含有细胞因子诱导杀伤细胞的细胞群的制造方法 技术领域 本发明涉及过继免疫疗法中高效的含有细胞因子诱导杀伤 (CIK) 细胞的细胞 群以及该细胞群的制造方法等。 本发明涉及的含有 CIK 细胞的细胞群中调节性 T 细胞 (regulatory T cells ；Treg 细胞 ) 的增殖被抑制，可用于早期和晚期癌症以及包括造血细胞 和实体瘤在内的各种细胞增殖性疾病的治疗。
背景技术 近年来，人们重新审视药物疗法和放射疗法之类的给患者带来严重肉体痛苦的 治疗方法，开始越来越关注痛苦小的免疫疗法。 该疗法包括例如过继免疫疗法，其对取 出至体外的免疫相关细胞进行培养使其细胞数目增加，和 / 或增强与治疗效果相关的活 性后，再移植给患者。
过 继 免 疫 疗 法 中 作 为 效 应 细 胞 而 利 用 的 细 胞， 已 知 有 淋 巴 因 子 激 活 的 杀 伤 (lymphokine activated killer ；LAK) 细 胞、 肿 瘤 浸 润 淋 巴 细 胞 (tumour infiltrating lymphocyte ；TIL) 以及细胞因子诱导杀伤 (cytokine-induced killer ；CIK) 细胞。
LAK 细胞是通过在白细胞介素 (IL)-2 存在下使淋巴细胞增殖而得到的细胞群， 具有能溶解肿瘤细胞但不溶解正常细胞的性质。 关于 LAK 细胞的制备，已开发出在培养 时使抗 CD3 抗体与 IL-2 共存的方法。
TIL 是浸润到了肿瘤组织的 T 细胞，与 LAK 细胞相比，具有更显著的肿瘤抗原 特异性。 该细胞也可以在体外增殖并用于治疗。 但是，TIL 必须摘取患者的肿瘤组织才 能获得，因此采集操作繁杂，得到的细胞数也很少。
CIK 细胞可由末梢血单核细胞 (PBMC) 在干扰素 (IFN)-γ、抗 CD3 抗体以及 IL-2 的存在下进行培养来制备。 CIK 细胞是作为含有 CD3 阳性、 CD56 阳性细胞的细胞 群而具有特征的 PBMC 中稀有细胞群，但在没有靶细胞的存在下可以使该细胞群优先增 殖。 CIK 细胞在体内发挥比 LAK 细胞更胜一筹的针对肿瘤细胞的细胞杀伤活性 ( 例如非 专利文献 1)。
纤维连接蛋白是存在于动物血液、培养细胞表面、组织的细胞外基质中的分子 量 25 万的巨大糖蛋白，已知具有多种功能。 其结构域有 7 个 ( 参照图 1)。 而且，其氨 基酸序列中含有 3 种类似的序列，由上述各序列的重复构成整体。 3 种类似的序列分别被 称为 I 型、II 型、III 型。 其中，III 型由 71 ～ 96 个氨基酸残基构成，这些氨基酸残基的 一致率为 17 ～ 40％。
利用 DNA 重组技术，制得多种纤维连接蛋白的片段，可期待其中有些具有抑制 癌转移的作用 ( 非专利文献 2)。 此外，还报道具有肝素结合域的纤维连接蛋白片段具有 促进逆转录病毒感染细胞的功能 ( 非专利文献 3)。
针对移入由体外诱导的细胞毒 T 细胞 (cytotoxic T cell ；CTL) 或末梢血淋巴细胞 等在 IL-2 和抗 CD3 抗体的作用下经放大培养得到的淋巴因子激活的细胞的免疫疗法中， 如何在将体外诱导的抗原特异性 CTL 放大培养时维持细胞毒活性、如何能在体外高效地
放大培养淋巴细胞等问题，探讨了使用纤维连接蛋白或其片段所产生的效果 ( 例如专利 文献 1 ～ 3)。
以往技术文献
专利文献
专利文献 1 国际公开第 03/016511 号小册子
专利文献 2 国际公开第 03/080817 号小册子
专利文献 3 国际公开第 2005/019450 号小册子
非专利文献
非专利文献 1 J.Immunol.，1994 年， Vol.153， p1687-1696
非专利文献 2 J.Biochem.，1991 年， Vol.110， No.2， p284-291
非专利文献 3 Nature Medicine，1996 年， Vol.2， No.8， p876-882 发明内容
在 CIK 细胞的放大培养过程中， PBMC 分化为多个性质不同的细胞群，因此放 大后的细胞群中的 CIK 细胞比例必定不高。 另一方面，在分化得到的细胞群中还含有具 有控制或抑制免疫的功能的细胞群。 本发明的目的在于提供用于制造被称为过继免疫疗 法的优选细胞群的 CIK 细胞的、不必要的细胞群含量少的癌治疗用细胞群的放大培养方 法。下面，对本发明进行概述。 本发明的第 1 发明涉及含有 CIK 细胞的细胞群的制 造方法，其特征在于，包含如下工序，即在纤维连接蛋白片段的存在下，培养含有能分 化成细胞因子诱导杀伤细胞的细胞的细胞群。 第 1 发明的方式可提供在含有选自 VLA-4 结合域、 VLA-5 结合域以及肝素结合域中的区域的纤维连接蛋白片段的存在下，实施培 养的含有 CIK 细胞的细胞群的制造方法。
另外，作为第 1 发明中使用的纤维连接蛋白片段的优选例子，可例举含有选自 序列号 1、2 以及 5 中的氨基酸序列的纤维连接蛋白片段。 此外，作为第 1 发明的优选方 式，还提供在 CD3 配体、干扰素 -γ 以及白细胞介素 -2 的共存下实施纤维连接蛋白片段 存在下的培养的含有 CIK 细胞的细胞群的制造方法。 作为 CD3 配体，只要能在本发明中 使用即可，没有限制，优选使用抗 CD3 抗体来实施。
本发明的第 2 发明涉及用本发明第 1 发明的方法得到的含有 CIK 细胞的细胞群。
本发明的第 3 发明涉及含有本发明第 2 发明的细胞群为有效成分的药品。
本发明的第 4 发明涉及包含如下工序的疾病治疗方法或预防方法，所述工序中 向对象给予有效量的本发明第 2 发明的细胞群。 另外，所述疾病只要是对本发明第 2 发 明的细胞群具有感受性的疾病即可。 此外，第 2 发明的细胞群可以是来自身患需要治疗 或预防的疾病且接受该细胞群给药的对象 ( 患者 ) 的细胞群，根据情况也可以是来自对象 以外的供者的细胞群。
本发明的第 5 发明涉及用于药品制造的第 2 发明的细胞群的使用。
通过本发明的制造方法提供能大量放大培养富含具有高细胞毒活性的 CIK 细胞 的细胞群的制造方法。 由该制造方法大量得到的高品质细胞群在生物体内发挥高效的治 疗效果，因此对利用细胞医疗的疾病治疗极其有用。
附图说明
图 1 是表示纤维连接蛋白的结构域的示意图。 图 2 是表示用放大培养得到的细胞群的表型。具体实施方式
本发明发现通过在纤维连接蛋白片段的存在下培养 PBMC，在得到的细胞群中 高比例含有在细胞表面表达 CD3、 CD56 两分子的细胞，从而完成了本发明。
下面，具体说明本发明。
(1) 本发明中使用的纤维连接蛋白的片段
本说明书中所述的纤维连接蛋白的片段可以是天然得到的片段 ( 天然的纤维连 接蛋白经酶解片段化后得到的片段等 ) 或通过 DNA 重组技术得到的片段中的任一种。 纤 维连接蛋白片段，例如可根据鲁斯特 ( ルオスラ一テイ )E. 等 [J.Biol.Chem.，第 256 卷， 第 14 号，第 7277 ～ 7281 页 (1981)] 中公开的内容，由来自天然的物质以实质上为纯物 质的形态来制造。 这里，本说明书中所述的实质上纯的纤维连接蛋白片段指本质上不含 有天然情况下与纤维连接蛋白一起存在的其他蛋白质。 本发明中，纤维连接蛋白片段可 以使用单一的分子种，也可以混合使用多个分子种。
本发明中能使用的纤维连接蛋白片段及该片段的制备相关的有用信息可通过非 专利文献 2 以及 Kornblihtt A.R. 等 [EMBO J.，第 4 卷，第 7 号，1755 ～ 1759(1985)]、 Sekiguchi K. 等 [Biochemistry， 第 25 卷， 第 17 号，4936 ～ 4941(1986)] 等 而 得。 另 外，编码纤维连接蛋白的核酸序列或纤维连接蛋白的氨基酸序列已在 Genbank Accession No.NM_002026， NP_002017 中公开。
本发明可优选使用具有细胞粘附活性和 / 或肝素结合活性的纤维连接蛋白片 段。
纤维连接蛋白中存在具有与细胞表面的整合蛋白结合的活性的区域。 作为上述 区域，可例举 VLA( 极晚抗原 )-4、 VLA-5 结合域。
在纤维连接蛋白的靠近 C 末端侧的部位存在被称为 IIICS 的区域。 其中含有被 称为 CS-1 的由 25 个氨基酸序列构成的区域，该区域对 VLA-4 表现出结合活性。 CS-1 区域的氨基酸序列如序列表的序列号 1 所示。
另外，在纤维连接蛋白中存在被称为 III 型的重复序列，在从 N 末端侧开始第 10 个 III 型重复序列中存在与细胞结合的区域。 第 10 个 III 型重复序列的氨基酸序列如序列 表的序列号 2 所示。 上述序列中在与 VLA-5 的结合中起主要作用的序列为序列表的序列 号 3 所示的 Arg-Gly-Asp-Ser(RGDS) 四氨基酸。 由序列表的序列号 4 所示的氨基酸序列 组成的 C-274 是含有序列号 2 的氨基酸序列的多肽，是具有强的细胞粘附活性的重组纤维 连接蛋白片段。
此外，纤维连接蛋白具有与肝素结合的活性。 纤维连接蛋白的肝素结合域相当 于上述 III 型重复序列的 N 末端侧开始的第 12 ～第 14 个。 由序列表的序列号 5 所示的氨 基酸序列组成的 H-271 是由此肝素结合域组成的重组纤维连接蛋白片段。
本发明除了可以使用单独含有各区域的片段外，还可以使用上述区域中 2 个以上直接或介以合适的接头结合而成的片段。 上述片段中含有的来自纤维连接蛋白的区 域可以相同也可以不同。 作为分子内具有多个结合域的纤维连接蛋白的片段，可例举 含有 VLA-4 结合域和肝素结合域的 H-296( 序列表的序列号 6 表示的氨基酸序列 )、含 有 VLA-5 结合域和肝素结合域的 CH-271( 序列表的序列号 7 表示的氨基酸序列 )、含有 VLA-4 结合域、VLA-5 结合域和肝素结合域的 CH-296( 序列表的序列号 8 表示的氨基酸 序列 )、含有 VLA-4 结合域和 VLA-5 结合域的 C-CS1( 序列表的序列号 9 表示的氨基酸 序列 ) 等多肽。 上述各种多肽在非专利文献 2 中有记载，可以根据其公开的内容来制作。 宝生物工程株式会社以乐透露奈库秦 ( レトロネクチン )(Retronectin ：注册商标 ) 的名称 出售 CH-296。
作为本发明中使用的片段，只要能获得本发明所希望的效果，也可以是与上述 例举的含有天然纤维连接蛋白的氨基酸序列中的至少一部分的片段具有同等功能的、由 具有构成该片段的多肽的氨基酸序列经 1 个或多个氨基酸取代、缺失、插入或添加的氨 基酸序列的多肽构成的片段。 例如，使 C-274 或 H-271 缺失 1 个或 2 个 III 型重复序列 而得到的片段。
关于细胞粘附活性，可以用公知的方法测定本发明中使用的片段 ( 其细胞结合 域 ) 与细胞的结合而获得。 例如，上述方法包括威廉姆斯 ( ウイリアブズ )D.A. 等的方 法 [Nature，第 352 卷，第 438 ～ 441 页 (1991)]。 该方法是测定细胞与培养板上固定化 的片段的结合的方法。 关于肝素结合活性，可以用公知的方法测定本发明中使用的片段 ( 其肝素结合域 ) 与肝素的结合来获得。 例如，将上述威廉姆斯 D.A. 等的方法中的细胞 换成肝素，例如使用标记肝素，即可用同样的方法评价片段与肝素的结合。 从获取、操作的容易性以及品质均一性、病毒等混入的危险性低的安全层面考 虑，本发明优选使用重组纤维连接蛋白片段。 本发明中使用的纤维连接蛋白片段的分子 量没有特殊限制，优选 1 ～ 200kDa、进一步优选 5 ～ 190kDa、更优选 10 ～ 180kDa。 该 分子量例如可通过 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳来测定。
(2) 含有 CIK 细胞的细胞群的制造方法
下面，对本发明涉及的含有 CIK 细胞的细胞群的制造方法进行具体说明。 本发 明涉及富含 CIK 细胞、即以 CD3 阳性和 CD56 阳性为特征的细胞亚群的细胞群的制造方 法。 本发明方法的特征在于，包含如下工序，即 ：在上述纤维连接蛋白片段的存在下， 培养含有能分化为 CIK 细胞的细胞的细胞群。
作为本发明制造方法中使用的含有能分化为 CIK 细胞的细胞的细胞群，可例举 由末梢血、骨髓、脐带血等得到的细胞群或从这些材料中分离得到的血细胞系细胞群。 本发明优选使用 PBMC。 上述细胞群无论是从生物体采集的新鲜细胞群或冷冻保存过的 细胞群，均可用于本发明。
本发明的制造方法中对纤维连接蛋白片段的浓度没有特殊限制，但优选例如为 0.001 ～ 500μg/mL、特别是 0.01 ～ 500μg/mL。 纤维连接蛋白片段除了在培养基中溶解 而共存外，还可以在合适的固相例如培养皿、烧瓶、袋子等细胞培养用器材 ( 培养用容 器 ；包括开放体系和封闭体系的任一种 ) 或珠子、膜、载玻片等细胞培养用载体上固定 化后使用。 这些固相的材质只要是可以在细胞培养中使用的材料即可，没有特殊限制。 关于纤维连接蛋白的固定化量，根据将上述器材或载体供培养用时，按与将该成分在培
养基中溶解使用时所需的浓度相同的比例进行选择，只要能得到所需效果，没有特殊限 制。
作为纤维连接蛋白片段在固相上的固定化方法，没有特殊限制，例如可通过 使溶解于适当缓冲液中的片段与固相接触进行固定化。 另外，也可以用国际公开第 97/18318 号小册子以及国际公开第 00/09168 号小册子中记载的方法来实施纤维连接蛋白 片段的固定化。
本发明优选的方式中，在 CD3 配体的存在下进行纤维连接蛋白片段存在下的培 养。 作为 CD3 配体，只要是具有 CD3 结合活性的物质即可，没有特殊限制，可例举例如 抗 CD3 抗体，特别优选抗 CD3 单克隆抗体，例如 OKT3[J.Immunol.，第 124 卷，第 6 号， 2708 ～ 2713(1980)]。 CD3 配体在培养基中的浓度没有特殊限制，例如在使用抗 CD3 单 克隆抗体的情况下，优选例如 0.001 ～ 500μg/mL、特别是 0.01 ～ 100μg/mL。 CD3 抗 体也可以通过与纤维连接蛋白片段同样的操作在细胞培养用器材或细胞培养用载体上固 定化后使用。
若将纤维连接蛋白片段、 CD3 配体在固相上固定化，则培养结束后，只要将 细胞与固相分离即可容易地将上述成分与得到的细胞群分离，能防止上述成分混入细胞 群。 本发明的含有 CIK 细胞的细胞群的制造方法中使用的培养基，没有特殊限制， 可以使用淋巴细胞放大培养等中能使用的公知的培养基，例如可以适当地选择使用市售 培养基。 上述培养基除其原有的构成成分外，还可以含有细胞因子类、适当的蛋白质及 其他成分。 通常，本发明使用含有 IFN-γ、IL-2 的培养基。 IFN-γ 在培养基中的浓度 没有特殊限制，可以是 50 ～ 10000U/mL，更优选 100 ～ 5000U/mL。 IL-2 在培养基中 的浓度也没有特殊限制，可以是 10 ～ 5000U/mL，优选 50 ～ 2000U/mL。 此外，还可以 在培养基中添加 IL-1α、 IL-7、 IL-12 等细胞因子类。 只要能获得所需效果，该成分在 培养基中的浓度不受特殊限制。
在培养基中可以添加血清或血浆进行培养。 它们在培养基中的添加量不受特殊 限制，如大于 0 容量％至 20 容量％，且可以根据不同的培养阶段而改变血清或血浆的用 量。 例如，可以阶段性减少血清或血浆浓度来使用。 另外，作为血清或血浆的来源，可 以是自己 ( 意味着与所培养的细胞来源相同 ) 或非自己 ( 意味着与所培养的细胞的来源不 同 ) 中的任一种，从安全性的观点出发，优选自己来源的血清或血浆。 另外，也可以添 加如人血清白蛋白之类经分离纯化的血清成分。
本发明的含有 CIK 细胞的细胞群的制造除了使用纤维连接蛋白片段外，使用上 述各种成分及培养基来实施。 本发明中使用的培养开始时的细胞数没有特殊限制，例如 优选 1×104cell/mL ～ 1×108cells/mL、更优选 1×105cell/mL ～ 5×107cells/mL。 另外， 培养条件也没有特殊限制，可以使用通常的细胞培养中使用的条件。 例如，可在 37℃、 5％ CO2 等条件下培养。 还可以实施如下等操作 ：间隔适当的时间添加新鲜培养基来稀 释细胞培养液，或更换培养基，或更换细胞培养用器材等。
本发明的制造方法中可以使用例如培养皿、烧瓶、袋子、大型培养槽、生物反 应器等细胞培养用器材 ( 容器 )。 作为袋子，优选细胞培养用 CO2 气体透过性袋子。 在 需要大量细胞的情况下，可以使用大型培养槽。 培养可以在开放体系或封闭体系中的任
一体系中实施，但优选在封闭体系中实施培养。
本发明含有 CIK 细胞的细胞群的制造方法中，对培养期没有特殊限制，例如可 以实施总天数为 4 ～ 30 天、优选 6 ～ 25 天的培养。 在本发明的制造方法中，纤维连接 蛋白片段存在下的培养可以是培养期的整个期间，也可以是任意的一部分期间。 即，只 要在细胞培养工序的一部分中包含纤维连接蛋白片段存在下的培养工序的培养即属于本 发明。 特别优选整个培养期的至少初期阶段在纤维连接蛋白片段的存在下实施培养，更 优选在纤维连接蛋白片段的存在下开始培养。 最好是将本发明的有效成分存在下的培养 在培养开始后至少实施 1 天以上、更优选 2 天以上。 当培养时使用 CD3 配体时，其使用 时期没有特殊限制，例如在纤维连接蛋白片段使用时使 CD3 配体共存。
本发明的一个优选方式中，仅在整个培养期的初期阶段使用纤维连接蛋白片段 和 CD3 配体。 在本发明中没有特别限定，例如，从培养开始时到第 7 天为止，优选从培 养开始时到第 5 天为止，在纤维连接蛋白片段和 CD3 配体的共同存在下实施培养，之后 在这两种成分均不存在的条件下继续培养，制造含有 CIK 细胞的细胞群。
此外，本发明的制造方法还可以包含如下工序，即从用上述方法得到的细胞群 中进一步分离出 CD3 阳性、 CD56 阳性的细胞群。 关于分离，例如可以用使用细胞分选 仪、磁珠、亲和柱等的公知手段来进行。 如此分离得到的细胞群富含具有高细胞毒活性 的细胞，可期待其发挥更好的治疗效果。 (3) 含有 CIK 细胞的细胞群
本发明提供用上述本发明的含有 CIK 细胞的细胞群的制造方法得到的含有 CIK 细胞的细胞群。 本发明的含有 CIK 细胞的细胞群与用以往方法制得的含有 CIK 细胞的细 胞群相比，由于高比例地含有 CD3 阳性 CD56 阳性细胞，因此在生物体内发挥更强的细 胞毒活性，达到很好的治疗效果。 此外，上述细胞群还具有如下优点，即具有抑制细胞 性免疫作用的调节性 T 细胞 (regulatory T cells ；Treg 细胞 ) 的含量低，因此非常利于在治 疗上应用。
本发明还提供以含有 CIK 细胞的细胞群为有效成分的药品 ( 治疗剂或预防剂 )。 含有该细胞群的上述治疗剂适用于免疫疗法。 免疫疗法中，例如通过注射或点滴等的 静脉、动脉、皮下、腹腔内等给药方法向患者给予适于患者治疗的含有 CIK 细胞的细胞 群。 本发明的治疗剂对于例如癌症、白血病、恶性肿瘤、肝炎或感染性疾病 ( 例如流 感、结核、 AIDS、 MRSA 感染症、 VRE 感染症、深层真菌症 ) 等对 CIK 细胞具有感受 性的疾病的治疗非常有用，但本发明并不限于此。 另外，该治疗剂也可以在以预防骨髓 移植或放射线照射后的感染症、缓减复发白血病症状为目的的供者淋巴细胞输注等中应 用。
本发明的治疗剂、预防剂可以根据制药领域的公知方法来制备，例如以用本发 明的方法制得的细胞群为有效成分，与公知的适于非口服给药的有机或无机的载体、赋 形剂、稳定剂等混合，制成点滴剂、注射剂。 另外，治疗剂中本发明的含有 CIK 细胞 的细胞群的含量、治疗剂的给药量、与该治疗剂相关的各种条件可根据公知的免疫疗 法来适当地决定。 例如，药品中本发明的含有 CIK 细胞的细胞群的含量，没有特殊限 制，例如优选 1×103 ～ 1×1011cells/mL，进一步优选 1×104 ～ 1×1010cells/mL，更优选 1×105 ～ 2×109cells/mL。 另外，作为本发明药品的给药量，没有特殊限制，例如成人
每日优选为 1×106 ～ 1×1012cells/ 天，进一步优选为 1×107 ～ 5×1011cells/ 天，更优选 为 1×108 ～ 2×1011cells/ 天。 此外，采用该治疗剂的免疫疗法可以与公知的通过给予药 物的药物治疗或放射治疗、外科手术治疗并用。
本发明的含有 CIK 细胞的细胞群的制造方法还可以进一步包括在该细胞群中导 入外源基因的工序。 另外， “外源基因” 指向基因导入对象的 CIK 细胞中人为导入的基 因，也包括来自与作为基因导入对象的细胞同种细胞的基因。
外源基因的导入手段没有特殊限制，可以从公知的基因导入方法中选择使用适 当的方法。 基因导入工序可以在本发明制造方法中的任意时刻实施。 从作业效率的观点 出发，例如优选与上述细胞群的制造同时或中途或在该工序后实施。 可以用病毒载体来 实施基因导入，也可以不使用病毒载体。 其方法的具体内容已在众多文献中公开。
上述病毒载体没有特殊限制，通常使用基因导入方法中使用的公知的病毒载 体，例如逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺伴随病毒载体、猿猴病毒载 体、痘苗病毒载体或仙台病毒载体等。 特别优选能将外源基因稳定地整合到被导入的细 胞的染色体 DNA 中的逆转录病毒载体、慢病毒载体。 作为上述病毒载体，优选在感染的 细胞中无法自我复制的复制能力欠缺的载体。 另外，在基因导入时，也可以使用乐透露 奈库秦 ( 注册商标，宝生物工程株式会社制 ) 等能提高基因导入效率的物质。
作为不使用病毒载体的基因导入方法，可以采用使用核糖体、配体 - 聚赖氨酸 等载体的方法或磷酸钙法、电穿孔法、基因枪法等。 此时，整合在质粒 DNA、直链状 DNA 或 RNA 中的外源基因被导入。
导入的外源基因没有特殊限制，可以使用希望导入上述细胞的任意基因 ( 例 如编码酶、细胞因子类、受体类等蛋白质的基因以及编码反义核酸或 siRNA( 小干扰 RNA)、核酶的基因 )。 这些外源基因例如以在适宜启动子的控制下表达的方式插入载体 或质粒等中来使用。 另外，载体中也可以存在增强序列或终止序列之类的控制序列。
根据本法明的方法，可以通过导入与对癌症等患者的治疗中所用的药物的耐性 相关的酶的编码基因 ( 例如多药抗药性基因 ) 来赋予含有 CIK 细胞的细胞群以抗药性。 若使用这样的细胞群，则可以将免疫疗法与药物疗法组合，因而可以得到更好的治疗效 果。 另一方面，与上述方式相反，通过导入赋予针对特定药物感受性的基因 ( 例如胸苷 激酶基因 ) 也可以赋予含有 CIK 细胞的细胞群以针对该药物的感受性。 此时，通过给予 该药物即可除去移植到生物体后的细胞。
本发明还提供包括向对象给予有效量的通过上述方法得到的含有 CIK 细胞的细 胞群的疾病治疗方法或预防方法。 本说明书中的对象表示例如为身患上述疾病的患者。
本说明书中的有效量指给予上述含有 CIK 细胞的细胞群后能达到治疗或预防效 果的该细胞群的量。 具体的有效量因给药形态、给药方法、使用目的以及对象的年龄、 体重、症状等来适当设定，并非定值。 给药方法没有限制，例如可以与上述药品同样， 通过点滴或注射等来给药。
另外，本发明还提供用于药品制造的含有 CIK 细胞的细胞群的使用。 该药品 的制造方法与上述药品相同。 此外，对给予该药品的疾病没有特殊限制，与上述药品相 同。
实施例下面，结合实施例对本发明做更具体的描述，但本发明不限于此。
实施例 1 使用了纤维连接蛋白片段 CH-296 的 CIK 细胞的放大培养
(1)PBMC 的分离
对知情同意的 5 位患者 ( 肾癌 2 名、肺癌、肝癌和甲状腺癌各 1 名 ) 进行成分 采血后，将含有 PBMC 的细胞组分在 Ficoll 上重叠离心，回收中间层的末梢血单核细胞 (PBMC)。
(2) 抗人 CD3 抗体和 CH-296 的固定化
在 T225 烧瓶中添加含有最终浓度为 5μg/mL 的抗人 CD3 抗体和最终浓度为 15μg/mL 的 CH-296( 乐透露奈库秦 ( 注册商标 )，宝生物工程株式会社制 ) 的磷酸缓冲 生理盐水 (PBS)40mL 或仅含有最终浓度为 5μg/mL 的抗人 CD3 抗体的 PBS 40mL，然 后在 4℃培养过夜。 临使用前从该培养器材吸引除去含有抗体、CH-296 的 PBS，然后用 PBS 清洗 2 次，供各试验用。
(3)CIK 细胞的放大培养
将实施例 1-(2) 中分离得到的 PBMC 9×108cells 悬浮在含有 0.2 ％人血清白蛋 白、1000U/mL IFN-γ、300U/mL IL-2 的 60ml 的 GT-T503 培养基 ( 宝生物工程株式会社 制、以下记作 “完全 GT-T503 培养基” ) 中，添加到实施例 1-(2) 中制作的 4 个抗 CD3 抗体以及 CH-296 固定化 T225 烧瓶或 4 个抗 CD3 抗体固定化 T225 烧瓶中，在 5％ CO2 中在 37℃下开始培养 ( 培养第 0 天 )。
第 1 天 ( 培养开始的次日 )，向各烧瓶添加 150mL 的完全 GT-T503 培养基，继 续培养。
第 4 天，将各烧瓶内的细胞悬浮在培养基中全部收集，转移到未固定化透气性 培养袋 CultiLife Eva( 宝生物工程株式会社制 )。 此时，添加完全 GT-T503 培养基使每只 袋子为 700mL，在 5％ CO2 中在 37℃下培养。
第 7 天和第 9 天，向各袋子中添加完全 GT-T503 培养基 400mL 进行继代培养， 继续培养至第 14 天。 最终每只袋子的培养液为 1500mL。
计算培养最后一天的活细胞数，与培养开始时的细胞数进行比较，算出放大培 养率。 结果如表 1 所示。 另外，用抗 CD3 抗体和 CH-296 刺激而增加的 CIK 细胞记为 R-CIKs，仅用抗 CD3 抗体刺激而增加的 CIK 细胞记为 C-CIKs。
表1
放大培养率 ( 倍 ) C-CIKs R-CIKs
9.2 35.7由表 1 可知，通过在培养初期使纤维连接蛋白片段共存，可以显著提高 CIK 细胞 增加率。
(4)CIK 细胞表型分析
用荧光标记了的抗体将细胞染色后，提供给流式细胞仪，对实施例 1-(3) 中制备的 C-CIKs 和 R-CIKs 的表型进行分析。 CD3 阳性细胞、 CD4 阳性细胞、 CD8 阳性细 胞分别用抗 CD3 抗体、抗 CD4 抗体、抗 CD8 抗体进行染色。 CD3 阳性 CD56 阳性细胞 用抗 CD3 抗体和抗 CD56 抗体进行染色，作为双阳性细胞进行评价。 Treg 细胞用抗 CD4 抗体、抗 CD25 抗体以及抗 CD127 抗体进行染色，作为 CD4 阳性 CD25 阳性 CD127 阴性 细胞进行评价。
其结果如图 1 所示。 图中，横坐标表示检测到的表面抗原，纵坐标表示表面抗 原的阳性率。
由图 1 可知，刺激时使用纤维连接蛋白片段而制备的细胞群中，Treg 细胞的比率 显著下降。 众所周知 Treg 细胞具有使抗肿瘤免疫活性下降的作用，因此将要移入的 CIK 细胞中的 Treg 细胞比率低这就意味着能得到好的抗肿瘤效果。
实施例 2 CIK 细胞的抗肿瘤效果
(1) 向癌症患者移入 CIK 细胞
向各癌症患者，以 4 天间移入 2 次实施例 1 制备的来自自己的 R-CIKs 作为一轮 给药，平均给予 3.9×1010 个。 对所有患者至少进行 2 轮给药，对其中的一名患者进行 3 轮给药。
(2) 抗肿瘤效果 在所有 R-CIKs 给药的癌症患者中均未发现伴随细胞给药而产生的严重的不良迹象。 通过 R-CIKs 给药，在所有患者中均发现临床症状改善、生理功能恢复。 另外， 在甲状腺癌患者中发现作为肿瘤标记的降钙素显著减少。 此外，通过 PET-CT 测定肺癌 患者肿瘤大小，结果发现肿瘤缩小约 50％。
综上所述可知， R-CIKs 是非常安全的抗肿瘤效果好的细胞制剂。
产业上利用的可能性
PBMC 经放大培养而分化成多个细胞群，分化得到的细胞群中含有控制或抑制 免疫的细胞群。 根据本发明，通过将被称为现有过继免疫疗法中优选细胞群的 CIK 细胞 进行放大培养，能提供大量非必要细胞群的含量少的高品质细胞群。 通过本发明得到的 细胞群是使用该细胞群的过继免疫疗法中极为有用的具有显著效果的细胞群。
序列表自由内容
SEQ ID NO ：1 ；纤维连接蛋白的局部区域 CS-1。
SEQ ID NO ：2 ；纤维连接蛋白的局部区域 III-10。
SEQ ID NO ：3 ；III-10 中的纤维连接蛋白的局部区域。
SEQ ID NO ：4 ；纤维连接蛋白片段 C-274。
SEQ ID NO ：5 ；纤维连接蛋白片段 H-271。
SEQ ID NO ：6 ；纤维连接蛋白片段 H-296。
SEQ ID NO ：7 ；纤维连接蛋白片段 CH-271。
SEQ ID NO ：8 ；纤维连接蛋白片段 CH-296。
SEQ ID NO ：9 ；纤维连接蛋白片段 C-CS1。
背景技术 近年来，人们重新审视药物疗法和放射疗法之类的给患者带来严重肉体痛苦的 治疗方法，开始越来越关注痛苦小的免疫疗法。 该疗法包括例如过继免疫疗法，其对取 出至体外的免疫相关细胞进行培养使其细胞数目增加，和 / 或增强与治疗效果相关的活 性后，再移植给患者。
过 继 免 疫 疗 法 中 作 为 效 应 细 胞 而 利 用 的 细 胞， 已 知 有 淋 巴 因 子 激 活 的 杀 伤 (lymphokine activated killer ；LAK) 细 胞、 肿 瘤 浸 润 淋 巴 细 胞 (tumour infiltrating lymphocyte ；TIL) 以及细胞因子诱导杀伤 (cytokine-induced killer ；CIK) 细胞。
LAK 细胞是通过在白细胞介素 (IL)-2 存在下使淋巴细胞增殖而得到的细胞群， 具有能溶解肿瘤细胞但不溶解正常细胞的性质。 关于 LAK 细胞的制备，已开发出在培养 时使抗 CD3 抗体与 IL-2 共存的方法。
TIL 是浸润到了肿瘤组织的 T 细胞，与 LAK 细胞相比，具有更显著的肿瘤抗原 特异性。 该细胞也可以在体外增殖并用于治疗。 但是，TIL 必须摘取患者的肿瘤组织才 能获得，因此采集操作繁杂，得到的细胞数也很少。
CIK 细胞可由末梢血单核细胞 (PBMC) 在干扰素 (IFN)-γ、抗 CD3 抗体以及 IL-2 的存在下进行培养来制备。 CIK 细胞是作为含有 CD3 阳性、 CD56 阳性细胞的细胞 群而具有特征的 PBMC 中稀有细胞群，但在没有靶细胞的存在下可以使该细胞群优先增 殖。 CIK 细胞在体内发挥比 LAK 细胞更胜一筹的针对肿瘤细胞的细胞杀伤活性 ( 例如非 专利文献 1)。
纤维连接蛋白是存在于动物血液、培养细胞表面、组织的细胞外基质中的分子 量 25 万的巨大糖蛋白，已知具有多种功能。 其结构域有 7 个 ( 参照图 1)。 而且，其氨 基酸序列中含有 3 种类似的序列，由上述各序列的重复构成整体。 3 种类似的序列分别被 称为 I 型、II 型、III 型。 其中，III 型由 71 ～ 96 个氨基酸残基构成，这些氨基酸残基的 一致率为 17 ～ 40％。
利用 DNA 重组技术，制得多种纤维连接蛋白的片段，可期待其中有些具有抑制 癌转移的作用 ( 非专利文献 2)。 此外，还报道具有肝素结合域的纤维连接蛋白片段具有 促进逆转录病毒感染细胞的功能 ( 非专利文献 3)。
针对移入由体外诱导的细胞毒 T 细胞 (cytotoxic T cell ；CTL) 或末梢血淋巴细胞 等在 IL-2 和抗 CD3 抗体的作用下经放大培养得到的淋巴因子激活的细胞的免疫疗法中， 如何在将体外诱导的抗原特异性 CTL 放大培养时维持细胞毒活性、如何能在体外高效地
过 继 免 疫 疗 法 中 作 为 效 应 细 胞 而 利 用 的 细 胞， 已 知 有 淋 巴 因 子 激 活 的 杀 伤 (lymphokine activated killer ；LAK) 细 胞、 肿 瘤 浸 润 淋 巴 细 胞 (tumour infiltrating lymphocyte ；TIL) 以及细胞因子诱导杀伤 (cytokine-induced killer ；CIK) 细胞。
LAK 细胞是通过在白细胞介素 (IL)-2 存在下使淋巴细胞增殖而得到的细胞群， 具有能溶解肿瘤细胞但不溶解正常细胞的性质。 关于 LAK 细胞的制备，已开发出在培养 时使抗 CD3 抗体与 IL-2 共存的方法。
TIL 是浸润到了肿瘤组织的 T 细胞，与 LAK 细胞相比，具有更显著的肿瘤抗原 特异性。 该细胞也可以在体外增殖并用于治疗。 但是，TIL 必须摘取患者的肿瘤组织才 能获得，因此采集操作繁杂，得到的细胞数也很少。
CIK 细胞可由末梢血单核细胞 (PBMC) 在干扰素 (IFN)-γ、抗 CD3 抗体以及 IL-2 的存在下进行培养来制备。 CIK 细胞是作为含有 CD3 阳性、 CD56 阳性细胞的细胞 群而具有特征的 PBMC 中稀有细胞群，但在没有靶细胞的存在下可以使该细胞群优先增 殖。 CIK 细胞在体内发挥比 LAK 细胞更胜一筹的针对肿瘤细胞的细胞杀伤活性 ( 例如非 专利文献 1)。
纤维连接蛋白是存在于动物血液、培养细胞表面、组织的细胞外基质中的分子 量 25 万的巨大糖蛋白，已知具有多种功能。 其结构域有 7 个 ( 参照图 1)。 而且，其氨 基酸序列中含有 3 种类似的序列，由上述各序列的重复构成整体。 3 种类似的序列分别被 称为 I 型、II 型、III 型。 其中，III 型由 71 ～ 96 个氨基酸残基构成，这些氨基酸残基的 一致率为 17 ～ 40％。
利用 DNA 重组技术，制得多种纤维连接蛋白的片段，可期待其中有些具有抑制 癌转移的作用 ( 非专利文献 2)。 此外，还报道具有肝素结合域的纤维连接蛋白片段具有 促进逆转录病毒感染细胞的功能 ( 非专利文献 3)。
针对移入由体外诱导的细胞毒 T 细胞 (cytotoxic T cell ；CTL) 或末梢血淋巴细胞 等在 IL-2 和抗 CD3 抗体的作用下经放大培养得到的淋巴因子激活的细胞的免疫疗法中， 如何在将体外诱导的抗原特异性 CTL 放大培养时维持细胞毒活性、如何能在体外高效地
放大培养淋巴细胞等问题，探讨了使用纤维连接蛋白或其片段所产生的效果 ( 例如专利 文献 1 ～ 3)。
以往技术文献
专利文献
专利文献 1 国际公开第 03/016511 号小册子
专利文献 2 国际公开第 03/080817 号小册子
专利文献 3 国际公开第 2005/019450 号小册子
非专利文献
非专利文献 1 J.Immunol.，1994 年， Vol.153， p1687-1696
非专利文献 2 J.Biochem.，1991 年， Vol.110， No.2， p284-291
非专利文献 3 Nature Medicine，1996 年， Vol.2， No.8， p876-882 发明内容
在 CIK 细胞的放大培养过程中， PBMC 分化为多个性质不同的细胞群，因此放 大后的细胞群中的 CIK 细胞比例必定不高。 另一方面，在分化得到的细胞群中还含有具 有控制或抑制免疫的功能的细胞群。 本发明的目的在于提供用于制造被称为过继免疫疗 法的优选细胞群的 CIK 细胞的、不必要的细胞群含量少的癌治疗用细胞群的放大培养方 法。下面，对本发明进行概述。 本发明的第 1 发明涉及含有 CIK 细胞的细胞群的制 造方法，其特征在于，包含如下工序，即在纤维连接蛋白片段的存在下，培养含有能分 化成细胞因子诱导杀伤细胞的细胞的细胞群。 第 1 发明的方式可提供在含有选自 VLA-4 结合域、 VLA-5 结合域以及肝素结合域中的区域的纤维连接蛋白片段的存在下，实施培 养的含有 CIK 细胞的细胞群的制造方法。
另外，作为第 1 发明中使用的纤维连接蛋白片段的优选例子，可例举含有选自 序列号 1、2 以及 5 中的氨基酸序列的纤维连接蛋白片段。 此外，作为第 1 发明的优选方 式，还提供在 CD3 配体、干扰素 -γ 以及白细胞介素 -2 的共存下实施纤维连接蛋白片段 存在下的培养的含有 CIK 细胞的细胞群的制造方法。 作为 CD3 配体，只要能在本发明中 使用即可，没有限制，优选使用抗 CD3 抗体来实施。
本发明的第 2 发明涉及用本发明第 1 发明的方法得到的含有 CIK 细胞的细胞群。
本发明的第 3 发明涉及含有本发明第 2 发明的细胞群为有效成分的药品。
本发明的第 4 发明涉及包含如下工序的疾病治疗方法或预防方法，所述工序中 向对象给予有效量的本发明第 2 发明的细胞群。 另外，所述疾病只要是对本发明第 2 发 明的细胞群具有感受性的疾病即可。 此外，第 2 发明的细胞群可以是来自身患需要治疗 或预防的疾病且接受该细胞群给药的对象 ( 患者 ) 的细胞群，根据情况也可以是来自对象 以外的供者的细胞群。
本发明的第 5 发明涉及用于药品制造的第 2 发明的细胞群的使用。
通过本发明的制造方法提供能大量放大培养富含具有高细胞毒活性的 CIK 细胞 的细胞群的制造方法。 由该制造方法大量得到的高品质细胞群在生物体内发挥高效的治 疗效果，因此对利用细胞医疗的疾病治疗极其有用。
附图说明
图 1 是表示纤维连接蛋白的结构域的示意图。 图 2 是表示用放大培养得到的细胞群的表型。具体实施方式
本发明发现通过在纤维连接蛋白片段的存在下培养 PBMC，在得到的细胞群中 高比例含有在细胞表面表达 CD3、 CD56 两分子的细胞，从而完成了本发明。
下面，具体说明本发明。
(1) 本发明中使用的纤维连接蛋白的片段
本说明书中所述的纤维连接蛋白的片段可以是天然得到的片段 ( 天然的纤维连 接蛋白经酶解片段化后得到的片段等 ) 或通过 DNA 重组技术得到的片段中的任一种。 纤 维连接蛋白片段，例如可根据鲁斯特 ( ルオスラ一テイ )E. 等 [J.Biol.Chem.，第 256 卷， 第 14 号，第 7277 ～ 7281 页 (1981)] 中公开的内容，由来自天然的物质以实质上为纯物 质的形态来制造。 这里，本说明书中所述的实质上纯的纤维连接蛋白片段指本质上不含 有天然情况下与纤维连接蛋白一起存在的其他蛋白质。 本发明中，纤维连接蛋白片段可 以使用单一的分子种，也可以混合使用多个分子种。
本发明中能使用的纤维连接蛋白片段及该片段的制备相关的有用信息可通过非 专利文献 2 以及 Kornblihtt A.R. 等 [EMBO J.，第 4 卷，第 7 号，1755 ～ 1759(1985)]、 Sekiguchi K. 等 [Biochemistry， 第 25 卷， 第 17 号，4936 ～ 4941(1986)] 等 而 得。 另 外，编码纤维连接蛋白的核酸序列或纤维连接蛋白的氨基酸序列已在 Genbank Accession No.NM_002026， NP_002017 中公开。
本发明可优选使用具有细胞粘附活性和 / 或肝素结合活性的纤维连接蛋白片 段。
纤维连接蛋白中存在具有与细胞表面的整合蛋白结合的活性的区域。 作为上述 区域，可例举 VLA( 极晚抗原 )-4、 VLA-5 结合域。
在纤维连接蛋白的靠近 C 末端侧的部位存在被称为 IIICS 的区域。 其中含有被 称为 CS-1 的由 25 个氨基酸序列构成的区域，该区域对 VLA-4 表现出结合活性。 CS-1 区域的氨基酸序列如序列表的序列号 1 所示。
另外，在纤维连接蛋白中存在被称为 III 型的重复序列，在从 N 末端侧开始第 10 个 III 型重复序列中存在与细胞结合的区域。 第 10 个 III 型重复序列的氨基酸序列如序列 表的序列号 2 所示。 上述序列中在与 VLA-5 的结合中起主要作用的序列为序列表的序列 号 3 所示的 Arg-Gly-Asp-Ser(RGDS) 四氨基酸。 由序列表的序列号 4 所示的氨基酸序列 组成的 C-274 是含有序列号 2 的氨基酸序列的多肽，是具有强的细胞粘附活性的重组纤维 连接蛋白片段。
此外，纤维连接蛋白具有与肝素结合的活性。 纤维连接蛋白的肝素结合域相当 于上述 III 型重复序列的 N 末端侧开始的第 12 ～第 14 个。 由序列表的序列号 5 所示的氨 基酸序列组成的 H-271 是由此肝素结合域组成的重组纤维连接蛋白片段。
本发明除了可以使用单独含有各区域的片段外，还可以使用上述区域中 2 个以上直接或介以合适的接头结合而成的片段。 上述片段中含有的来自纤维连接蛋白的区 域可以相同也可以不同。 作为分子内具有多个结合域的纤维连接蛋白的片段，可例举 含有 VLA-4 结合域和肝素结合域的 H-296( 序列表的序列号 6 表示的氨基酸序列 )、含 有 VLA-5 结合域和肝素结合域的 CH-271( 序列表的序列号 7 表示的氨基酸序列 )、含有 VLA-4 结合域、VLA-5 结合域和肝素结合域的 CH-296( 序列表的序列号 8 表示的氨基酸 序列 )、含有 VLA-4 结合域和 VLA-5 结合域的 C-CS1( 序列表的序列号 9 表示的氨基酸 序列 ) 等多肽。 上述各种多肽在非专利文献 2 中有记载，可以根据其公开的内容来制作。 宝生物工程株式会社以乐透露奈库秦 ( レトロネクチン )(Retronectin ：注册商标 ) 的名称 出售 CH-296。
作为本发明中使用的片段，只要能获得本发明所希望的效果，也可以是与上述 例举的含有天然纤维连接蛋白的氨基酸序列中的至少一部分的片段具有同等功能的、由 具有构成该片段的多肽的氨基酸序列经 1 个或多个氨基酸取代、缺失、插入或添加的氨 基酸序列的多肽构成的片段。 例如，使 C-274 或 H-271 缺失 1 个或 2 个 III 型重复序列 而得到的片段。
关于细胞粘附活性，可以用公知的方法测定本发明中使用的片段 ( 其细胞结合 域 ) 与细胞的结合而获得。 例如，上述方法包括威廉姆斯 ( ウイリアブズ )D.A. 等的方 法 [Nature，第 352 卷，第 438 ～ 441 页 (1991)]。 该方法是测定细胞与培养板上固定化 的片段的结合的方法。 关于肝素结合活性，可以用公知的方法测定本发明中使用的片段 ( 其肝素结合域 ) 与肝素的结合来获得。 例如，将上述威廉姆斯 D.A. 等的方法中的细胞 换成肝素，例如使用标记肝素，即可用同样的方法评价片段与肝素的结合。 从获取、操作的容易性以及品质均一性、病毒等混入的危险性低的安全层面考 虑，本发明优选使用重组纤维连接蛋白片段。 本发明中使用的纤维连接蛋白片段的分子 量没有特殊限制，优选 1 ～ 200kDa、进一步优选 5 ～ 190kDa、更优选 10 ～ 180kDa。 该 分子量例如可通过 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳来测定。
(2) 含有 CIK 细胞的细胞群的制造方法
下面，对本发明涉及的含有 CIK 细胞的细胞群的制造方法进行具体说明。 本发 明涉及富含 CIK 细胞、即以 CD3 阳性和 CD56 阳性为特征的细胞亚群的细胞群的制造方 法。 本发明方法的特征在于，包含如下工序，即 ：在上述纤维连接蛋白片段的存在下， 培养含有能分化为 CIK 细胞的细胞的细胞群。
作为本发明制造方法中使用的含有能分化为 CIK 细胞的细胞的细胞群，可例举 由末梢血、骨髓、脐带血等得到的细胞群或从这些材料中分离得到的血细胞系细胞群。 本发明优选使用 PBMC。 上述细胞群无论是从生物体采集的新鲜细胞群或冷冻保存过的 细胞群，均可用于本发明。
本发明的制造方法中对纤维连接蛋白片段的浓度没有特殊限制，但优选例如为 0.001 ～ 500μg/mL、特别是 0.01 ～ 500μg/mL。 纤维连接蛋白片段除了在培养基中溶解 而共存外，还可以在合适的固相例如培养皿、烧瓶、袋子等细胞培养用器材 ( 培养用容 器 ；包括开放体系和封闭体系的任一种 ) 或珠子、膜、载玻片等细胞培养用载体上固定 化后使用。 这些固相的材质只要是可以在细胞培养中使用的材料即可，没有特殊限制。 关于纤维连接蛋白的固定化量，根据将上述器材或载体供培养用时，按与将该成分在培
养基中溶解使用时所需的浓度相同的比例进行选择，只要能得到所需效果，没有特殊限 制。
作为纤维连接蛋白片段在固相上的固定化方法，没有特殊限制，例如可通过 使溶解于适当缓冲液中的片段与固相接触进行固定化。 另外，也可以用国际公开第 97/18318 号小册子以及国际公开第 00/09168 号小册子中记载的方法来实施纤维连接蛋白 片段的固定化。
本发明优选的方式中，在 CD3 配体的存在下进行纤维连接蛋白片段存在下的培 养。 作为 CD3 配体，只要是具有 CD3 结合活性的物质即可，没有特殊限制，可例举例如 抗 CD3 抗体，特别优选抗 CD3 单克隆抗体，例如 OKT3[J.Immunol.，第 124 卷，第 6 号， 2708 ～ 2713(1980)]。 CD3 配体在培养基中的浓度没有特殊限制，例如在使用抗 CD3 单 克隆抗体的情况下，优选例如 0.001 ～ 500μg/mL、特别是 0.01 ～ 100μg/mL。 CD3 抗 体也可以通过与纤维连接蛋白片段同样的操作在细胞培养用器材或细胞培养用载体上固 定化后使用。
若将纤维连接蛋白片段、 CD3 配体在固相上固定化，则培养结束后，只要将 细胞与固相分离即可容易地将上述成分与得到的细胞群分离，能防止上述成分混入细胞 群。 本发明的含有 CIK 细胞的细胞群的制造方法中使用的培养基，没有特殊限制， 可以使用淋巴细胞放大培养等中能使用的公知的培养基，例如可以适当地选择使用市售 培养基。 上述培养基除其原有的构成成分外，还可以含有细胞因子类、适当的蛋白质及 其他成分。 通常，本发明使用含有 IFN-γ、IL-2 的培养基。 IFN-γ 在培养基中的浓度 没有特殊限制，可以是 50 ～ 10000U/mL，更优选 100 ～ 5000U/mL。 IL-2 在培养基中 的浓度也没有特殊限制，可以是 10 ～ 5000U/mL，优选 50 ～ 2000U/mL。 此外，还可以 在培养基中添加 IL-1α、 IL-7、 IL-12 等细胞因子类。 只要能获得所需效果，该成分在 培养基中的浓度不受特殊限制。
在培养基中可以添加血清或血浆进行培养。 它们在培养基中的添加量不受特殊 限制，如大于 0 容量％至 20 容量％，且可以根据不同的培养阶段而改变血清或血浆的用 量。 例如，可以阶段性减少血清或血浆浓度来使用。 另外，作为血清或血浆的来源，可 以是自己 ( 意味着与所培养的细胞来源相同 ) 或非自己 ( 意味着与所培养的细胞的来源不 同 ) 中的任一种，从安全性的观点出发，优选自己来源的血清或血浆。 另外，也可以添 加如人血清白蛋白之类经分离纯化的血清成分。
本发明的含有 CIK 细胞的细胞群的制造除了使用纤维连接蛋白片段外，使用上 述各种成分及培养基来实施。 本发明中使用的培养开始时的细胞数没有特殊限制，例如 优选 1×104cell/mL ～ 1×108cells/mL、更优选 1×105cell/mL ～ 5×107cells/mL。 另外， 培养条件也没有特殊限制，可以使用通常的细胞培养中使用的条件。 例如，可在 37℃、 5％ CO2 等条件下培养。 还可以实施如下等操作 ：间隔适当的时间添加新鲜培养基来稀 释细胞培养液，或更换培养基，或更换细胞培养用器材等。
本发明的制造方法中可以使用例如培养皿、烧瓶、袋子、大型培养槽、生物反 应器等细胞培养用器材 ( 容器 )。 作为袋子，优选细胞培养用 CO2 气体透过性袋子。 在 需要大量细胞的情况下，可以使用大型培养槽。 培养可以在开放体系或封闭体系中的任
一体系中实施，但优选在封闭体系中实施培养。
本发明含有 CIK 细胞的细胞群的制造方法中，对培养期没有特殊限制，例如可 以实施总天数为 4 ～ 30 天、优选 6 ～ 25 天的培养。 在本发明的制造方法中，纤维连接 蛋白片段存在下的培养可以是培养期的整个期间，也可以是任意的一部分期间。 即，只 要在细胞培养工序的一部分中包含纤维连接蛋白片段存在下的培养工序的培养即属于本 发明。 特别优选整个培养期的至少初期阶段在纤维连接蛋白片段的存在下实施培养，更 优选在纤维连接蛋白片段的存在下开始培养。 最好是将本发明的有效成分存在下的培养 在培养开始后至少实施 1 天以上、更优选 2 天以上。 当培养时使用 CD3 配体时，其使用 时期没有特殊限制，例如在纤维连接蛋白片段使用时使 CD3 配体共存。
本发明的一个优选方式中，仅在整个培养期的初期阶段使用纤维连接蛋白片段 和 CD3 配体。 在本发明中没有特别限定，例如，从培养开始时到第 7 天为止，优选从培 养开始时到第 5 天为止，在纤维连接蛋白片段和 CD3 配体的共同存在下实施培养，之后 在这两种成分均不存在的条件下继续培养，制造含有 CIK 细胞的细胞群。
此外，本发明的制造方法还可以包含如下工序，即从用上述方法得到的细胞群 中进一步分离出 CD3 阳性、 CD56 阳性的细胞群。 关于分离，例如可以用使用细胞分选 仪、磁珠、亲和柱等的公知手段来进行。 如此分离得到的细胞群富含具有高细胞毒活性 的细胞，可期待其发挥更好的治疗效果。 (3) 含有 CIK 细胞的细胞群
本发明提供用上述本发明的含有 CIK 细胞的细胞群的制造方法得到的含有 CIK 细胞的细胞群。 本发明的含有 CIK 细胞的细胞群与用以往方法制得的含有 CIK 细胞的细 胞群相比，由于高比例地含有 CD3 阳性 CD56 阳性细胞，因此在生物体内发挥更强的细 胞毒活性，达到很好的治疗效果。 此外，上述细胞群还具有如下优点，即具有抑制细胞 性免疫作用的调节性 T 细胞 (regulatory T cells ；Treg 细胞 ) 的含量低，因此非常利于在治 疗上应用。
本发明还提供以含有 CIK 细胞的细胞群为有效成分的药品 ( 治疗剂或预防剂 )。 含有该细胞群的上述治疗剂适用于免疫疗法。 免疫疗法中，例如通过注射或点滴等的 静脉、动脉、皮下、腹腔内等给药方法向患者给予适于患者治疗的含有 CIK 细胞的细胞 群。 本发明的治疗剂对于例如癌症、白血病、恶性肿瘤、肝炎或感染性疾病 ( 例如流 感、结核、 AIDS、 MRSA 感染症、 VRE 感染症、深层真菌症 ) 等对 CIK 细胞具有感受 性的疾病的治疗非常有用，但本发明并不限于此。 另外，该治疗剂也可以在以预防骨髓 移植或放射线照射后的感染症、缓减复发白血病症状为目的的供者淋巴细胞输注等中应 用。
本发明的治疗剂、预防剂可以根据制药领域的公知方法来制备，例如以用本发 明的方法制得的细胞群为有效成分，与公知的适于非口服给药的有机或无机的载体、赋 形剂、稳定剂等混合，制成点滴剂、注射剂。 另外，治疗剂中本发明的含有 CIK 细胞 的细胞群的含量、治疗剂的给药量、与该治疗剂相关的各种条件可根据公知的免疫疗 法来适当地决定。 例如，药品中本发明的含有 CIK 细胞的细胞群的含量，没有特殊限 制，例如优选 1×103 ～ 1×1011cells/mL，进一步优选 1×104 ～ 1×1010cells/mL，更优选 1×105 ～ 2×109cells/mL。 另外，作为本发明药品的给药量，没有特殊限制，例如成人
每日优选为 1×106 ～ 1×1012cells/ 天，进一步优选为 1×107 ～ 5×1011cells/ 天，更优选 为 1×108 ～ 2×1011cells/ 天。 此外，采用该治疗剂的免疫疗法可以与公知的通过给予药 物的药物治疗或放射治疗、外科手术治疗并用。
本发明的含有 CIK 细胞的细胞群的制造方法还可以进一步包括在该细胞群中导 入外源基因的工序。 另外， “外源基因” 指向基因导入对象的 CIK 细胞中人为导入的基 因，也包括来自与作为基因导入对象的细胞同种细胞的基因。
外源基因的导入手段没有特殊限制，可以从公知的基因导入方法中选择使用适 当的方法。 基因导入工序可以在本发明制造方法中的任意时刻实施。 从作业效率的观点 出发，例如优选与上述细胞群的制造同时或中途或在该工序后实施。 可以用病毒载体来 实施基因导入，也可以不使用病毒载体。 其方法的具体内容已在众多文献中公开。
上述病毒载体没有特殊限制，通常使用基因导入方法中使用的公知的病毒载 体，例如逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺伴随病毒载体、猿猴病毒载 体、痘苗病毒载体或仙台病毒载体等。 特别优选能将外源基因稳定地整合到被导入的细 胞的染色体 DNA 中的逆转录病毒载体、慢病毒载体。 作为上述病毒载体，优选在感染的 细胞中无法自我复制的复制能力欠缺的载体。 另外，在基因导入时，也可以使用乐透露 奈库秦 ( 注册商标，宝生物工程株式会社制 ) 等能提高基因导入效率的物质。
作为不使用病毒载体的基因导入方法，可以采用使用核糖体、配体 - 聚赖氨酸 等载体的方法或磷酸钙法、电穿孔法、基因枪法等。 此时，整合在质粒 DNA、直链状 DNA 或 RNA 中的外源基因被导入。
导入的外源基因没有特殊限制，可以使用希望导入上述细胞的任意基因 ( 例 如编码酶、细胞因子类、受体类等蛋白质的基因以及编码反义核酸或 siRNA( 小干扰 RNA)、核酶的基因 )。 这些外源基因例如以在适宜启动子的控制下表达的方式插入载体 或质粒等中来使用。 另外，载体中也可以存在增强序列或终止序列之类的控制序列。
根据本法明的方法，可以通过导入与对癌症等患者的治疗中所用的药物的耐性 相关的酶的编码基因 ( 例如多药抗药性基因 ) 来赋予含有 CIK 细胞的细胞群以抗药性。 若使用这样的细胞群，则可以将免疫疗法与药物疗法组合，因而可以得到更好的治疗效 果。 另一方面，与上述方式相反，通过导入赋予针对特定药物感受性的基因 ( 例如胸苷 激酶基因 ) 也可以赋予含有 CIK 细胞的细胞群以针对该药物的感受性。 此时，通过给予 该药物即可除去移植到生物体后的细胞。
本发明还提供包括向对象给予有效量的通过上述方法得到的含有 CIK 细胞的细 胞群的疾病治疗方法或预防方法。 本说明书中的对象表示例如为身患上述疾病的患者。
本说明书中的有效量指给予上述含有 CIK 细胞的细胞群后能达到治疗或预防效 果的该细胞群的量。 具体的有效量因给药形态、给药方法、使用目的以及对象的年龄、 体重、症状等来适当设定，并非定值。 给药方法没有限制，例如可以与上述药品同样， 通过点滴或注射等来给药。
另外，本发明还提供用于药品制造的含有 CIK 细胞的细胞群的使用。 该药品 的制造方法与上述药品相同。 此外，对给予该药品的疾病没有特殊限制，与上述药品相 同。
实施例下面，结合实施例对本发明做更具体的描述，但本发明不限于此。
实施例 1 使用了纤维连接蛋白片段 CH-296 的 CIK 细胞的放大培养
(1)PBMC 的分离
对知情同意的 5 位患者 ( 肾癌 2 名、肺癌、肝癌和甲状腺癌各 1 名 ) 进行成分 采血后，将含有 PBMC 的细胞组分在 Ficoll 上重叠离心，回收中间层的末梢血单核细胞 (PBMC)。
(2) 抗人 CD3 抗体和 CH-296 的固定化
在 T225 烧瓶中添加含有最终浓度为 5μg/mL 的抗人 CD3 抗体和最终浓度为 15μg/mL 的 CH-296( 乐透露奈库秦 ( 注册商标 )，宝生物工程株式会社制 ) 的磷酸缓冲 生理盐水 (PBS)40mL 或仅含有最终浓度为 5μg/mL 的抗人 CD3 抗体的 PBS 40mL，然 后在 4℃培养过夜。 临使用前从该培养器材吸引除去含有抗体、CH-296 的 PBS，然后用 PBS 清洗 2 次，供各试验用。
(3)CIK 细胞的放大培养
将实施例 1-(2) 中分离得到的 PBMC 9×108cells 悬浮在含有 0.2 ％人血清白蛋 白、1000U/mL IFN-γ、300U/mL IL-2 的 60ml 的 GT-T503 培养基 ( 宝生物工程株式会社 制、以下记作 “完全 GT-T503 培养基” ) 中，添加到实施例 1-(2) 中制作的 4 个抗 CD3 抗体以及 CH-296 固定化 T225 烧瓶或 4 个抗 CD3 抗体固定化 T225 烧瓶中，在 5％ CO2 中在 37℃下开始培养 ( 培养第 0 天 )。
第 1 天 ( 培养开始的次日 )，向各烧瓶添加 150mL 的完全 GT-T503 培养基，继 续培养。
第 4 天，将各烧瓶内的细胞悬浮在培养基中全部收集，转移到未固定化透气性 培养袋 CultiLife Eva( 宝生物工程株式会社制 )。 此时，添加完全 GT-T503 培养基使每只 袋子为 700mL，在 5％ CO2 中在 37℃下培养。
第 7 天和第 9 天，向各袋子中添加完全 GT-T503 培养基 400mL 进行继代培养， 继续培养至第 14 天。 最终每只袋子的培养液为 1500mL。
计算培养最后一天的活细胞数，与培养开始时的细胞数进行比较，算出放大培 养率。 结果如表 1 所示。 另外，用抗 CD3 抗体和 CH-296 刺激而增加的 CIK 细胞记为 R-CIKs，仅用抗 CD3 抗体刺激而增加的 CIK 细胞记为 C-CIKs。
表1
放大培养率 ( 倍 ) C-CIKs R-CIKs
9.2 35.7由表 1 可知，通过在培养初期使纤维连接蛋白片段共存，可以显著提高 CIK 细胞 增加率。
(4)CIK 细胞表型分析
用荧光标记了的抗体将细胞染色后，提供给流式细胞仪，对实施例 1-(3) 中制备的 C-CIKs 和 R-CIKs 的表型进行分析。 CD3 阳性细胞、 CD4 阳性细胞、 CD8 阳性细 胞分别用抗 CD3 抗体、抗 CD4 抗体、抗 CD8 抗体进行染色。 CD3 阳性 CD56 阳性细胞 用抗 CD3 抗体和抗 CD56 抗体进行染色，作为双阳性细胞进行评价。 Treg 细胞用抗 CD4 抗体、抗 CD25 抗体以及抗 CD127 抗体进行染色，作为 CD4 阳性 CD25 阳性 CD127 阴性 细胞进行评价。
其结果如图 1 所示。 图中，横坐标表示检测到的表面抗原，纵坐标表示表面抗 原的阳性率。
由图 1 可知，刺激时使用纤维连接蛋白片段而制备的细胞群中，Treg 细胞的比率 显著下降。 众所周知 Treg 细胞具有使抗肿瘤免疫活性下降的作用，因此将要移入的 CIK 细胞中的 Treg 细胞比率低这就意味着能得到好的抗肿瘤效果。
实施例 2 CIK 细胞的抗肿瘤效果
(1) 向癌症患者移入 CIK 细胞
向各癌症患者，以 4 天间移入 2 次实施例 1 制备的来自自己的 R-CIKs 作为一轮 给药，平均给予 3.9×1010 个。 对所有患者至少进行 2 轮给药，对其中的一名患者进行 3 轮给药。
(2) 抗肿瘤效果 在所有 R-CIKs 给药的癌症患者中均未发现伴随细胞给药而产生的严重的不良迹象。 通过 R-CIKs 给药，在所有患者中均发现临床症状改善、生理功能恢复。 另外， 在甲状腺癌患者中发现作为肿瘤标记的降钙素显著减少。 此外，通过 PET-CT 测定肺癌 患者肿瘤大小，结果发现肿瘤缩小约 50％。
综上所述可知， R-CIKs 是非常安全的抗肿瘤效果好的细胞制剂。
产业上利用的可能性
PBMC 经放大培养而分化成多个细胞群，分化得到的细胞群中含有控制或抑制 免疫的细胞群。 根据本发明，通过将被称为现有过继免疫疗法中优选细胞群的 CIK 细胞 进行放大培养，能提供大量非必要细胞群的含量少的高品质细胞群。 通过本发明得到的 细胞群是使用该细胞群的过继免疫疗法中极为有用的具有显著效果的细胞群。
序列表自由内容
SEQ ID NO ：1 ；纤维连接蛋白的局部区域 CS-1。
SEQ ID NO ：2 ；纤维连接蛋白的局部区域 III-10。
SEQ ID NO ：3 ；III-10 中的纤维连接蛋白的局部区域。
SEQ ID NO ：4 ；纤维连接蛋白片段 C-274。
SEQ ID NO ：5 ；纤维连接蛋白片段 H-271。
SEQ ID NO ：6 ；纤维连接蛋白片段 H-296。
SEQ ID NO ：7 ；纤维连接蛋白片段 CH-271。
SEQ ID NO ：8 ；纤维连接蛋白片段 CH-296。
SEQ ID NO ：9 ；纤维连接蛋白片段 C-CS1。
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