待鉴定番茄为有汁番茄。 0017 所述步骤(1)中扩增试剂盒包括： 0018 0019 所述待鉴定番茄的基因组DNA模板的质量浓度为25ng/ l， 上游引物的质量浓度为 说明书 2/6 页 5 CN 107338246 A 5 50ng/ l， 下游引物的质量浓度为50ng/ l， dNTPs混合物的浓度摩尔质量浓度为10mM， MgC12 溶液的摩尔质量浓度为25mM， Taq DNA聚合酶的质量浓度为5U/ l， 以上组成试剂盒的各成 分质量浓度、 摩尔浓度均为各成分溶解于相对应溶剂的质量浓度、 摩尔浓度。 0020 。
16、本发明的有益效果是： 采用本发明成套引物对番茄育种群体进行辅助选择得到了 干汁番茄株系， 这表明本发明所述分子标记物用于番茄干汁性状的分子标记辅助选择是切 实有效的， 利用本发明进行分子标记辅助选择可提高选择效率， 加快育种进程。 0021 用此方法鉴别番茄果实否具有干汁性状， 只需通过简单的DNA提取、 PCR特异性扩 增、 琼脂糖凝胶电泳检测即可完成对样品的鉴别。 本方法不需要限制性内切酶酶切， 具有经 济、 操作简单、 特异性强、 重复性好等优点。 附图说明 0022 图1为采用本发明鉴定番茄果实干汁性状分子引物对的PCR产物的电泳结果， 其 中， 0023 M为100bp DNA la。
17、dder， p1为母本IL7-5， p2为父本06790， F1为IL7-506-790的F1， 其余为IL7-506-790的F2株系编号。 具体实施方式 0024 下面通过具体的实施例对本发明做进一步的详细描述。 0025 实施例一： 本发明提供的一种番茄果实干汁性状的特异性序列， 该序列如SEQ ID NO： 1所示， 鉴定该性状的分子标记物， 包括上游引物、 下游引物， 上游引物的的核苷酸序列 如SEQ ID NO： 2所示， 下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO： 3所示。 0026 本发明通过干汁番茄基因组重测序， 获得了一批与干汁性状连锁的SNP位点和插 入缺失序列， 通过将。
18、这些位点和序列设计引物， 进行遗传连锁分析与验证， 从中筛选出一系 列与干汁性状相连锁的分子标记， 包括CAPS、 dCAPS与PCR标记等。 由于干汁番茄为隐性性 状， 所以选择共显性标记进行验证， 其中包括CAPS-1、 CAPS-2与dCAPS-1等。 0027 CAPS-1： 0028 正向引物： 5 -TAGGCAAACTCTATTCATCAAGG-3 (CAPS1 No.1) 0029 反向引物： 5 -CTATGCTGTGGTAGGTAGACTTGC-3 (CAPS1 No.2) 0030 PCR扩增后， 用限制性内切酶MboI进行酶切， 然后进行琼脂糖电泳， 干汁番茄不能 够被。
19、酶切， 显示一个480bp条带。 普通有汁番茄能够酶切或部分酶切， 显示120bp和360bp两 个条带， 或显示120bp、 360bp和480bp三个条带。 0031 CAPS-2： 0032 正向引物： 5 -TGAGAAAAATAAGAATAGCCGATG-3 (CAPS2 No.1) 0033 反向引物： 5 -CACACATCAACCTCCAGACTCC-3 (CAPS2 No.2) 0034 PCR扩增后， 用限制性内切酶TaqI进行酶切， 然后进行琼脂糖电泳， 干汁番茄能够 完全酶切， 显示290bp和340bp两个条带。 普通番茄不能够被酶切或不能够被完全酶切， 显示 一个6。
20、30bp条带， 或显示290bp、 340bp和630bp三个条带。 0035 dCAPS-1： 0036 正向引物： 5 -TTATGAAAACATTCGGTGGTGC-3 (dCAPS1 No.1) 说明书 3/6 页 6 CN 107338246 A 6 0037 反向引物： 5 -ATAATTTGATGTTTAATTTAGCCAT-3 (dCAPS1 No.2) 0038 PCR扩增后， 用限制性内切酶BccI进行酶切， 需要聚丙烯酰胺凝胶电泳， 干汁番茄 不能够被酶切， 仅显示一个180bp条带。 普通有汁番茄能够被酶切， 由于20bp片段较小， 多会 电泳到凝胶外， 不能够显示， 。
21、因此显示160bp一个条带， 或160bp和180bp两个条带。 0039 dCAPS-2： 0040 正向引物： 5 -GAGATGTACATCATATACTTACATG-3 (dCAPS2 No.1) 0041 反向引物： 5 -TTGTTCGTGTATTCAAACGCTTAT-3 (dCAPS2 No.2) 0042 PCR扩增后， 用限制性内切酶AflIII进行酶切， 需要聚丙烯酰胺凝胶电泳， 干汁番 茄能够被完全酶切， 仅显示一个150bp条带。 普通有汁番茄不能够被酶切或不能够被完全酶 切， 显示170bp一个条带， 或150bp和170bp两个条带。 0043 由于CAPS与dC。
22、APS等引物PCR之后需要进行限制性内切酶酶切， 耗时长， 并且限制 性内切酶价格较为昂贵， 并由于酶切时间和温度等原因， 可能造成酶切不够彻底， 影响电泳 条带判断的准确性， 影响干汁性状选择和鉴定的准确性。 0044 因此本发明选择不需要进行酶切的引物标记进行验证， 而且本发明所公开的番茄 果实干汁性状的特异性核苷酸序列、 分子引物为鉴定番茄干汁性状最为准确， 方法最为简 便的核苷酸序列。 0045 实施例二： 本发明除了公开上述番茄果汁干汁性状的特异性序列、 引物， 还公开了 鉴定番茄果实干汁性状的方法， 包括如下步骤： 0046 (1)以待鉴定番茄的基因组DNA为模板， 用所述分子标记。
23、物进行PCR扩增得到其扩 增产物； 0047 (2)对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测， 如果待鉴定番茄的PCR扩增产物含有如 SEQ ID NO： 1所示的DNA片段， 则即可鉴定出该待鉴定番茄为有汁番茄， 反之则为干汁番茄。 0048 所述步骤(1)中PCR反应温度程序是： 94预变性4min； 94变性30s， 55退火 30s， 72延伸45s， 30个循环； 72延伸8min。 0049 所述步骤(2)中琼脂糖凝胶电泳检测程序是： 将引物对的PCR产物进行1.5琼脂 糖凝胶电泳检测， Goldview染色， 缓冲液为0.5TBE， 4Vcm-1恒压下电泳40min， Bio-Rad 凝。
24、胶成像系统观察并照相。 0050 所述步骤(2)中对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测， 电泳显示条带仅显示358bp 条带， 则待鉴定番茄为干汁番茄。 0051 所述步骤(2)中对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测， 电泳显示条带显示497bp条 带或显示497bp与358bp两个条带， 则待鉴定番茄为有汁番茄。 0052 所述步骤(1)中扩增试剂盒包括： 说明书 4/6 页 7 CN 107338246 A 7 0053 0054 以上组成试剂盒的各成分质量浓度、 摩尔浓度均为各成分溶解于相对应溶剂的质 量浓度、 摩尔浓度， 各成分溶解于现有技术常用溶剂形成溶液后检测使用。 0055 以下试验表明。
25、， 本发明所提供的特异性核苷酸序列、 设计的引物、 鉴定方法为鉴定 番茄干汁性状最为准确、 有效、 便捷， IL7-506790的F2株系是按照如下方法获得： IL7-5 (作为母本)和06790(作为父本)杂交， 得到F1， F1自交收获F1植株所结的种子获得F2的种子。 随机取F2的种子进行种植， 得到F2植株， 取编号分别为1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、。
26、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45。 0056 (一)田间正常栽培管理， 待番茄果实转色后， 鉴定每株系的果实干汁性状， 每株系 调查10个果实， 以确保鉴定结果的准确性。 田间鉴定结果如表1所示， 表明株系编号为15、 35、 36、 42为干汁番茄； 株系编号为1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 37、 38、 39、 40、 41、 43、 44。
27、、 45为普通有汁番 茄。 0057 (二)利用本发明方法鉴定番茄的干汁性状， 在步骤(一)编号为1-45的株系、 IL7-5 (株系编号为p1)和06790(株系编号为p2)的番茄幼苗期分别采集番茄叶片提取其基因组 DNA， 分别以提取的各个株系的基因组DNA为模板， 利用引物对进行PCR扩增。 0058 (三)田间成株期果实干汁性状鉴定 0059 PCR反应完成后， 将引物对的PCR产物进行1.5琼脂糖凝胶电泳检测， Goldview染 色， 缓冲液为0.5TBE， 在4Vcm-1恒压下电泳40min， Bio-Rad凝胶成像系统观察并照相。 其中， 10TBE(1L)的配制方法如下： T。
28、ris 108g， 硼酸55g， EDTA 7.44g， 用ddH2O定容至1L， 使用前用蒸馏水配制成0.5工作液， 常温保存。 引物对的PCR产物的电泳结果如图1所示， IL7-5(株系编号为p1)、 06790(株系编号为p2)和编号为1-45的株系的PCR产物均得到特异 条带。 见表一所示。 0060 表一 说明书 5/6 页 8 CN 107338246 A 8 0061 0062 0063 以上所述仅为本发明的优选实施例而已， 并不用于限制本发明， 对于本领域的技 术人员来说， 本发明可以有各种更改和变化。 凡在本发明的精神和原则之内， 所作的任何修 改、 等同替换、 改进等， 均。
29、应包含在本发明的保护范围之内。 说明书 6/6 页 9 CN 107338246 A 9 序列表 SEQUENCE LISTING 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 番茄果汁干汁性状的特异性序列及其分子标记物与鉴定方法 1 Patentln version 3.3 1 139 番茄果实干汁性状的特异性核苷酸序列 1 AGGGTCCACC TTTTTCGTAC TCGCTGTTAC GGAGGCTGAC ACCGTCAGTT TCAACAAAGC 60 TGCAGGAATA GTCTATACCT TTTTTCTTAA CGTCGTTAGG GTTTGATTTT GGCTTTGACA 120 TGGCAGAGTA GAAAAGGAT 139 2 鉴定番茄果实干汁性状的上游引物 2 5 -CCTACAAGAATACAAAGCCT-3 3 鉴定番茄果实干汁性状的下游引物 3 5 -GGATGGCTCTAATGACAATG-3 序列表 1/1 页 10 CN 107338246 A 10 图1 说明书附图 1/1 页 11 CN 107338246 A 11 。