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提高免疫细胞激活阈值的物质
    本发明涉及活性成分 (active principle) 在制备预期用于提高皮肤免疫细胞和 / 或 黏膜免疫细胞的激活阈值的化妆品或药物组合物中的用途。
     本发明尤其涉及敏感性皮肤或致使暂时敏感、反应或反应过度的皮肤的护理和 / 或治疗。
     背景技术 皮肤刺激和变态反应 ( 迟发型接触性超敏反应或接触性变态反应或接触性湿疹 ) 已成为工业化国家中的健康问题。 其原因与见于例如金属盐、化妆品和卫生产品、香 料、药物、防腐剂、消毒剂、衣物、植物等中的接触性刺激素和变应原的数量一样多。 在此相同背景中，声称其具有敏感或反应过度的皮肤的人数近年中已大幅提高。 该数目 已从 20 世纪 80 年代的人口的 30％上升至今天的约 60％。
     皮肤敏感性最重要的原因之一涉及尤其是遗传性 / 获得性角质层胞间脂质缺乏 引起的屏障作用的衰减。 提高的神经感觉活性也是引起皮肤敏感性提高的因素，其表征
     为表皮神经末梢改变、神经递质累积或中枢神经系统信息传递破坏。 皮肤敏感性的第三 个其他原因是提高的免疫敏感性，其尤其包含表皮朗格汉斯细胞 (LC) 密度的可测量的提 高，且其在最极端情况下导致病状，如接触性荨麻疹、接触刺激性或变应性皮炎、或遗 传过敏性皮炎。
     敏感性皮肤类型的多态性表现为主观感觉 ( 如蛰刺、灼伤感觉、瘙痒感觉、绷 紧 ) 和客观皮肤反应 ( 如发红、可见鳞片和皮肤增厚 )。 这些不雅和 / 或不适的现象 ( 尤 其是刺激 ) 是敏感性皮肤的特征。 在最极端的情况下，还描述了刺激或甚至变态反应。
     在化妆品和药物二者中都已知尤其是通过预防和 / 或治疗炎症或刺激 素反应的 实施来降低所有皮肤类型的敏感性。 具体而言，在据称其皮肤是 “敏感的” 的个体情况 下，甚至轻度暴露于攻击性物质 (agent) 或刺激素条件都可以表现为不雅和 / 或不适的皮 肤和 / 或黏膜现象，该现象可以导致本应适当避免的炎症或实质的刺激反应。 当前对敏 感性皮肤的治疗具有使皮肤更具耐受性的目的，即提高敏感性皮肤类型的反应性阈值的 目的，该敏感性皮肤类型表征为较低的对刺激素反应的刺激性阈值。 这些治疗基于使皮 肤 “镇静” 的产品的用途。
     通常将其中成分降至最低，并从其排除基本上不适合用于敏感性或变应性表皮 的物质的专用的 “敏感性皮肤” 化妆品制剂。 叙述可以由既不包含香料，也不包含醇、 染料、色素、防腐剂、活性剂，且具有中性 pH 的保湿产品的用途构成。
     基于富含痕量元素和矿物盐的泉水的润肤或镇静产品具有与生理盐溶液相似的 性质，如等渗性。 可以用镇静剂和如锦葵、燕麦和矢车菊的抗炎植物提取物强化这些产 品。
     具有用天然分子加强皮肤屏障的能力的防护产品，该天然分子将重建表皮的脂 膜 (hydrolipid film)，以使所述表皮恢复其所有防护功能。 通常将皮肤脂质的前体神经酰 胺用于这类应用。 还针对护理反应过度的皮肤描述了基于具有成膜效应的糖类的产品。通过作用于皮肤的敏感性神经纤维受体而具有神经化妆品活性 (neurocosmetic activity) 的减压 (destressing) 产品，如 β- 内啡肽样产品。 一般通过释放如 α-MSH( 促 黑激素 ) 的抗炎神经介质或通过抑制如 TNFα( 肿瘤坏死因子 )、IL-1β( 白细胞介素 1β) 或 PGE2( 前列腺素 E2) 的内源抗炎因子将这些产品偶联至抗炎作用。
     基本上涉及所有皮肤细胞的皮肤免疫学成分主要由以下构成 ：
     - 皮肤树突细胞 (DC) ：朗格汉斯细胞和真皮 DC(dermal DC， DDC)，其因作为 抗原呈递细胞 (AgPC) 的功能而是皮肤免疫应答的起因 ；
     - 角质形成细胞 ：其因其所构成的基本的皮肤微环境 ( 汗液、皮脂、抗微生物 肽、生长因子、细胞因子、趋化因子等 ) 而是皮肤 CD 的主要细胞 配偶体。
     在抗原 ( 例如变应原、病原体和 / 或异物 ) 刺激过程中，皮肤 DC 具有以下功 能：
     - 获得或捕获抗原 ；
     - 在皮肤外和在淋巴结的方向迁移 ；
     - 将抗原信息呈递至淋巴细胞以起始特异的适应性免疫。
     皮肤 DC 还必须整合由邻近的角质形成细胞递送的所有内源信号。 具体而言， 在任意刺激下且取决于其性质，角质形成细胞产生非常广泛的一组将影响 LC 和 DDC 的 免疫学功能的可溶性介质 ( 例如细胞因子等 )。
     捕获抗原后，皮肤 DC 随后经历表型和功能改变 ：
     - 抗原的捕获诱导 LC 和 DDC 的激活，然后其获得 “激活的” 表型。 此激活表 型表现为直接涉及 DC 对 T 淋巴细胞的激活阈值的共刺激分子 CD80 和 CD86 的强表达。 II 类 MHC( 主要组织相容性复合物 ) 分子，尤其是 HLA-DR 的膜表达也因 DC 表面抗原 肽的呈递而显著提高。
     -LC 和 DDC 的激活还与 DC 在皮肤外和在淋巴结的方向迁移所必需的 CCR7 受 体表达的获得相关。
     - 在其迁移过程中， LC 和 DDC 经历成熟过程和获得 “成熟的” DC 表型。 淋 巴细胞的致敏和免疫的建立所必需的此成熟状态表现为 CD83 和 DC-LAMP 标记的表达和 分泌细胞因子的能力。
     发明目的
     本发明的主要目的是提供能够提高个体的免疫细胞，尤其是皮肤和 / 或黏膜免 疫细胞的激活阈值的活性成分。 这导致皮肤和 / 或黏膜敏感性和 / 或皮肤和 / 或黏膜反 应性的降低，和 / 或皮肤和 / 或黏膜耐受性的提高。 因此，这在化妆品或药物，尤其是 皮肤病学治疗和 / 或护理的背景中具有不可否认的益处。
     本发明的目的还提供用于筛选具有上文所述活性的物质的筛选模型，其考虑皮 肤 DC 的两个群体 (LC 和 DDC) 的应答。
     发明详述
     本 发 明 涉 及 选 自 Phoradendron piperoides 植 物 提 取 物、 Cestrumlatifolium 植 物 提取物、千日菊 (Spilanthes oleracea) 植物提取物、 Maprounea guyanensis 植物提取物、 一叶嵃碱 (securinine)、单叶芸香定丙酮化合物 (foliosidine acetonide)、8- 氧代假棕榈碱 (8-oxopseudopalmatine) 或其任意组合的至少一种活性成分作为用于提高个体免疫细胞的激活阈值的活性剂在制备化妆品组合物中，或在制备优选预期用于提高个体免疫应答的 激活阈值的药物组合物，尤其是皮肤病学组合物中的用途。 这种活性成分有利地使得可 能降低个体的至少部分皮肤和 / 或黏膜的敏感性和 / 或反应性。
     本发明人通过术语 “降低” 指至少部分地降低和 / 或限制个体的至少部分皮肤 和 / 或黏膜的反应性。
     有利地，活性成分降低和 / 或预防皮肤和 / 或黏膜免疫反应。
     有利地，活性成分降低和 / 或抑制至少一类免疫细胞尤其是树突细胞的活性。
     有利地，活性成分降低至少表皮朗格汉斯细胞 (LC) 和 / 或真皮树突细胞 (DDC) 的活性。
     有利地，活性成分与镇静剂组合。
     本发明的活性成分具有通过提高免疫细胞尤其是 DC 的激活阈值来降低免疫应 答的能力。 具体而言，本发明的活性成分有利地免疫抑制基本上不同于皮肤炎症途径的 皮肤免疫能力。 当前的抗炎产品基本上降低由皮肤角质形成细胞分泌的可溶性促炎因子 ( 细胞因子、白细胞介素等 ) 的合成能力。 本发明的物质靶向完全不同的调节途径，其是 皮肤免疫应答的途径。 这些作用方式可以是互补的。 个体免疫细胞的激活阈值，尤其是 DC 的激活阈值由激活标记，尤其是 CD86 激 活标记的表达定义。 在正常皮肤中，未成熟和未激活的 DC 具有我们已定义为这些细胞 的激活阈值的 CD86 的基础表达水平。 因此，未 成熟和未激活的 DC 上激活标记表达的 降低，尤其是 CD86 表达的降低表现为免疫细胞激活阈值的提高。
     与单独作用于皮肤免疫应答的间接途径，尤其是作用于皮肤环境，尤其是角质 形成细胞的可溶性免疫介质 ( 细胞因子 ) 的分泌的标准抗炎产品相反，本发明具有靶向皮 肤 DC 的优势，即靶向免疫应答的优势。
     有利地，本发明的活性成分在皮肤中降低至少一类选自下列的标记的表达 ：(i) 由未成熟的树突细胞按基础水平表达的 CD86 ；(ii) 由激活的树突细胞表达的 CD40、 CD54、 CD80、 HLA DR、 CCR7 或 CD86 ；和 (iii) 由 激 活 和 成 熟 的 树 突 细 胞 表 达 的 CD40、 CD54、 CD80、 HLA DR、 CCR7、 CD86、 CD83 或 DC LAMP，尤其是以降低敏 感性皮肤的反应性。
     本发明具有在个体需要时 ( 例如在细菌攻击皮肤的过程中、或一般在病原体 剂、高攻击性化学剂和 / 或异物存在的情况下 ) 提高触发免疫应答的阈值，而同时对随后 的免疫应答具有最小的影响的优势。 另一方面，降低皮肤中可溶性促炎介质合成的抗炎 产品不考虑随后的皮肤 DC 的应答。 因此，在使用抗炎产品的标准治疗中，免疫应答被 阻断或至少受损。 这明显具有提供经历免疫应答激活剂攻击的个体皮肤弱保护的缺点。
     因此，有利地，本发明的活性成分基本上不抑制免疫应答，尤其是不抑制树突 细胞的免疫功能性。
     此外，当局部应用后活性成分不再与皮肤接触时，本发明的活性成分允许基础 免疫活性的部分恢复，尤其是树突细胞基础免疫活性的部分恢复。
     本发明的活性成分适合用于任意皮肤类型，且尤其适合用于具有敏感、反应和 / 或反应过度的皮肤，和 / 或由如维生素 A 酸和 / 或攻击性物质和 / 或攻击性条件治疗的攻 击性皮肤病学治疗致使暂时敏感的皮肤的个体的化妆品护理和 / 或化妆品治疗。
     一般，敏感性皮肤定义为不再耐受或几乎不耐受攻击性物质，尤其是环境因素 如污染物、气候因素 ( 风、冷、热 )、暴露于 UV、情绪因素尤其是压力和 / 或化学物质 ( 重金属、去垢剂、包含于化妆品治疗的化合物如香料、防腐剂、醇、 pH 或 AHA、或如 维生素 A 酸的皮肤病学治疗 ) 和 / 或 攻击性条件尤其是出汗和机械攻击如拔毛、剃须和 摩擦。 敏感性皮肤或致使暂时敏感的皮肤不是具有病理特征的皮肤。 然而，它可以通过 不雅和 / 或不适的皮肤和 / 或黏膜现象如蛰刺、灼伤感觉、瘙痒感觉、绷紧、发红、可见 鳞片或皮肤增厚与攻击性物质反应。 因此， “敏感性皮肤” 的特征可以由个体自身用主 观皮肤感觉或由皮肤病学家用客观皮肤反应来估计。
     因此，本发明允许控制皮肤 DC 的激活和 / 或成熟水平以预防和 / 或降低敏感性 皮肤或致使暂时敏感、反应或反应过度的皮肤的提高的和 / 或过度的应答。
     根据一个实施变通方案，本发明涵盖活性成分在预防和 / 或治疗不雅和 / 或不适 的皮肤和 / 或黏膜现象中的化妆品用途。 因此，本发明的活性成分尤其适合用于化妆品 护理和 / 或化妆品治疗。 它们尤其是允许具有镇静剂和 / 或抗刺激素和 / 或保护效应的化 妆品组合物的制备，尤其是针对攻击性物质和 / 或攻击性条件的化妆品组合物的制备。
     因此，取决于相关个体的皮肤和 / 或黏膜的健康状态 ( 化妆品护理或治疗 ) 或病 理状态 ( 皮肤病学或药学护理或治疗 )，本发明涉及两类不同的护理和 / 或治疗。 根据另一个实施变通方案，本发明涵盖用于药物组合物尤其是皮肤病学组合物 的制备的活性成分，该组合物用于预防和 / 或治疗由免疫应答的激活引起的病状。
     在适合用于局部应用的化妆品载体中包含选自浓度在 0.001wt ％和 10wt ％之间 的 Phoradendron piperoides 植物提取物、 Cestrum latifolium 植物提取物、千日菊植物提取 物、浓度为 1×10-7％至 1％的一叶嵃碱、单叶芸香定丙酮化合物、8- 氧代假棕榈碱和其 任意组合的化妆品组合物也是本发明的主题。
     本发明还涉及预期用于提高免疫应答尤其是树突细胞的激活阈值，尤其是用于 预防和 / 或治疗皮肤和 / 或黏膜的反应性的药物和 / 或皮肤病学组合物，该组合物在适 合用于局部应用的药物和 / 或皮肤病学载体中包含选自 Phoradendron piperoides 植物提取 物、 Cestrum latifolium 植物提取物、千 日菊植物提取物、一叶嵃碱、单叶芸香定丙酮化 合物、8- 氧代假棕榈碱和其任意组合的活性成分。
     本发明还涉及至少一种活性成分在制备预期用于预防和 / 或治疗刺激或皮肤和 / 或黏膜变态反应尤其是接触性反应、迟发型接触性超敏反应、接触性湿疹、荨麻疹尤其 是接触性荨麻疹、接触刺激性或变应性皮炎和 / 或遗传过敏性皮炎的药物组合物，尤其 是皮肤病学组合物中的用途。
     有利地，本发明的至少一种活性成分用于还包含抗炎剂的药物组合物的制备。
     根据一个优选模式，病状是刺激或皮肤和 / 或黏膜变态反应，尤其是接触性反 应、迟发型接触性超敏反应、接触性湿疹，荨麻疹尤其是接触性荨麻疹、刺激性或变应 性接触性皮炎和 / 或遗传过敏性皮炎。 荨麻疹尤其是引起皮肤和 / 或黏膜现象的接触性 荨麻疹和 / 或饮食性荨麻疹。
     优选地，药物和 / 或皮肤病学组合物预期用于预防和 / 或治疗刺激或皮肤和 / 或 黏膜变态反应，尤其是接触性反应、迟发型接触性超敏反应、接触性湿疹、荨麻疹尤其 是接触性荨麻疹、刺激性或变应性接触性皮炎和 / 或遗传过敏性皮炎。
     皮肤和 / 或黏膜免疫应答的激活表征为至少一类免疫细胞尤其是树突细胞 (DC) 的激活，例如表皮朗格汉斯细胞 (LC) 和 / 或真皮树突细胞 (DDC) 的激活。
     皮 肤 DC 表 征 为 其 特 异 性 标 记， LC 和 DDC 分 别 特 异 地 表 达 langerine 和 DC-SIGN。
     未成熟的树突细胞由用激活和 / 或成熟物质尤其是 TNFα 和 / 或 LPS( 脂多糖 ) 型的激活和 / 或成熟物质激活前的基础表型状态定义。
     “激活的” 树突细胞由与用激活和 / 或成熟物质尤其是 TNFα 和 / 或 LPS 型的 激活和 / 或成熟物质诱导的状态相当的激活表型状态定义。
     激活和 / 或成熟物质 ( 即提高至少一种 DC 标记的表达的物质 ) 是 DC 的危险信 号，其触发免疫应答。 此物质是非限制性的。 这些物质尤其是使用或应用来提高至少一 种 DC 标记的表达的化学或生物物质，例如 LPS 或 TNFα、刺激皮肤的参数如气流、污染 物、低于 15℃或高于 40℃的温度。
     本发明尤其涉及哺乳动物，且尤其涉及人。
     本发明的活性成分是植物提取物或表征的分子。 该提取物有利地产生自选自 Phoradendron piperoides、 Cestrum latifolium、千日菊、 Maprouneaguyanensis 及其任意混 合物的植物。 优选的表征的分子选自一叶嵃碱、单叶芸香定丙酮化合物和 8- 氧代假棕榈 碱。 任意比例的两种或多种上述活性成分的混合物也被本发明涵盖。 根据一个尤其有利 的模式，活性成分是 Cestrum latifolium 植物提取物和 / 或一叶嵃碱。 按照本领域中的标准方法获得用于本发明的植物提取物。
     取决于植物，通过例如离析提取选自根、根茎、茎、树皮、花、果实、芽、种 子和叶的至少部分植物是有利的，该部分植物以 1％和 10％ (w/w) 之间在溶剂或溶剂混 合物中，优选极性质子溶剂，有利地在水、醇、乙二醇、多元醇、100/0 至 0/100(v/v) 的水 / 醇、水 / 乙二醇或水 / 多元醇混合物 ( 如水与乙醇、丙三醇、丁二醇或其他多元醇 类如木糖醇等混合 ) 中。 然后优选离心和 / 或过滤和 / 或蒸馏所获得的提取物以回收活 性可溶性级分 ( 粗提取物 )。
     优选将植物提取物溶解于溶剂中，如水、醇、多元醇、乙二醇或其混合物。 根 据本发明，优选以相对于组合物重量在 0.001wt ％和 10wt ％之间、有利地在 0.01wt ％和 5wt％之间和更尤其以 1wt％的浓度使用植物提取物。
     可以通过蒸发去除溶剂来浓缩活性物质，例如通过冷冻干燥或通过喷雾。
     通过溶解于极性溶剂例如水、乙醇、乙二醇或 DMSO 中来有利地制备表征的分 子 ( 活性成分 )。
     根据本发明，优选以相对于组合物总重量在 1×10-7wt％和 1wt％之间、有利地 在 1×10-5wt％和 1×10-1wt％之间和尤其是 1×10-1wt％的浓度使用表征的分子。
     优选地，组合物是优选局部地应用的化妆品或药物组合物，尤其是皮肤病学组 合物。
     例如，在最终化妆品制剂中活性成分 0.5％至 10％的比率和每平方厘米皮肤 1mg 完成的化妆品产品的应用比率下，每平方厘米皮肤应用的活性成分的量有利地在 10-13g 和 10-12g 表征的分子之间和在 10-5g 和 10-4g 植物来源的活性成分 ( 溶剂中 0.001wt％和 10wt％ 之间的植物提取物 ) 之间。
     优选以化妆品或药物组合物且优选皮肤病学组合物的形式使用本发明的化合物。 组合物可以包含可选地与其他目的化合物组合的任意适合的溶剂和 / 或任意适 合的载体和 / 或任意适合的赋形剂。
     结果，对于这些化合物，赋形剂包含例如至少一种选自以下的化合物 ：防 腐剂、润滑剂、乳化剂、表面活性剂、湿润剂、增稠剂、调节剂、控油剂 (mattifying agent)、 稳 定 剂、 抗 氧 化 剂、 组 织 形 成 剂 (texturing agent)、 光 泽 剂、 成 膜 剂、 增 溶 剂、色素、染料、香料和遮光剂。 这些赋形剂优选选自氨基酸及其衍生物、聚甘油、 酯类、纤维素聚合物和衍生物、羊毛脂衍生物、磷脂类、乳铁蛋白、乳过氧化物酶、 基于蔗糖的稳定剂、维生素 E 及其衍生物、天然和合成蜡、植物油、甘油三酯、不皂 化材料、植物甾醇、植物酯、聚硅氧烷及其衍生物、蛋白质水解物、霍霍巴油 (jojoba oil) 及其衍生物、脂 / 水溶性酯、甜菜碱、氧化胺、植物提取物、蔗糖酯、二氧化钛、 甘氨酸和对羟基苯甲酸类，更优选选自丁二醇、硬脂醇聚醚 -2(steareth-2)、硬脂醇聚 醚 -21(steareth-21)、乙二醇 -15 硬脂醚、鲸蜡硬脂醇 (cetearyl alcohol)、苯氧乙醇、对羟 基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、丁二醇、 天然生育酚、甘油、二羟十六烷基磷酸钠 (dihydroxycetyl sodium phosphate)、异丙基羟 十六醚 (isopropyl hydroxycetyl ether)、硬脂酸乙二醇酯、三异壬精 (triisononanoin)、椰 油酸辛酯 (octyl cocoate)、聚丙烯酰胺、异链烷烃、聚乙二醇单十二醚 -7(laureth-7)、卡 波姆 (carbomer)、丙二醇、丙三醇、红没药醇、二甲基硅氧烷、氢氧化钠、 PEG-30 二聚 羟基硬脂酸酯、癸酸 / 辛酸甘油三酯、鲸蜡硬脂醇辛酸酯 (cetearyl octanoate)、己二酸二 丁酯、 葡萄籽油、霍霍巴油、硫酸镁、 EDTA、环甲基硅氧烷、黄原胶、柠檬酸、十二 烷基硫酸钠、石蜡和矿物油、异硬脂醇异硬脂酸酯、丙二醇二壬酸酯、丙二醇异硬脂酸 酯、 PEG-8、蜂蜡、氢化棕榈仁油甘油酯、氢化棕榈油甘油酯、羊毛脂油、芝麻油、乳 酸十六酯、羊毛脂醇、蓖麻油、二氧化钛、乳糖、蔗糖、低密度聚乙烯和等渗盐溶液。
     有利地，以选自以下的形式配制上述组合物 ：水性或油性溶液、水性凝胶或霜 剂或油性凝胶，尤其是在瓶或管中，尤其是沐浴凝胶或洗发剂 ；乳 ；乳状液、微乳或纳 乳 (nanoemulsion)，尤其是基于水包油或油包水或多重或聚硅氧烷 ；洗剂，尤其是在玻 璃瓶、塑料瓶或剂量计量瓶中或作为气溶胶 ；安瓿剂 ；液体皂 ；皮肤病学条 ；软膏剂 ； 摩丝 ；无水产品，其优选是液体、糊剂或固体，例如棒的形式，尤其是唇膏或片剂的形 式 ；凝胶胶囊 ；糖浆 ；颗粒体 ；粉末。
     本文所用的术语 “局部应用” 指将本发明的组合物应用于皮肤和 / 或黏膜表 面，尤其是通过直接应用或通过蒸发应用于皮肤和 / 或黏膜表面。
     本发明还涵盖口服施用，尤其是保健品应用。
     本文所用的术语 “适合的化妆品或皮肤病学载体” 指该组合物或其成分适合用 于与人皮肤接触使用而不具有任意过度的毒性、不相容性、不稳定性、变应性应答或其 等同物。
     本领域技术人员已知许多用于改善皮肤的健康和 / 或物理状态的化妆品活性成 分。 本领域技术人员知道如何配制化妆品和 / 或皮肤病学组合物以获得最佳效应。 此 外，当将它们彼此组合时，本发明中所描述的化合物可以具有协同效应。 这些组合也包
     含于本发明。 The CTFA CosmeticIngredient Handbook，第二版 (1992) 描述了尤其适合用 于局部使用的通常用于化妆品和药物工业的多种化妆品和药物成分。 这些类型的活性成 分的实例包含但不限于以下化合物 ：研磨剂、吸收剂、用于美容目的的化合物如香料、 色素、染料、精油、收敛剂等 ( 例如丁香油、薄荷醇、樟脑、桉树油、丁子香酚、乳酸 薄荷酯、hamelis 馏出物 )、防痤疮剂、防絮凝剂、防沫剂、抗微生物剂 ( 例如丁基氨基甲 酸碘丙酯 )、抗氧化剂、粘合剂、生 物添加剂、缓冲剂、溶胀剂、螯合剂、添加剂、杀 虫剂、变性剂、增稠剂、和维生素及其衍生物或等同物、成膜材料、聚合物、遮光剂、 pH 调节剂、还原剂、消色剂或浅色剂 (lighting agent)( 例如氢醌、曲酸、抗坏血酸、抗坏 血酸磷酸酯镁或抗坏血酸葡糖胺 ) 和调节剂 ( 例如湿润剂 )。
     具体而言，为了尽可能充分地改善皮肤的敏感性状态，根据本发明将本发明的 活性成分与选自已知其特性的表征的分子和植物提取物的一种或多种其他活性剂组合尤 其有利 ：
     - 神经化妆品，
     - 外用止痛药，
     - 皮肤镇静剂，尤其是 PLA2 抑制剂、细菌来源的外泌多糖，尤其是化妆品镇 静剂如描述于专利 EP 0987010 中的欧洲七叶树 (Aesculushippocastanum) 提取物 (CAS 8053392)、交替单孢菌属 (Alteromonas) 发酵提取物、描述于专利 FR2847267 中并被申请 人以 InhipaseTM 的名称推向市场的活性成分尤其是野葛 (Pueraria lobata) 根提取物。 - 创伤愈合剂，如泛醇及其衍生物例如乙基泛醇、芦荟 (Aloe vera)、泛酸及其衍 生物、尿囊素、红没药醇和甘草酸二钾。
     - 抗炎剂，如类固醇和非类固醇抗炎药，尤其是细胞因子和趋化因子、环加氧 酶、氧化氮 (NO) 和 NOS 氧化氮合酶的产生的抑制剂。 可以提及的抗炎产品的实例包含 银杏 (Gingko biloba) 提取物、三内酯萜类 (trilactoneterpenes) 如银杏苦内酯 (gingkolide)， 尤其是已知其对血小板活化因子 (PAF) 的拮抗特性的银杏苦内酯 B 和白果内酯。
     - 弹性蛋白酶抑制剂，如 Haslea ostrearia 提取物，例如由申请人推向市场的 Blue algae extractTM。
     - 保湿和 / 或抗炎剂，如 Palmaria palmate 提取物，例如由申请人推向市场的 Sea TM Parsley 产品。
     本发明还涉及包含与其他活性成分组合的本发明的活性成分的化妆品组合物， 已知该其他活性成分用于敏感性皮肤或致使暂时敏感、反应和 / 或反应过度的皮肤的化 妆品护理和 / 或治疗。
     本发明涵盖药物治疗方法，其包括尤其是通过局部应用对有需要的个体施用用 于上文所列的多种治疗的活性剂。
     本发明还涉及用于筛选这些活性成分的方法。
     根据一个变通方案，本发明涉及用于筛选能够提高皮肤和 / 或黏膜树突细胞免 疫应答的激活阈值的活性成分的方法，所述方法包括 ：
     (i) 制备包含未成熟或未激活的树突细胞 (DC) 的培养基 ；
     (ii) 将包含 DC 的培养基置于与待针对其提高皮肤树突细胞免疫应答的激活阈值 的能力筛选的至少一种物质接触 ；
     (iii) 回收 DC 以定量 DC 激活标记的表达 ；
     (iv) 相对于用阳性对照如类固醇抗炎剂优选地塞米松获得的 DC 激活标记表达 值，比较已置于与待筛选物质接触的 DC 的激活标记表达值，以选择提高皮肤和 / 或黏膜 树突细胞免疫应答的激活阈值的活性成分。
     根据另一个变通方案，本发明涉及用于筛选能够提高皮肤和 / 或黏膜树突细胞 免疫应答的激活阈值的活性成分的方法，所述方法包括 ：
     (i) 制备包含未成熟或未激活的树突细胞 (DC) 的培养基 ；
     (ii) 将包含 DC 的培养基置于与待针对其提高皮肤树突细胞免疫应答的激活阈值 的能力筛选的至少一种物质和已知用于通过提高至少一种 DC 标记的表达来激活免疫应答 的至少一种物质接触 ；
     (iii) 回收 DC 以定量用待筛选物质或活性成分处理和用所述物质刺激后 DC 激活 标记的表达 ；
     (iv) 相对于用阳性对照如类固醇抗炎剂优选地塞米松获得的 DC 激活标记表达 值，比较已置于与待筛选物质和所述物质接触的 DC 的激活标记表达值，以选择在所述物 质存在的情况下提高皮肤和 / 或黏膜树突细胞免疫应答的激活阈值的活性成分。 用于提高至少一种 DC 标记的表达的物质可以是已知用于刺激免疫细胞的应答的 物质，如 LPS 和 TNFα 的混合物。
     有利地，该方法还包括 ：
     (iiib) 将步骤 (iii) 中回收的一些 DC 再培养足以使这些细胞恢复其 基础激活水平 的时间，所述培养基不包含待筛选的任意活性成分或物质 ；
     (ivb) 步骤 (iiib) 之后定量 DC 激活标记的表达，以选择提高皮肤树突细胞免疫应 答的激活阈值和允许步骤 (iiib) 之后激活免疫应答的活性成分。 待针对其提高皮肤树突 细胞免疫应答的激活阈值的能力筛选的物质是例如希望定量其抑制 DC 激活标记表达的能 力的植物来源的物质或表征的分子的物质。
     表征的分子是已知其化学结构的分子。
     DC 激活标记优选选自 CD40、 CD54、 CD80、 CD86、 HLA-DR、 CCR7，其是 MIP-3β( 巨噬细胞炎性蛋白 -3β) 趋化因子受体。
     DC 成熟标记优选选自 CD83 和 DC LAMP。
     可以使用任意方法来定量 DC 激活标记的表达。 可以有利地使用 RT-PCR 尤其 是定量 RT-PCR 或流式细胞术或 ELISA 的方法。
     因此 DC 激活标记的表达涉及 DC 激活标记的蛋白质表达和 DC 激活标记的基因 表达 (mRNA) 二者。
     用阳性对照和阴性对照来进行相对于对照的用于选择活性成分的 DC 激活标记表 达值的比较，优选该阳性对照和阴性对照是激活和 / 或成熟剂例如 LPS/TNFα 混合物和 免疫抑制剂例如地塞米松。
     有利地，当其使得可能按照该筛选方法获得 LC 或 DDC 所表达的 CD86 的蛋白 质表达低于或等于有或无由 LPS 50μg/mL 和 TNFα10ng/mL 组成的激活剂存在的情况下 LC 或 DDC 所表达的 CD86 蛋白质表达的 95％且优选低于 70％，和 / 或 LC 或 DDC 所表 达的 CD86 的基因表达低于或等于有或无由 LPS 50μg/mL 和 TNFα10ng/mL 组成的激活
     剂存在的情况下 LC 或 DDC 所表达的 CD86 基因表达的 95％且优选低于 75％时，认为所 筛选的物质是活性成分或活性物质。
     根据其他实施方案，本发明涉及本发明的活性成分与刺激剂或潜在的刺激剂组 合的局部用途，优选非治疗性用途。
     本发明还涉及预期与皮肤和 / 或黏膜接触的包含本发明的活性成分和刺激剂的 组合物。 刺激剂可以是例如去垢剂，接触攻击剂，防腐剂尤其是 乙二醇衍生物尤其是 戊二醇衍生物，化妆品刺激剂如 AHA 尤其是乙醇酸、乳酸及其衍生物，如视黄醇及类 视黄醇衍生物，尤其是视黄醛、视黄酸，如水杨酸，和 / 或与在限制条件下允许的 EEC Directive 76/768 中所列的一种或几种成分组合于化妆品组合物中，尤其是 Annex 3 中所列 的成分。
     根据其他实施方案，本发明的活性成分可以用于日常化妆品护理组合物。 因此 本发明涉及化妆品护理和 / 或治疗方法，其中至少一种本发明的活性成分优选 Cestrum latifolium 提取物可能与化妆品刺激剂组合每天以有效剂量在皮肤和 / 或黏膜上应用。
     通过阅读参考了实施例的解释性描述，本发明的其他目的、特征和优势将清楚 地呈现给本领域技术人员，所述实施例是为了纯说明性目的而给出，不应以任意方式认 为其限制本发明的范围。 实施例形成本发明的整体部分，来自其 ( 包含实施例 ) 的整体中取出的描述的任 意相对于现有技术表现为新颖的特征以其功能和其一般性形成本发明的整体部分。
     因此，每一实施例具有一般范围。
     此外，在实施例中，除非另作指定，所有百分数以重量计，除非另作指定，温 度表示为摄氏度数，除非另作指定，压力是大气压。
     实施例
     实施例 1 ：皮肤树突细胞 LC 和 DDC 的制备 在两个连续步骤中进行从血单核细胞制备 LC 和 DDC 的方法。 步骤 1 ：从循环外周血分离单核细胞的方法 在有抗凝剂优选肝素锂存在的情况下收集一个或多个人供体的循环静脉外周血。 可以有利地按照以下流程进行单核细胞从循环血的分离 ：
     1/ 在淋巴细胞分离培养基上离心血液后，回收单核细胞，然后 ：
     - 或 者 用 抗 体 混 合 物 例 如 偶 联 至 磁 珠 的 抗 -CD3、 抗 -CD7、 抗 -CD16、 抗 CD19、抗 CD56、抗 CD123、抗 - 血型糖蛋白 A 抗体标记。 穿过磁化 柱后，仅洗脱和回 收未标记的单核细胞。
     - 或者用对单核细胞特异的抗体，如偶联至磁珠的抗 -CD14 抗体标记。 穿过磁 化柱后，仅标记的单核细胞滞留在柱中。 洗脱柱后，回收标记的单核细胞。
     - 或者用对单核细胞特异的抗体如偶联至荧光染料如澡红蛋白的抗 -CD16 抗体 标记。 通过流式细胞术分选细胞后，仅回收标记的单核细胞。
     2/ 通过进行本领域技术人员公知的任意物理分离方法，尤其是通过沉淀或离心 回收单核细胞，并在不为随后的培养进一步加工的情况下洗脱。
     3/ 每 100mL 所收集的血液的提取收率是约 150 兆 (million)(±20 兆 ) 单核细胞， 从其中获得至多 40 兆单核细胞。
     步骤 2 ：冻存来自循环外周血的单核细胞的方法
     可以有利地在 -80℃至 -196℃，优选在液氮中于 -196℃、以约 10 兆 /mL 的比 率、在适合的冻存培养基例如由 90％胎牛血清和 10％ DMSO( 二甲基亚砜 ) 组成的培养 基中冻存步骤 1 中获得的单核细胞。
     该冻存步骤有利地允许供体库例如 3 个单核细胞供体的细胞混合物的制备。
     步骤 3 ：培养分离的单核细胞以获得未成熟的 LC 和 DDC 的方法
     按约 1 兆 /mL 的比率在确定或不确定的培养基中培养 (37℃、5％ CO2) 步骤 1 和 / 或 2 中获得的单核细胞，优选在补充 10％胎牛血清并包含以下三种细胞因子的 RPMI 1640 培养基中 ：GM-CSF( 粒细胞 - 巨噬细胞集落刺激因子，比率为 200ng/mL)、比率为 10ng/mL 的 TGFβ1( 转化生长因子 β1) 和比率为 10ng/mL 的 IL-13( 白细胞介素 13)。
     在培养的第 6 天，未成熟的 LC 和 DDC 同时产生，且在表型上和功能上非常类 似于其体内相应物 ：
     - 体 外 产 生 的 树 突 细 胞 的 至 多 40 ％ 在 胞 内 表 达 langerine， 至 多 60 ％ 表 达 DC-SIGN。
     - 体外产生的 LC 和 DDC 是未成熟的，因为它们按基础水平表达共刺激分子 CD80 和 D86，且不表达成熟分子 CD83 和 DC-LAMP。
     - 用 TNFα( 有利地为 10ng/mL) 和 LPS( 有利地为 50μg/mL) 刺激 48 小时后， 如由分子 CD80 和 CD86 表达的提高和由成熟标记 CD83 和 DC-LAMP 表达的获得所表 明， LC 和 DDC 获得激活和成熟的 DC 的表型。
     步骤 4 ：培养分离的单核细胞以获得激活的 LC 和 DDC 的方法
     按实施例 1 和步骤 3 中所述，但在存在以下三种细胞因子的情况下培养细胞 ：比 率为 200ng/mL 的 GB-CSF、比率为 10ng/mL 的 TGFβ1 和比率为 10ng/mL 的 TNFα。
     孵育 24 小时后，激活的 LC 和 DDC 同时产生，且在表型上和功能上非常类似于 其体内相应物。
     -LC 和 DDC 显示以下分子的强表达 ：HLA-DR，其是 II 类 MHC 分子 ；CD80 和 CD86，其是共刺激分子 ；和 CCR7，其是迁移受体。
     -LC 和 DDC 还显示应答趋化因子 MIP-3β 的高迁移能力。
     实施例 2 ：化妆品活性成分的制备
     活性成分具有不同的来源 ( 例如植物来源或表征的分子 )。
     取决于植物，通过例如离析提取选自根、根茎、茎、树皮、花、果实、芽、种 子和叶的至少部分植物是有利的，该部分植物以 1％和 10％ (w/w) 之间在溶剂或溶剂混 合物中，优选极性质子溶剂，且有利地在水、醇、乙二醇、多元醇、100/0 至 0/100(v/ v) 的水 / 醇、水 / 乙二醇或水 / 多元醇混合物 ( 如水与乙醇、丙三醇、丁二醇或其他多元 醇类如木糖醇等混合 ) 中。 然后优选离心和 / 或过滤和 / 或蒸馏所获得的提取物以回收 活性可溶性级分 ( 粗提取物 )。 活性物质有利地是在溶剂如水、醇、多元醇、乙二醇或其 混合物中且优选在水中的植物提取物。 优选在 0.001％和 10％ (v/v) 之间，有利地是粗提 取物的重量相对于活性成分的总重量在 0.01％和 5％之间和更尤其是 1wt％的浓度将溶解在溶剂中的粗提取物 ( 活性成分 ) 用来进行测试。 可以通过蒸发去除溶剂来浓缩活性成 分，例如通过冷冻干燥或通过喷雾。
     通过溶解在溶剂例如水、乙醇、乙二醇中或优选溶解在 DMSO 中制备 表征的分 子，并优选在 1×10-7wt％和 1wt％之间，有利地在 1×10-5wt％和 1×10-1wt％，且尤其是 在 1×10-1wt％的活性成分浓度测试。
     实施例 3 ：用于筛选化妆品活性成分的模型
     在按照实施例 1 获得的 LC/DDC 上测试活性成分。 当在实施例 1 的步骤 3 中获 得的 “未成熟的” LC/DDC 上测试活性成分时，这称为预防性护理。 当在实施例 1 的步 骤 4 中获得的 “激活的” LC/DDC 上测试活性成分时，这称为治疗性护理。
     例如按 400000 细胞 /cm2 的比率，在确定或不确定的培养基中，优选在补充 10％ 胎牛血清和包含以下两种细胞因子的 RPMI 1640 培养基中将细胞接种至 24 孔板内 ：比率 为 200ng/mL 的 GM-CSF 和比率为 10ng/mL 的 TGFβ1。 然后将活性成分加至所述培养 基并用以下终浓度测试 ：
     - 对于植物提取物，活性成分相对于培养基的总重量在 0.001％和 10％ (v/v) 之 间，有利地在 0.01wt％和 5wt％之间和尤其是在 1wt％ ；
     - 对 于 表 征 的 分 子， 表 征 的 分 子 ( 或 化 学 分 子 ) 相 对 于 培 养 基 的 总 重 量 在 -7 1×10 ％ 和 1 ％ (v/v) 之 间， 有 利 地 在 1×10-5wt ％ 和 1×10-1wt ％ 之 间， 且 尤 其 是 在 1×10-1wt％。
     于 37℃在 5％ CO2 下在所述培养基中孵育活性成分至多 48 小时且有利地孵育 24 小时。
     阴性对照是仅培养基，或包含浓度与所测试的活性剂的浓度相等的提取所测试 的提取物的过程中使用的溶剂的培养基，或包含主要的抗炎糖皮质激素地塞米松 (10-8M) 的培养基。 用来诱导 LC/DDC 激活的参考阳性对照是 LPS( 有利地在 50μg/mL) 和 TNFα( 有利地在 10ng/mL) 的混合物。
     实施例 4 ：所选择的具有免疫抑制剂能力的活性成分
     我们选择了 3 种表征的分子 ( 一叶嵃碱、单叶芸香定丙酮化合物、8- 氧代假 棕榈碱 ) 以及 4 种植物提取物 (Cestrum latifolium、 Phoradendron piperoides、 Maprounea guyanensis 和千日菊 )，其分别表示在表 1 和 2 中。
     表征的分子 CAS 编号 一叶嵃碱 5610-40-2 单叶芸香定丙酮化合物 nd 8- 氧代假棕榈碱 10211-78-6
     表 1 ：本发明中所选择的表征的分子
     化学式 C13H15NO2 C21H21NO5 C19H25NO5摩尔质量 217.27g.mol-1 367.40g.mol-1 347.41g.mol-1
     植物提取物 Cestrum latifolium Phoradendron piperoides Maprounea guyanensis 千日菊 表 2 ：本发明中所选择的植物提取物14植物的部分 气生部分 气生部分 叶 叶CN 102026616 A CN 102026631 A
     说明书12/26 页实施例 5 ：化妆品活性成分的细胞毒性测试
     对于所测试的每一活性剂，为了显示该活性剂对细胞没有细胞毒效应和该活性 剂的效应不是与由该活性成分诱导的死亡率相关的细胞应激的结果，在细胞上进行细胞 生存力测试。 当用所述活性剂处理后细胞生存力低于 75％时，该活性成分具有细胞毒效 应。
     按 200000 细胞 / 孔的比率，在实施例 3 中所述的培养基中将实施例 1 和步骤 3 中所述的 LC/DDC 接种至 P96 孔板内。 用活性成分处理细胞描述于实施例 3 中。
     用 所 述 活 性 成 分 处 理 后， 每 孔 用 5μl 染 料 7-AAD(7- 氨 基 放 线 菌 素 D(7-aminoactinomycin D)) 孵育细胞。 孵育 5 分钟后，通过流式细胞术分析细胞。
     细胞生存力表示为活细胞或染料未穿透不渗透的膜的阴性 7-AAD 的百分数。 此 分析技术还使得可能使用 7-AAD 阳性标记的细胞可见，即已通过活性剂经受细胞毒效应 的细胞。
     阴性对照或者是仅培养基，或者是包含浓度与所测试的活性成分的该浓度相等 的提取所测试的提取物的过程中使用的溶剂的培养基。 用来诱导 LC/DDC 的死亡率的参 考阳性对照是终浓度为 4μM 的喜树碱。
     表 3 显示本发明中所选择的活性成分的细胞生存力研究的结果。表 3 ：用所选择的活性成分处理后未成熟的 LC/DDC 的细胞生存力的研究。
     结论 ：
     表 3 中所述的化妆品活性成分显示对 LC/DDC 无细胞毒效应。 用所述活性成分 处理后 LC/DDC 的细胞生存力接近 100％。
     实施例 6 ：化妆品活性成分的免疫抑制特性的分析 -CD86 分子蛋白质表达的研 究
     活性成分的免疫抑制剂潜能的评估需要用所述活性成分处理的 LC/DDC 的激活 分子 ( 例如共刺激分子 CD86) 表达的研究。
     流式细胞术使得可能定量用所述活性剂处理或未处理的 LC/DDC 细胞膜上 CD86 的蛋白质表达。
     按以下方式通过流式细胞术进行化妆品活性成分的免疫抑制特性研究 ：
     1/ 按实施例 1 和步骤 3 中所述产生未成熟的 LC/DDC。
     2/ 按 400000 细胞 /cm2 的比率和在实施例 3 中所述的培养基中将细胞接种至 P24 孔板内。 用活性成分处理细胞描述于实施例 3 中。 平行地，用降低剂量的活性成分处 理细胞以建立剂量 / 效应相关 ：对于表征的分子，从 10-6M 至 5×10-8M ；对于植物提取 物，从 0.1％至 0.005％。
     3/ 用活性成分处理后，回收细胞，然后按 200000 细胞 /50μl/ 孔的比率在标记 培养基 (30％ RPMI、68％ PBS 和 2％ FCS) 中于 P96 孔板内孵育。
     4/ 然后将细胞与偶联至荧光染料如澡红蛋白的抗 -CD86 单克隆抗体 ( 有利地为 10μl 抗 -CD86 抗体 / 孔 ) 孵育 30 分钟。 阴性标记对照对应于 IgG1 对照同种型。 此标 记步骤之后，用所述标记缓冲液漂洗细胞，然后通过流式细胞术分析。
     5/ 表 4 显示所选择的活性成分的免疫抑制特性分析的结果。 按以下方式表示结 果 ：未用活性剂处理的对照称为 CD86 分子的 100％表达，测试表示为用活性成分处理后 的 CD86 分子的残留表达 ( 以百分数表示 )。 阴性对照对应于用具有诱导 CD86 表达的特 性的地塞米松处理的细胞。 还计算了免疫抑制的水平，其与 CD86 的残留表达成反比。
     表 4 ：在未成熟的 LC/DDC 上测试的活性成分的免疫抑制特性。
     结论 ：
     表 4 中所述的活性成分具有降低共刺激分子 CD86 的蛋白质表达的能力。 因此 所述活性成分具有提高 LC/DDC 的激活阈值的能力。 换言之，免疫抑制的水平越高和越 接近于 1，活性剂的免疫抑制力越高。
     表 5 ：在未成熟的 LC/DDC 上测试的活性成分的剂量 / 效应研究。表 6 ：在未成熟的 LC/DDC 上测试的活性成分的剂量 / 效应研究。
     结论 ：
     表 5 和 6 中所述的活性成分具有依赖于其终浓度的免疫抑制特性。
     实施例 7 ：化妆品活性成分的免疫抑制特性分析
     编码 CD86 分子的信使 RNA 的表达研究
     定量 RT-PCR 使得可能定量用所述活性剂处理或未处理的 LC/DDC 中编码蛋白 质 CD86 的信使 RNA 的表达。
     按以下方式通过定量 RT-PCR 进行化妆品活性成分的免疫抑制特性研究 ：
     1/ 按实施例 1 和步骤 3 中所述产生未成熟的 LC/DDC。
     2/ 按 400000 细胞 /cm2 的比率和在实施例 3 中所述的培养基中将细胞接种至 P24 孔板内。 用活性成分处理细胞描述于实施例 3 中。
     3/ 用活性成分处理后，回收细胞，并在用 pH 7.4 的磷酸盐缓冲液漂洗后通过例 如于 -80℃干燥冷冻来保存。
     4/ 例如用 96 孔提取试剂盒在二氧化硅柱上提取细胞的总 RNA，并在 96 孔分光 光度计上于 260nm 测定 ( 纯度指示 ：于 280nm 的蛋白质测定 )。 将 RNA 稀释至例如 5ng/ μl。
     5/ 例如在 50ng 初始 RNA 上在 96 孔板上对肌动蛋白和 CD86 分子的基因进行第 一步中的定性 RT-PCR。 每一基因的特异性引物指定于以下表 7 中并按例如 0.5μM 使 用。
     用于所研究的基因的特异性引物 肌动蛋白正义 (SEQ ID NO 1)GTGGGGCGCCCCAGGCACCA肌动蛋白反义 (SEQ ID NO2)CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC
     CD86 正义 (SEQ ID NO3)CTCTTTGTGATGGCCTTCCTGC
     CD86 反义 (SEQ ID NO4)CCTGTGGGCTTTTTGTGATGGA
     扩增参数有利地为以下 ：在进行扩增循环的 Opticon 循环变温器中用 Quanti Tect SYBR Green RT-PCR 试剂盒 (Qiagen，France) 在包含信使 RNA 的孔上进行实时 RT-PCR 技术。 反转录 (RT) 于 50℃进行 30 分钟，然后 95℃进行 15 分钟以抑制反转录酶、激活 聚合酶和变性所获得的互补 DNA(cDNA)。 进行 50 个循环的链聚合 (PCR)(95℃ 15 秒， 60℃ 30 秒，72℃ 30 秒 )。 在每一循环的终点读取荧光，其与扩增片段的数量成正比。 表达水平由每一基因的表达相对于肌动蛋白的比率定义。
     6/ 表 8 显示所选择的活性成分的免疫抑制特性分析的结果。 按以下方式表示结 果 ：未处理的对照称为编码 CD86 分子的信使 RNA 的 100％表达，测试表示为作为相对 于用阴性对照获得的表达水平，编码 CD86 的信使 RNA 的表达水平的改变百分数。
     表 7 ：在未成熟的 LC/DDC 上测试的活性成分的免疫抑制特性。
     结论 ：
     表 7 中所述的活性成分具有降低编码共刺激分子 CD86 的信使 RNA 的表达的能 力。 因此所述活性成分具有提高 LC/DDC 的激活阈值的能力。 换言之，免疫抑制的水 平越高和越接近于 1，活性物质的免疫抑制力越高。
     实施例 8 ：免疫抑制活性成分处理的 LC/DDC 应答危险信号的能力的研究
     活性成分的免疫抑制潜能的评估也需要用所述活性成分处理时 LC/DDC 应答危 险信号例如细菌感染的能力的研究。 具体而言，我们检验了同时用活性成分处理和通过 危险信号激活的 LC/DDC 仍然具有其识别危险信号的功能。 为此，我们检验了同时用活 性成分处理，和用 LPS 和 TNFα 刺激的 LD/DDC 能够在此刺激后过量表达共刺激分子 CD86。
     按以下方式进行流式细胞术研究 ：
     1/ 按实施例 1 和步骤 3 中所述产生未成熟的 LC/DDC。
     2/ 按 400000 细胞 /cm2 的比率和在实施例 3 中所述的培养基中将细胞接种至 P24 孔板内。 将 LPS( 有利地按 50μg/mL) 和 TNFα( 有利地按 10μg/mL) 的混合物加至所 述培养基。 同时，按实施例 3 中所述用活性成分处理细胞。
     3/ 按实施例 6 中所述，通过流式细胞术分析已同时用活性成分处理，和用 LPS 和 TNFα 刺激的细胞，以定量 “处理 + 刺激” 后 CD86 分子的残留表达。
     4/ 表 9 显示同时用所选择的活性成分处理的 LD/DDC 应答危险信号的能力分 析的结果。 按以下方式表示结果 ：未用活性剂处理和未用 LPS+TNFα 刺激的对照称为 CD86 分子的 100％表达，测试表示为 “处理” 后、 “处理 + 刺激” 和 “刺激” 后 CD86 分子的残留表达。 我们还计算了应答危险信号的能力水平，其与处理 + 刺激后的 CD86 残留表达成正比。
     表 8 ：同时用 LPS+TNFα 刺激，和用所选择的活性成分处理的 LC/DDC 应答危 险信号的能力的研究。
     结论 ：
     如由处理 + 刺激后共刺激分子 CD86 的残留表达所表明，同时用活性成分处理和 用 TNFα/LPS 刺激的 LC/DDC 具有应答危险信号的能力。 因此细胞具有接近于其基础 状态的应答危险信号的能力。
     实施例 9 ：免疫抑制剂活性成分处理后 LC/DDC 应答危险信号的能力的研究
     如在实施例 8 中，我们检验了当已预先用活性成分处理且不再处于处理中时 LC/
     DDC 能够应答危险信号例如细菌感染。 为此，我们检验了用所述活性成分处理且然后用 LPS 和 TNFα( 在不存在活性成分的情况下 ) 刺激的 LC/DDC 能够在此刺激后过量表达共 刺激分子 CD86。
     按以下方式进行流式细胞术研究 ：
     1/ 按实施例 1 和步骤 3 中所述产生未成熟的 LC/DDC。
     2/ 按 400000 细胞 /cm2 的比率和在实施例 3 中所述的培养基中将细胞接种至 P24 孔板内。 用活性成分处理细胞描述于实施例 3 中。
     3/ 在无活性成分的情况下和在实施例 3 中所述的培养基中将用活性成分处理的 细胞再培养 48 小时。 将 LPS( 有利地按 50μg/mL) 和 TNFα( 有利地按 10μg/mL) 的混 合物加至所述培养基。 然后按实施例 6 中所述，通过流式细胞术分析细胞，以定量 “预 处理 + 刺激” 后 CD86 分子的残留表达。
     4/ 表 10 显示预先用所选择的活性成分处理且不再处于处理中的 LD/DDC 应答危 险信号的能力的分析结果。 按以下方式表示结果 ：未用活性剂处理和未用 LPS 和 TNFα 刺激的对照称为处于 CD86 分子的 100％表达，测试表示为 “刺激” 后和 “预处理 + 刺 激” 后 CD86 分子的残留表达。 我们还计算了应答危险信号的能力水平，其与预处理 + 刺激后 CD86 的残留表达成正比。
     表 9 ：用所选择的活性成分预处理且然后用 LPS+TNFα 刺激的 LC/DDC 应答危 险信号的能力的研究。
     结论 ：
     如由预处理 + 刺激后共刺激分子 CD86 的残留表达所表明，用活性成分预处理且 然后用 TNFα/LPS 刺激的 LC/DDC 具有应答此危险信号的能力。 因此细胞具有接近于 其基础状态的应答危险信号的能力。
     实施例 10 ：本发明的产品在水包油型乳状液类型的化妆品或药物制剂中的用途
     制剂 10a ：
     制剂 10b ：
     制剂 10c ：
     实施例 11 ：本发明的产品在油包水类型的制剂中的用途
     实施例 12 ：本发明的产品在洗发剂或沐浴凝胶类型的制剂中的用途
     实施例 13 ：本发明的产品在唇膏型制剂和其他无水产品中的用途
     实施例 14 ：本发明的产品在含水凝胶制剂 ( 眼部紧致、减肥等 ) 中的用途
     实施例 15 ：本发明的产品在三重乳状液类型的制剂中的用途 初级乳状液 W1/O ：
     二级乳状液 W1/O/W2 ：
     实施例 16 ：包含本发明的产品的药物制剂的制备 制剂 16a ：片剂的制备
     制剂 16b ：软膏剂的制备
     本发明尤其涉及敏感性皮肤或致使暂时敏感、反应或反应过度的皮肤的护理和 / 或治疗。
    背景技术 皮肤刺激和变态反应 ( 迟发型接触性超敏反应或接触性变态反应或接触性湿疹 ) 已成为工业化国家中的健康问题。 其原因与见于例如金属盐、化妆品和卫生产品、香 料、药物、防腐剂、消毒剂、衣物、植物等中的接触性刺激素和变应原的数量一样多。 在此相同背景中，声称其具有敏感或反应过度的皮肤的人数近年中已大幅提高。 该数目 已从 20 世纪 80 年代的人口的 30％上升至今天的约 60％。
     皮肤敏感性最重要的原因之一涉及尤其是遗传性 / 获得性角质层胞间脂质缺乏 引起的屏障作用的衰减。 提高的神经感觉活性也是引起皮肤敏感性提高的因素，其表征
    为表皮神经末梢改变、神经递质累积或中枢神经系统信息传递破坏。 皮肤敏感性的第三 个其他原因是提高的免疫敏感性，其尤其包含表皮朗格汉斯细胞 (LC) 密度的可测量的提 高，且其在最极端情况下导致病状，如接触性荨麻疹、接触刺激性或变应性皮炎、或遗 传过敏性皮炎。
     敏感性皮肤类型的多态性表现为主观感觉 ( 如蛰刺、灼伤感觉、瘙痒感觉、绷 紧 ) 和客观皮肤反应 ( 如发红、可见鳞片和皮肤增厚 )。 这些不雅和 / 或不适的现象 ( 尤 其是刺激 ) 是敏感性皮肤的特征。 在最极端的情况下，还描述了刺激或甚至变态反应。
     在化妆品和药物二者中都已知尤其是通过预防和 / 或治疗炎症或刺激 素反应的 实施来降低所有皮肤类型的敏感性。 具体而言，在据称其皮肤是 “敏感的” 的个体情况 下，甚至轻度暴露于攻击性物质 (agent) 或刺激素条件都可以表现为不雅和 / 或不适的皮 肤和 / 或黏膜现象，该现象可以导致本应适当避免的炎症或实质的刺激反应。 当前对敏 感性皮肤的治疗具有使皮肤更具耐受性的目的，即提高敏感性皮肤类型的反应性阈值的 目的，该敏感性皮肤类型表征为较低的对刺激素反应的刺激性阈值。 这些治疗基于使皮 肤 “镇静” 的产品的用途。
     通常将其中成分降至最低，并从其排除基本上不适合用于敏感性或变应性表皮 的物质的专用的 “敏感性皮肤” 化妆品制剂。 叙述可以由既不包含香料，也不包含醇、 染料、色素、防腐剂、活性剂，且具有中性 pH 的保湿产品的用途构成。
     基于富含痕量元素和矿物盐的泉水的润肤或镇静产品具有与生理盐溶液相似的 性质，如等渗性。 可以用镇静剂和如锦葵、燕麦和矢车菊的抗炎植物提取物强化这些产 品。
     具有用天然分子加强皮肤屏障的能力的防护产品，该天然分子将重建表皮的脂 膜 (hydrolipid film)，以使所述表皮恢复其所有防护功能。 通常将皮肤脂质的前体神经酰 胺用于这类应用。 还针对护理反应过度的皮肤描述了基于具有成膜效应的糖类的产品。通过作用于皮肤的敏感性神经纤维受体而具有神经化妆品活性 (neurocosmetic activity) 的减压 (destressing) 产品，如 β- 内啡肽样产品。 一般通过释放如 α-MSH( 促 黑激素 ) 的抗炎神经介质或通过抑制如 TNFα( 肿瘤坏死因子 )、IL-1β( 白细胞介素 1β) 或 PGE2( 前列腺素 E2) 的内源抗炎因子将这些产品偶联至抗炎作用。
     基本上涉及所有皮肤细胞的皮肤免疫学成分主要由以下构成 ：
     - 皮肤树突细胞 (DC) ：朗格汉斯细胞和真皮 DC(dermal DC， DDC)，其因作为 抗原呈递细胞 (AgPC) 的功能而是皮肤免疫应答的起因 ；
     - 角质形成细胞 ：其因其所构成的基本的皮肤微环境 ( 汗液、皮脂、抗微生物 肽、生长因子、细胞因子、趋化因子等 ) 而是皮肤 CD 的主要细胞 配偶体。
     在抗原 ( 例如变应原、病原体和 / 或异物 ) 刺激过程中，皮肤 DC 具有以下功 能：
     - 获得或捕获抗原 ；
     - 在皮肤外和在淋巴结的方向迁移 ；
     - 将抗原信息呈递至淋巴细胞以起始特异的适应性免疫。
     皮肤 DC 还必须整合由邻近的角质形成细胞递送的所有内源信号。 具体而言， 在任意刺激下且取决于其性质，角质形成细胞产生非常广泛的一组将影响 LC 和 DDC 的 免疫学功能的可溶性介质 ( 例如细胞因子等 )。
     捕获抗原后，皮肤 DC 随后经历表型和功能改变 ：
     - 抗原的捕获诱导 LC 和 DDC 的激活，然后其获得 “激活的” 表型。 此激活表 型表现为直接涉及 DC 对 T 淋巴细胞的激活阈值的共刺激分子 CD80 和 CD86 的强表达。 II 类 MHC( 主要组织相容性复合物 ) 分子，尤其是 HLA-DR 的膜表达也因 DC 表面抗原 肽的呈递而显著提高。
     -LC 和 DDC 的激活还与 DC 在皮肤外和在淋巴结的方向迁移所必需的 CCR7 受 体表达的获得相关。
     - 在其迁移过程中， LC 和 DDC 经历成熟过程和获得 “成熟的” DC 表型。 淋 巴细胞的致敏和免疫的建立所必需的此成熟状态表现为 CD83 和 DC-LAMP 标记的表达和 分泌细胞因子的能力。
     发明目的
     本发明的主要目的是提供能够提高个体的免疫细胞，尤其是皮肤和 / 或黏膜免 疫细胞的激活阈值的活性成分。 这导致皮肤和 / 或黏膜敏感性和 / 或皮肤和 / 或黏膜反 应性的降低，和 / 或皮肤和 / 或黏膜耐受性的提高。 因此，这在化妆品或药物，尤其是 皮肤病学治疗和 / 或护理的背景中具有不可否认的益处。
     本发明的目的还提供用于筛选具有上文所述活性的物质的筛选模型，其考虑皮 肤 DC 的两个群体 (LC 和 DDC) 的应答。
     发明详述
     本 发 明 涉 及 选 自 Phoradendron piperoides 植 物 提 取 物、 Cestrumlatifolium 植 物 提取物、千日菊 (Spilanthes oleracea) 植物提取物、 Maprounea guyanensis 植物提取物、 一叶嵃碱 (securinine)、单叶芸香定丙酮化合物 (foliosidine acetonide)、8- 氧代假棕榈碱 (8-oxopseudopalmatine) 或其任意组合的至少一种活性成分作为用于提高个体免疫细胞的激活阈值的活性剂在制备化妆品组合物中，或在制备优选预期用于提高个体免疫应答的 激活阈值的药物组合物，尤其是皮肤病学组合物中的用途。 这种活性成分有利地使得可 能降低个体的至少部分皮肤和 / 或黏膜的敏感性和 / 或反应性。
     本发明人通过术语 “降低” 指至少部分地降低和 / 或限制个体的至少部分皮肤 和 / 或黏膜的反应性。
     有利地，活性成分降低和 / 或预防皮肤和 / 或黏膜免疫反应。
     有利地，活性成分降低和 / 或抑制至少一类免疫细胞尤其是树突细胞的活性。
     有利地，活性成分降低至少表皮朗格汉斯细胞 (LC) 和 / 或真皮树突细胞 (DDC) 的活性。
     有利地，活性成分与镇静剂组合。
     本发明的活性成分具有通过提高免疫细胞尤其是 DC 的激活阈值来降低免疫应 答的能力。 具体而言，本发明的活性成分有利地免疫抑制基本上不同于皮肤炎症途径的 皮肤免疫能力。 当前的抗炎产品基本上降低由皮肤角质形成细胞分泌的可溶性促炎因子 ( 细胞因子、白细胞介素等 ) 的合成能力。 本发明的物质靶向完全不同的调节途径，其是 皮肤免疫应答的途径。 这些作用方式可以是互补的。 个体免疫细胞的激活阈值，尤其是 DC 的激活阈值由激活标记，尤其是 CD86 激 活标记的表达定义。 在正常皮肤中，未成熟和未激活的 DC 具有我们已定义为这些细胞 的激活阈值的 CD86 的基础表达水平。 因此，未 成熟和未激活的 DC 上激活标记表达的 降低，尤其是 CD86 表达的降低表现为免疫细胞激活阈值的提高。
     与单独作用于皮肤免疫应答的间接途径，尤其是作用于皮肤环境，尤其是角质 形成细胞的可溶性免疫介质 ( 细胞因子 ) 的分泌的标准抗炎产品相反，本发明具有靶向皮 肤 DC 的优势，即靶向免疫应答的优势。
     有利地，本发明的活性成分在皮肤中降低至少一类选自下列的标记的表达 ：(i) 由未成熟的树突细胞按基础水平表达的 CD86 ；(ii) 由激活的树突细胞表达的 CD40、 CD54、 CD80、 HLA DR、 CCR7 或 CD86 ；和 (iii) 由 激 活 和 成 熟 的 树 突 细 胞 表 达 的 CD40、 CD54、 CD80、 HLA DR、 CCR7、 CD86、 CD83 或 DC LAMP，尤其是以降低敏 感性皮肤的反应性。
     本发明具有在个体需要时 ( 例如在细菌攻击皮肤的过程中、或一般在病原体 剂、高攻击性化学剂和 / 或异物存在的情况下 ) 提高触发免疫应答的阈值，而同时对随后 的免疫应答具有最小的影响的优势。 另一方面，降低皮肤中可溶性促炎介质合成的抗炎 产品不考虑随后的皮肤 DC 的应答。 因此，在使用抗炎产品的标准治疗中，免疫应答被 阻断或至少受损。 这明显具有提供经历免疫应答激活剂攻击的个体皮肤弱保护的缺点。
     因此，有利地，本发明的活性成分基本上不抑制免疫应答，尤其是不抑制树突 细胞的免疫功能性。
     此外，当局部应用后活性成分不再与皮肤接触时，本发明的活性成分允许基础 免疫活性的部分恢复，尤其是树突细胞基础免疫活性的部分恢复。
     本发明的活性成分适合用于任意皮肤类型，且尤其适合用于具有敏感、反应和 / 或反应过度的皮肤，和 / 或由如维生素 A 酸和 / 或攻击性物质和 / 或攻击性条件治疗的攻 击性皮肤病学治疗致使暂时敏感的皮肤的个体的化妆品护理和 / 或化妆品治疗。
     一般，敏感性皮肤定义为不再耐受或几乎不耐受攻击性物质，尤其是环境因素 如污染物、气候因素 ( 风、冷、热 )、暴露于 UV、情绪因素尤其是压力和 / 或化学物质 ( 重金属、去垢剂、包含于化妆品治疗的化合物如香料、防腐剂、醇、 pH 或 AHA、或如 维生素 A 酸的皮肤病学治疗 ) 和 / 或 攻击性条件尤其是出汗和机械攻击如拔毛、剃须和 摩擦。 敏感性皮肤或致使暂时敏感的皮肤不是具有病理特征的皮肤。 然而，它可以通过 不雅和 / 或不适的皮肤和 / 或黏膜现象如蛰刺、灼伤感觉、瘙痒感觉、绷紧、发红、可见 鳞片或皮肤增厚与攻击性物质反应。 因此， “敏感性皮肤” 的特征可以由个体自身用主 观皮肤感觉或由皮肤病学家用客观皮肤反应来估计。
     因此，本发明允许控制皮肤 DC 的激活和 / 或成熟水平以预防和 / 或降低敏感性 皮肤或致使暂时敏感、反应或反应过度的皮肤的提高的和 / 或过度的应答。
     根据一个实施变通方案，本发明涵盖活性成分在预防和 / 或治疗不雅和 / 或不适 的皮肤和 / 或黏膜现象中的化妆品用途。 因此，本发明的活性成分尤其适合用于化妆品 护理和 / 或化妆品治疗。 它们尤其是允许具有镇静剂和 / 或抗刺激素和 / 或保护效应的化 妆品组合物的制备，尤其是针对攻击性物质和 / 或攻击性条件的化妆品组合物的制备。
     因此，取决于相关个体的皮肤和 / 或黏膜的健康状态 ( 化妆品护理或治疗 ) 或病 理状态 ( 皮肤病学或药学护理或治疗 )，本发明涉及两类不同的护理和 / 或治疗。 根据另一个实施变通方案，本发明涵盖用于药物组合物尤其是皮肤病学组合物 的制备的活性成分，该组合物用于预防和 / 或治疗由免疫应答的激活引起的病状。
     在适合用于局部应用的化妆品载体中包含选自浓度在 0.001wt ％和 10wt ％之间 的 Phoradendron piperoides 植物提取物、 Cestrum latifolium 植物提取物、千日菊植物提取 物、浓度为 1×10-7％至 1％的一叶嵃碱、单叶芸香定丙酮化合物、8- 氧代假棕榈碱和其 任意组合的化妆品组合物也是本发明的主题。
     本发明还涉及预期用于提高免疫应答尤其是树突细胞的激活阈值，尤其是用于 预防和 / 或治疗皮肤和 / 或黏膜的反应性的药物和 / 或皮肤病学组合物，该组合物在适 合用于局部应用的药物和 / 或皮肤病学载体中包含选自 Phoradendron piperoides 植物提取 物、 Cestrum latifolium 植物提取物、千 日菊植物提取物、一叶嵃碱、单叶芸香定丙酮化 合物、8- 氧代假棕榈碱和其任意组合的活性成分。
     本发明还涉及至少一种活性成分在制备预期用于预防和 / 或治疗刺激或皮肤和 / 或黏膜变态反应尤其是接触性反应、迟发型接触性超敏反应、接触性湿疹、荨麻疹尤其 是接触性荨麻疹、接触刺激性或变应性皮炎和 / 或遗传过敏性皮炎的药物组合物，尤其 是皮肤病学组合物中的用途。
     有利地，本发明的至少一种活性成分用于还包含抗炎剂的药物组合物的制备。
     根据一个优选模式，病状是刺激或皮肤和 / 或黏膜变态反应，尤其是接触性反 应、迟发型接触性超敏反应、接触性湿疹，荨麻疹尤其是接触性荨麻疹、刺激性或变应 性接触性皮炎和 / 或遗传过敏性皮炎。 荨麻疹尤其是引起皮肤和 / 或黏膜现象的接触性 荨麻疹和 / 或饮食性荨麻疹。
     优选地，药物和 / 或皮肤病学组合物预期用于预防和 / 或治疗刺激或皮肤和 / 或 黏膜变态反应，尤其是接触性反应、迟发型接触性超敏反应、接触性湿疹、荨麻疹尤其 是接触性荨麻疹、刺激性或变应性接触性皮炎和 / 或遗传过敏性皮炎。
     皮肤和 / 或黏膜免疫应答的激活表征为至少一类免疫细胞尤其是树突细胞 (DC) 的激活，例如表皮朗格汉斯细胞 (LC) 和 / 或真皮树突细胞 (DDC) 的激活。
     皮 肤 DC 表 征 为 其 特 异 性 标 记， LC 和 DDC 分 别 特 异 地 表 达 langerine 和 DC-SIGN。
     未成熟的树突细胞由用激活和 / 或成熟物质尤其是 TNFα 和 / 或 LPS( 脂多糖 ) 型的激活和 / 或成熟物质激活前的基础表型状态定义。
     “激活的” 树突细胞由与用激活和 / 或成熟物质尤其是 TNFα 和 / 或 LPS 型的 激活和 / 或成熟物质诱导的状态相当的激活表型状态定义。
     激活和 / 或成熟物质 ( 即提高至少一种 DC 标记的表达的物质 ) 是 DC 的危险信 号，其触发免疫应答。 此物质是非限制性的。 这些物质尤其是使用或应用来提高至少一 种 DC 标记的表达的化学或生物物质，例如 LPS 或 TNFα、刺激皮肤的参数如气流、污染 物、低于 15℃或高于 40℃的温度。
     本发明尤其涉及哺乳动物，且尤其涉及人。
     本发明的活性成分是植物提取物或表征的分子。 该提取物有利地产生自选自 Phoradendron piperoides、 Cestrum latifolium、千日菊、 Maprouneaguyanensis 及其任意混 合物的植物。 优选的表征的分子选自一叶嵃碱、单叶芸香定丙酮化合物和 8- 氧代假棕榈 碱。 任意比例的两种或多种上述活性成分的混合物也被本发明涵盖。 根据一个尤其有利 的模式，活性成分是 Cestrum latifolium 植物提取物和 / 或一叶嵃碱。 按照本领域中的标准方法获得用于本发明的植物提取物。
     取决于植物，通过例如离析提取选自根、根茎、茎、树皮、花、果实、芽、种 子和叶的至少部分植物是有利的，该部分植物以 1％和 10％ (w/w) 之间在溶剂或溶剂混 合物中，优选极性质子溶剂，有利地在水、醇、乙二醇、多元醇、100/0 至 0/100(v/v) 的水 / 醇、水 / 乙二醇或水 / 多元醇混合物 ( 如水与乙醇、丙三醇、丁二醇或其他多元醇 类如木糖醇等混合 ) 中。 然后优选离心和 / 或过滤和 / 或蒸馏所获得的提取物以回收活 性可溶性级分 ( 粗提取物 )。
     优选将植物提取物溶解于溶剂中，如水、醇、多元醇、乙二醇或其混合物。 根 据本发明，优选以相对于组合物重量在 0.001wt ％和 10wt ％之间、有利地在 0.01wt ％和 5wt％之间和更尤其以 1wt％的浓度使用植物提取物。
     可以通过蒸发去除溶剂来浓缩活性物质，例如通过冷冻干燥或通过喷雾。
     通过溶解于极性溶剂例如水、乙醇、乙二醇或 DMSO 中来有利地制备表征的分 子 ( 活性成分 )。
     根据本发明，优选以相对于组合物总重量在 1×10-7wt％和 1wt％之间、有利地 在 1×10-5wt％和 1×10-1wt％之间和尤其是 1×10-1wt％的浓度使用表征的分子。
     优选地，组合物是优选局部地应用的化妆品或药物组合物，尤其是皮肤病学组 合物。
     例如，在最终化妆品制剂中活性成分 0.5％至 10％的比率和每平方厘米皮肤 1mg 完成的化妆品产品的应用比率下，每平方厘米皮肤应用的活性成分的量有利地在 10-13g 和 10-12g 表征的分子之间和在 10-5g 和 10-4g 植物来源的活性成分 ( 溶剂中 0.001wt％和 10wt％ 之间的植物提取物 ) 之间。
     优选以化妆品或药物组合物且优选皮肤病学组合物的形式使用本发明的化合物。 组合物可以包含可选地与其他目的化合物组合的任意适合的溶剂和 / 或任意适 合的载体和 / 或任意适合的赋形剂。
     结果，对于这些化合物，赋形剂包含例如至少一种选自以下的化合物 ：防 腐剂、润滑剂、乳化剂、表面活性剂、湿润剂、增稠剂、调节剂、控油剂 (mattifying agent)、 稳 定 剂、 抗 氧 化 剂、 组 织 形 成 剂 (texturing agent)、 光 泽 剂、 成 膜 剂、 增 溶 剂、色素、染料、香料和遮光剂。 这些赋形剂优选选自氨基酸及其衍生物、聚甘油、 酯类、纤维素聚合物和衍生物、羊毛脂衍生物、磷脂类、乳铁蛋白、乳过氧化物酶、 基于蔗糖的稳定剂、维生素 E 及其衍生物、天然和合成蜡、植物油、甘油三酯、不皂 化材料、植物甾醇、植物酯、聚硅氧烷及其衍生物、蛋白质水解物、霍霍巴油 (jojoba oil) 及其衍生物、脂 / 水溶性酯、甜菜碱、氧化胺、植物提取物、蔗糖酯、二氧化钛、 甘氨酸和对羟基苯甲酸类，更优选选自丁二醇、硬脂醇聚醚 -2(steareth-2)、硬脂醇聚 醚 -21(steareth-21)、乙二醇 -15 硬脂醚、鲸蜡硬脂醇 (cetearyl alcohol)、苯氧乙醇、对羟 基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、丁二醇、 天然生育酚、甘油、二羟十六烷基磷酸钠 (dihydroxycetyl sodium phosphate)、异丙基羟 十六醚 (isopropyl hydroxycetyl ether)、硬脂酸乙二醇酯、三异壬精 (triisononanoin)、椰 油酸辛酯 (octyl cocoate)、聚丙烯酰胺、异链烷烃、聚乙二醇单十二醚 -7(laureth-7)、卡 波姆 (carbomer)、丙二醇、丙三醇、红没药醇、二甲基硅氧烷、氢氧化钠、 PEG-30 二聚 羟基硬脂酸酯、癸酸 / 辛酸甘油三酯、鲸蜡硬脂醇辛酸酯 (cetearyl octanoate)、己二酸二 丁酯、 葡萄籽油、霍霍巴油、硫酸镁、 EDTA、环甲基硅氧烷、黄原胶、柠檬酸、十二 烷基硫酸钠、石蜡和矿物油、异硬脂醇异硬脂酸酯、丙二醇二壬酸酯、丙二醇异硬脂酸 酯、 PEG-8、蜂蜡、氢化棕榈仁油甘油酯、氢化棕榈油甘油酯、羊毛脂油、芝麻油、乳 酸十六酯、羊毛脂醇、蓖麻油、二氧化钛、乳糖、蔗糖、低密度聚乙烯和等渗盐溶液。
     有利地，以选自以下的形式配制上述组合物 ：水性或油性溶液、水性凝胶或霜 剂或油性凝胶，尤其是在瓶或管中，尤其是沐浴凝胶或洗发剂 ；乳 ；乳状液、微乳或纳 乳 (nanoemulsion)，尤其是基于水包油或油包水或多重或聚硅氧烷 ；洗剂，尤其是在玻 璃瓶、塑料瓶或剂量计量瓶中或作为气溶胶 ；安瓿剂 ；液体皂 ；皮肤病学条 ；软膏剂 ； 摩丝 ；无水产品，其优选是液体、糊剂或固体，例如棒的形式，尤其是唇膏或片剂的形 式 ；凝胶胶囊 ；糖浆 ；颗粒体 ；粉末。
     本文所用的术语 “局部应用” 指将本发明的组合物应用于皮肤和 / 或黏膜表 面，尤其是通过直接应用或通过蒸发应用于皮肤和 / 或黏膜表面。
     本发明还涵盖口服施用，尤其是保健品应用。
     本文所用的术语 “适合的化妆品或皮肤病学载体” 指该组合物或其成分适合用 于与人皮肤接触使用而不具有任意过度的毒性、不相容性、不稳定性、变应性应答或其 等同物。
     本领域技术人员已知许多用于改善皮肤的健康和 / 或物理状态的化妆品活性成 分。 本领域技术人员知道如何配制化妆品和 / 或皮肤病学组合物以获得最佳效应。 此 外，当将它们彼此组合时，本发明中所描述的化合物可以具有协同效应。 这些组合也包
     含于本发明。 The CTFA CosmeticIngredient Handbook，第二版 (1992) 描述了尤其适合用 于局部使用的通常用于化妆品和药物工业的多种化妆品和药物成分。 这些类型的活性成 分的实例包含但不限于以下化合物 ：研磨剂、吸收剂、用于美容目的的化合物如香料、 色素、染料、精油、收敛剂等 ( 例如丁香油、薄荷醇、樟脑、桉树油、丁子香酚、乳酸 薄荷酯、hamelis 馏出物 )、防痤疮剂、防絮凝剂、防沫剂、抗微生物剂 ( 例如丁基氨基甲 酸碘丙酯 )、抗氧化剂、粘合剂、生 物添加剂、缓冲剂、溶胀剂、螯合剂、添加剂、杀 虫剂、变性剂、增稠剂、和维生素及其衍生物或等同物、成膜材料、聚合物、遮光剂、 pH 调节剂、还原剂、消色剂或浅色剂 (lighting agent)( 例如氢醌、曲酸、抗坏血酸、抗坏 血酸磷酸酯镁或抗坏血酸葡糖胺 ) 和调节剂 ( 例如湿润剂 )。
     具体而言，为了尽可能充分地改善皮肤的敏感性状态，根据本发明将本发明的 活性成分与选自已知其特性的表征的分子和植物提取物的一种或多种其他活性剂组合尤 其有利 ：
     - 神经化妆品，
     - 外用止痛药，
     - 皮肤镇静剂，尤其是 PLA2 抑制剂、细菌来源的外泌多糖，尤其是化妆品镇 静剂如描述于专利 EP 0987010 中的欧洲七叶树 (Aesculushippocastanum) 提取物 (CAS 8053392)、交替单孢菌属 (Alteromonas) 发酵提取物、描述于专利 FR2847267 中并被申请 人以 InhipaseTM 的名称推向市场的活性成分尤其是野葛 (Pueraria lobata) 根提取物。 - 创伤愈合剂，如泛醇及其衍生物例如乙基泛醇、芦荟 (Aloe vera)、泛酸及其衍 生物、尿囊素、红没药醇和甘草酸二钾。
     - 抗炎剂，如类固醇和非类固醇抗炎药，尤其是细胞因子和趋化因子、环加氧 酶、氧化氮 (NO) 和 NOS 氧化氮合酶的产生的抑制剂。 可以提及的抗炎产品的实例包含 银杏 (Gingko biloba) 提取物、三内酯萜类 (trilactoneterpenes) 如银杏苦内酯 (gingkolide)， 尤其是已知其对血小板活化因子 (PAF) 的拮抗特性的银杏苦内酯 B 和白果内酯。
     - 弹性蛋白酶抑制剂，如 Haslea ostrearia 提取物，例如由申请人推向市场的 Blue algae extractTM。
     - 保湿和 / 或抗炎剂，如 Palmaria palmate 提取物，例如由申请人推向市场的 Sea TM Parsley 产品。
     本发明还涉及包含与其他活性成分组合的本发明的活性成分的化妆品组合物， 已知该其他活性成分用于敏感性皮肤或致使暂时敏感、反应和 / 或反应过度的皮肤的化 妆品护理和 / 或治疗。
     本发明涵盖药物治疗方法，其包括尤其是通过局部应用对有需要的个体施用用 于上文所列的多种治疗的活性剂。
     本发明还涉及用于筛选这些活性成分的方法。
     根据一个变通方案，本发明涉及用于筛选能够提高皮肤和 / 或黏膜树突细胞免 疫应答的激活阈值的活性成分的方法，所述方法包括 ：
     (i) 制备包含未成熟或未激活的树突细胞 (DC) 的培养基 ；
     (ii) 将包含 DC 的培养基置于与待针对其提高皮肤树突细胞免疫应答的激活阈值 的能力筛选的至少一种物质接触 ；
     (iii) 回收 DC 以定量 DC 激活标记的表达 ；
     (iv) 相对于用阳性对照如类固醇抗炎剂优选地塞米松获得的 DC 激活标记表达 值，比较已置于与待筛选物质接触的 DC 的激活标记表达值，以选择提高皮肤和 / 或黏膜 树突细胞免疫应答的激活阈值的活性成分。
     根据另一个变通方案，本发明涉及用于筛选能够提高皮肤和 / 或黏膜树突细胞 免疫应答的激活阈值的活性成分的方法，所述方法包括 ：
     (i) 制备包含未成熟或未激活的树突细胞 (DC) 的培养基 ；
     (ii) 将包含 DC 的培养基置于与待针对其提高皮肤树突细胞免疫应答的激活阈值 的能力筛选的至少一种物质和已知用于通过提高至少一种 DC 标记的表达来激活免疫应答 的至少一种物质接触 ；
     (iii) 回收 DC 以定量用待筛选物质或活性成分处理和用所述物质刺激后 DC 激活 标记的表达 ；
     (iv) 相对于用阳性对照如类固醇抗炎剂优选地塞米松获得的 DC 激活标记表达 值，比较已置于与待筛选物质和所述物质接触的 DC 的激活标记表达值，以选择在所述物 质存在的情况下提高皮肤和 / 或黏膜树突细胞免疫应答的激活阈值的活性成分。 用于提高至少一种 DC 标记的表达的物质可以是已知用于刺激免疫细胞的应答的 物质，如 LPS 和 TNFα 的混合物。
     有利地，该方法还包括 ：
     (iiib) 将步骤 (iii) 中回收的一些 DC 再培养足以使这些细胞恢复其 基础激活水平 的时间，所述培养基不包含待筛选的任意活性成分或物质 ；
     (ivb) 步骤 (iiib) 之后定量 DC 激活标记的表达，以选择提高皮肤树突细胞免疫应 答的激活阈值和允许步骤 (iiib) 之后激活免疫应答的活性成分。 待针对其提高皮肤树突 细胞免疫应答的激活阈值的能力筛选的物质是例如希望定量其抑制 DC 激活标记表达的能 力的植物来源的物质或表征的分子的物质。
     表征的分子是已知其化学结构的分子。
     DC 激活标记优选选自 CD40、 CD54、 CD80、 CD86、 HLA-DR、 CCR7，其是 MIP-3β( 巨噬细胞炎性蛋白 -3β) 趋化因子受体。
     DC 成熟标记优选选自 CD83 和 DC LAMP。
     可以使用任意方法来定量 DC 激活标记的表达。 可以有利地使用 RT-PCR 尤其 是定量 RT-PCR 或流式细胞术或 ELISA 的方法。
     因此 DC 激活标记的表达涉及 DC 激活标记的蛋白质表达和 DC 激活标记的基因 表达 (mRNA) 二者。
     用阳性对照和阴性对照来进行相对于对照的用于选择活性成分的 DC 激活标记表 达值的比较，优选该阳性对照和阴性对照是激活和 / 或成熟剂例如 LPS/TNFα 混合物和 免疫抑制剂例如地塞米松。
     有利地，当其使得可能按照该筛选方法获得 LC 或 DDC 所表达的 CD86 的蛋白 质表达低于或等于有或无由 LPS 50μg/mL 和 TNFα10ng/mL 组成的激活剂存在的情况下 LC 或 DDC 所表达的 CD86 蛋白质表达的 95％且优选低于 70％，和 / 或 LC 或 DDC 所表 达的 CD86 的基因表达低于或等于有或无由 LPS 50μg/mL 和 TNFα10ng/mL 组成的激活
     剂存在的情况下 LC 或 DDC 所表达的 CD86 基因表达的 95％且优选低于 75％时，认为所 筛选的物质是活性成分或活性物质。
     根据其他实施方案，本发明涉及本发明的活性成分与刺激剂或潜在的刺激剂组 合的局部用途，优选非治疗性用途。
     本发明还涉及预期与皮肤和 / 或黏膜接触的包含本发明的活性成分和刺激剂的 组合物。 刺激剂可以是例如去垢剂，接触攻击剂，防腐剂尤其是 乙二醇衍生物尤其是 戊二醇衍生物，化妆品刺激剂如 AHA 尤其是乙醇酸、乳酸及其衍生物，如视黄醇及类 视黄醇衍生物，尤其是视黄醛、视黄酸，如水杨酸，和 / 或与在限制条件下允许的 EEC Directive 76/768 中所列的一种或几种成分组合于化妆品组合物中，尤其是 Annex 3 中所列 的成分。
     根据其他实施方案，本发明的活性成分可以用于日常化妆品护理组合物。 因此 本发明涉及化妆品护理和 / 或治疗方法，其中至少一种本发明的活性成分优选 Cestrum latifolium 提取物可能与化妆品刺激剂组合每天以有效剂量在皮肤和 / 或黏膜上应用。
     通过阅读参考了实施例的解释性描述，本发明的其他目的、特征和优势将清楚 地呈现给本领域技术人员，所述实施例是为了纯说明性目的而给出，不应以任意方式认 为其限制本发明的范围。 实施例形成本发明的整体部分，来自其 ( 包含实施例 ) 的整体中取出的描述的任 意相对于现有技术表现为新颖的特征以其功能和其一般性形成本发明的整体部分。
     因此，每一实施例具有一般范围。
     此外，在实施例中，除非另作指定，所有百分数以重量计，除非另作指定，温 度表示为摄氏度数，除非另作指定，压力是大气压。
    实施例
    
    
    
    实施例 1 ：皮肤树突细胞 LC 和 DDC 的制备 在两个连续步骤中进行从血单核细胞制备 LC 和 DDC 的方法。 步骤 1 ：从循环外周血分离单核细胞的方法 在有抗凝剂优选肝素锂存在的情况下收集一个或多个人供体的循环静脉外周血。 可以有利地按照以下流程进行单核细胞从循环血的分离 ：
     1/ 在淋巴细胞分离培养基上离心血液后，回收单核细胞，然后 ：
     - 或 者 用 抗 体 混 合 物 例 如 偶 联 至 磁 珠 的 抗 -CD3、 抗 -CD7、 抗 -CD16、 抗 CD19、抗 CD56、抗 CD123、抗 - 血型糖蛋白 A 抗体标记。 穿过磁化 柱后，仅洗脱和回 收未标记的单核细胞。
     - 或者用对单核细胞特异的抗体，如偶联至磁珠的抗 -CD14 抗体标记。 穿过磁 化柱后，仅标记的单核细胞滞留在柱中。 洗脱柱后，回收标记的单核细胞。
     - 或者用对单核细胞特异的抗体如偶联至荧光染料如澡红蛋白的抗 -CD16 抗体 标记。 通过流式细胞术分选细胞后，仅回收标记的单核细胞。
     2/ 通过进行本领域技术人员公知的任意物理分离方法，尤其是通过沉淀或离心 回收单核细胞，并在不为随后的培养进一步加工的情况下洗脱。
     3/ 每 100mL 所收集的血液的提取收率是约 150 兆 (million)(±20 兆 ) 单核细胞， 从其中获得至多 40 兆单核细胞。
     步骤 2 ：冻存来自循环外周血的单核细胞的方法
     可以有利地在 -80℃至 -196℃，优选在液氮中于 -196℃、以约 10 兆 /mL 的比 率、在适合的冻存培养基例如由 90％胎牛血清和 10％ DMSO( 二甲基亚砜 ) 组成的培养 基中冻存步骤 1 中获得的单核细胞。
     该冻存步骤有利地允许供体库例如 3 个单核细胞供体的细胞混合物的制备。
     步骤 3 ：培养分离的单核细胞以获得未成熟的 LC 和 DDC 的方法
     按约 1 兆 /mL 的比率在确定或不确定的培养基中培养 (37℃、5％ CO2) 步骤 1 和 / 或 2 中获得的单核细胞，优选在补充 10％胎牛血清并包含以下三种细胞因子的 RPMI 1640 培养基中 ：GM-CSF( 粒细胞 - 巨噬细胞集落刺激因子，比率为 200ng/mL)、比率为 10ng/mL 的 TGFβ1( 转化生长因子 β1) 和比率为 10ng/mL 的 IL-13( 白细胞介素 13)。
     在培养的第 6 天，未成熟的 LC 和 DDC 同时产生，且在表型上和功能上非常类 似于其体内相应物 ：
     - 体 外 产 生 的 树 突 细 胞 的 至 多 40 ％ 在 胞 内 表 达 langerine， 至 多 60 ％ 表 达 DC-SIGN。
     - 体外产生的 LC 和 DDC 是未成熟的，因为它们按基础水平表达共刺激分子 CD80 和 D86，且不表达成熟分子 CD83 和 DC-LAMP。
     - 用 TNFα( 有利地为 10ng/mL) 和 LPS( 有利地为 50μg/mL) 刺激 48 小时后， 如由分子 CD80 和 CD86 表达的提高和由成熟标记 CD83 和 DC-LAMP 表达的获得所表 明， LC 和 DDC 获得激活和成熟的 DC 的表型。
     步骤 4 ：培养分离的单核细胞以获得激活的 LC 和 DDC 的方法
     按实施例 1 和步骤 3 中所述，但在存在以下三种细胞因子的情况下培养细胞 ：比 率为 200ng/mL 的 GB-CSF、比率为 10ng/mL 的 TGFβ1 和比率为 10ng/mL 的 TNFα。
     孵育 24 小时后，激活的 LC 和 DDC 同时产生，且在表型上和功能上非常类似于 其体内相应物。
     -LC 和 DDC 显示以下分子的强表达 ：HLA-DR，其是 II 类 MHC 分子 ；CD80 和 CD86，其是共刺激分子 ；和 CCR7，其是迁移受体。
     -LC 和 DDC 还显示应答趋化因子 MIP-3β 的高迁移能力。
     实施例 2 ：化妆品活性成分的制备
     活性成分具有不同的来源 ( 例如植物来源或表征的分子 )。
     取决于植物，通过例如离析提取选自根、根茎、茎、树皮、花、果实、芽、种 子和叶的至少部分植物是有利的，该部分植物以 1％和 10％ (w/w) 之间在溶剂或溶剂混 合物中，优选极性质子溶剂，且有利地在水、醇、乙二醇、多元醇、100/0 至 0/100(v/ v) 的水 / 醇、水 / 乙二醇或水 / 多元醇混合物 ( 如水与乙醇、丙三醇、丁二醇或其他多元 醇类如木糖醇等混合 ) 中。 然后优选离心和 / 或过滤和 / 或蒸馏所获得的提取物以回收 活性可溶性级分 ( 粗提取物 )。 活性物质有利地是在溶剂如水、醇、多元醇、乙二醇或其 混合物中且优选在水中的植物提取物。 优选在 0.001％和 10％ (v/v) 之间，有利地是粗提 取物的重量相对于活性成分的总重量在 0.01％和 5％之间和更尤其是 1wt％的浓度将溶解在溶剂中的粗提取物 ( 活性成分 ) 用来进行测试。 可以通过蒸发去除溶剂来浓缩活性成 分，例如通过冷冻干燥或通过喷雾。
     通过溶解在溶剂例如水、乙醇、乙二醇中或优选溶解在 DMSO 中制备 表征的分 子，并优选在 1×10-7wt％和 1wt％之间，有利地在 1×10-5wt％和 1×10-1wt％，且尤其是 在 1×10-1wt％的活性成分浓度测试。
     实施例 3 ：用于筛选化妆品活性成分的模型
     在按照实施例 1 获得的 LC/DDC 上测试活性成分。 当在实施例 1 的步骤 3 中获 得的 “未成熟的” LC/DDC 上测试活性成分时，这称为预防性护理。 当在实施例 1 的步 骤 4 中获得的 “激活的” LC/DDC 上测试活性成分时，这称为治疗性护理。
     例如按 400000 细胞 /cm2 的比率，在确定或不确定的培养基中，优选在补充 10％ 胎牛血清和包含以下两种细胞因子的 RPMI 1640 培养基中将细胞接种至 24 孔板内 ：比率 为 200ng/mL 的 GM-CSF 和比率为 10ng/mL 的 TGFβ1。 然后将活性成分加至所述培养 基并用以下终浓度测试 ：
     - 对于植物提取物，活性成分相对于培养基的总重量在 0.001％和 10％ (v/v) 之 间，有利地在 0.01wt％和 5wt％之间和尤其是在 1wt％ ；
     - 对 于 表 征 的 分 子， 表 征 的 分 子 ( 或 化 学 分 子 ) 相 对 于 培 养 基 的 总 重 量 在 -7 1×10 ％ 和 1 ％ (v/v) 之 间， 有 利 地 在 1×10-5wt ％ 和 1×10-1wt ％ 之 间， 且 尤 其 是 在 1×10-1wt％。
     于 37℃在 5％ CO2 下在所述培养基中孵育活性成分至多 48 小时且有利地孵育 24 小时。
     阴性对照是仅培养基，或包含浓度与所测试的活性剂的浓度相等的提取所测试 的提取物的过程中使用的溶剂的培养基，或包含主要的抗炎糖皮质激素地塞米松 (10-8M) 的培养基。 用来诱导 LC/DDC 激活的参考阳性对照是 LPS( 有利地在 50μg/mL) 和 TNFα( 有利地在 10ng/mL) 的混合物。
     实施例 4 ：所选择的具有免疫抑制剂能力的活性成分
     我们选择了 3 种表征的分子 ( 一叶嵃碱、单叶芸香定丙酮化合物、8- 氧代假 棕榈碱 ) 以及 4 种植物提取物 (Cestrum latifolium、 Phoradendron piperoides、 Maprounea guyanensis 和千日菊 )，其分别表示在表 1 和 2 中。
    表征的分子 CAS 编号 一叶嵃碱 5610-40-2 单叶芸香定丙酮化合物 nd 8- 氧代假棕榈碱 10211-78-6
     表 1 ：本发明中所选择的表征的分子
    化学式 C13H15NO2 C21H21NO5 C19H25NO5摩尔质量 217.27g.mol-1 367.40g.mol-1 347.41g.mol-1
    植物提取物 Cestrum latifolium Phoradendron piperoides Maprounea guyanensis 千日菊 表 2 ：本发明中所选择的植物提取物14植物的部分 气生部分 气生部分 叶 叶CN 102026616 A CN 102026631 A
    说明书12/26 页实施例 5 ：化妆品活性成分的细胞毒性测试
     对于所测试的每一活性剂，为了显示该活性剂对细胞没有细胞毒效应和该活性 剂的效应不是与由该活性成分诱导的死亡率相关的细胞应激的结果，在细胞上进行细胞 生存力测试。 当用所述活性剂处理后细胞生存力低于 75％时，该活性成分具有细胞毒效 应。
     按 200000 细胞 / 孔的比率，在实施例 3 中所述的培养基中将实施例 1 和步骤 3 中所述的 LC/DDC 接种至 P96 孔板内。 用活性成分处理细胞描述于实施例 3 中。
     用 所 述 活 性 成 分 处 理 后， 每 孔 用 5μl 染 料 7-AAD(7- 氨 基 放 线 菌 素 D(7-aminoactinomycin D)) 孵育细胞。 孵育 5 分钟后，通过流式细胞术分析细胞。
     细胞生存力表示为活细胞或染料未穿透不渗透的膜的阴性 7-AAD 的百分数。 此 分析技术还使得可能使用 7-AAD 阳性标记的细胞可见，即已通过活性剂经受细胞毒效应 的细胞。
     阴性对照或者是仅培养基，或者是包含浓度与所测试的活性成分的该浓度相等 的提取所测试的提取物的过程中使用的溶剂的培养基。 用来诱导 LC/DDC 的死亡率的参 考阳性对照是终浓度为 4μM 的喜树碱。
    
    表 3 显示本发明中所选择的活性成分的细胞生存力研究的结果。表 3 ：用所选择的活性成分处理后未成熟的 LC/DDC 的细胞生存力的研究。
     结论 ：
     表 3 中所述的化妆品活性成分显示对 LC/DDC 无细胞毒效应。 用所述活性成分 处理后 LC/DDC 的细胞生存力接近 100％。
     实施例 6 ：化妆品活性成分的免疫抑制特性的分析 -CD86 分子蛋白质表达的研 究
    活性成分的免疫抑制剂潜能的评估需要用所述活性成分处理的 LC/DDC 的激活 分子 ( 例如共刺激分子 CD86) 表达的研究。
     流式细胞术使得可能定量用所述活性剂处理或未处理的 LC/DDC 细胞膜上 CD86 的蛋白质表达。
     按以下方式通过流式细胞术进行化妆品活性成分的免疫抑制特性研究 ：
     1/ 按实施例 1 和步骤 3 中所述产生未成熟的 LC/DDC。
     2/ 按 400000 细胞 /cm2 的比率和在实施例 3 中所述的培养基中将细胞接种至 P24 孔板内。 用活性成分处理细胞描述于实施例 3 中。 平行地，用降低剂量的活性成分处 理细胞以建立剂量 / 效应相关 ：对于表征的分子，从 10-6M 至 5×10-8M ；对于植物提取 物，从 0.1％至 0.005％。
     3/ 用活性成分处理后，回收细胞，然后按 200000 细胞 /50μl/ 孔的比率在标记 培养基 (30％ RPMI、68％ PBS 和 2％ FCS) 中于 P96 孔板内孵育。
     4/ 然后将细胞与偶联至荧光染料如澡红蛋白的抗 -CD86 单克隆抗体 ( 有利地为 10μl 抗 -CD86 抗体 / 孔 ) 孵育 30 分钟。 阴性标记对照对应于 IgG1 对照同种型。 此标 记步骤之后，用所述标记缓冲液漂洗细胞，然后通过流式细胞术分析。
     5/ 表 4 显示所选择的活性成分的免疫抑制特性分析的结果。 按以下方式表示结 果 ：未用活性剂处理的对照称为 CD86 分子的 100％表达，测试表示为用活性成分处理后 的 CD86 分子的残留表达 ( 以百分数表示 )。 阴性对照对应于用具有诱导 CD86 表达的特 性的地塞米松处理的细胞。 还计算了免疫抑制的水平，其与 CD86 的残留表达成反比。
    表 4 ：在未成熟的 LC/DDC 上测试的活性成分的免疫抑制特性。
     结论 ：
     表 4 中所述的活性成分具有降低共刺激分子 CD86 的蛋白质表达的能力。 因此 所述活性成分具有提高 LC/DDC 的激活阈值的能力。 换言之，免疫抑制的水平越高和越 接近于 1，活性剂的免疫抑制力越高。
    
    
    
    表 5 ：在未成熟的 LC/DDC 上测试的活性成分的剂量 / 效应研究。表 6 ：在未成熟的 LC/DDC 上测试的活性成分的剂量 / 效应研究。
     结论 ：
     表 5 和 6 中所述的活性成分具有依赖于其终浓度的免疫抑制特性。
     实施例 7 ：化妆品活性成分的免疫抑制特性分析
     编码 CD86 分子的信使 RNA 的表达研究
     定量 RT-PCR 使得可能定量用所述活性剂处理或未处理的 LC/DDC 中编码蛋白 质 CD86 的信使 RNA 的表达。
     按以下方式通过定量 RT-PCR 进行化妆品活性成分的免疫抑制特性研究 ：
     1/ 按实施例 1 和步骤 3 中所述产生未成熟的 LC/DDC。
     2/ 按 400000 细胞 /cm2 的比率和在实施例 3 中所述的培养基中将细胞接种至 P24 孔板内。 用活性成分处理细胞描述于实施例 3 中。
     3/ 用活性成分处理后，回收细胞，并在用 pH 7.4 的磷酸盐缓冲液漂洗后通过例 如于 -80℃干燥冷冻来保存。
     4/ 例如用 96 孔提取试剂盒在二氧化硅柱上提取细胞的总 RNA，并在 96 孔分光 光度计上于 260nm 测定 ( 纯度指示 ：于 280nm 的蛋白质测定 )。 将 RNA 稀释至例如 5ng/ μl。
     5/ 例如在 50ng 初始 RNA 上在 96 孔板上对肌动蛋白和 CD86 分子的基因进行第 一步中的定性 RT-PCR。 每一基因的特异性引物指定于以下表 7 中并按例如 0.5μM 使 用。
    
    
    用于所研究的基因的特异性引物 肌动蛋白正义 (SEQ ID NO 1)GTGGGGCGCCCCAGGCACCA肌动蛋白反义 (SEQ ID NO2)CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC
     CD86 正义 (SEQ ID NO3)CTCTTTGTGATGGCCTTCCTGC
     CD86 反义 (SEQ ID NO4)CCTGTGGGCTTTTTGTGATGGA
     扩增参数有利地为以下 ：在进行扩增循环的 Opticon 循环变温器中用 Quanti Tect SYBR Green RT-PCR 试剂盒 (Qiagen，France) 在包含信使 RNA 的孔上进行实时 RT-PCR 技术。 反转录 (RT) 于 50℃进行 30 分钟，然后 95℃进行 15 分钟以抑制反转录酶、激活 聚合酶和变性所获得的互补 DNA(cDNA)。 进行 50 个循环的链聚合 (PCR)(95℃ 15 秒， 60℃ 30 秒，72℃ 30 秒 )。 在每一循环的终点读取荧光，其与扩增片段的数量成正比。 表达水平由每一基因的表达相对于肌动蛋白的比率定义。
     6/ 表 8 显示所选择的活性成分的免疫抑制特性分析的结果。 按以下方式表示结 果 ：未处理的对照称为编码 CD86 分子的信使 RNA 的 100％表达，测试表示为作为相对 于用阴性对照获得的表达水平，编码 CD86 的信使 RNA 的表达水平的改变百分数。
    表 7 ：在未成熟的 LC/DDC 上测试的活性成分的免疫抑制特性。
     结论 ：
     表 7 中所述的活性成分具有降低编码共刺激分子 CD86 的信使 RNA 的表达的能 力。 因此所述活性成分具有提高 LC/DDC 的激活阈值的能力。 换言之，免疫抑制的水 平越高和越接近于 1，活性物质的免疫抑制力越高。
     实施例 8 ：免疫抑制活性成分处理的 LC/DDC 应答危险信号的能力的研究
     活性成分的免疫抑制潜能的评估也需要用所述活性成分处理时 LC/DDC 应答危 险信号例如细菌感染的能力的研究。 具体而言，我们检验了同时用活性成分处理和通过 危险信号激活的 LC/DDC 仍然具有其识别危险信号的功能。 为此，我们检验了同时用活 性成分处理，和用 LPS 和 TNFα 刺激的 LD/DDC 能够在此刺激后过量表达共刺激分子 CD86。
     按以下方式进行流式细胞术研究 ：
     1/ 按实施例 1 和步骤 3 中所述产生未成熟的 LC/DDC。
     2/ 按 400000 细胞 /cm2 的比率和在实施例 3 中所述的培养基中将细胞接种至 P24 孔板内。 将 LPS( 有利地按 50μg/mL) 和 TNFα( 有利地按 10μg/mL) 的混合物加至所 述培养基。 同时，按实施例 3 中所述用活性成分处理细胞。
     3/ 按实施例 6 中所述，通过流式细胞术分析已同时用活性成分处理，和用 LPS 和 TNFα 刺激的细胞，以定量 “处理 + 刺激” 后 CD86 分子的残留表达。
     4/ 表 9 显示同时用所选择的活性成分处理的 LD/DDC 应答危险信号的能力分 析的结果。 按以下方式表示结果 ：未用活性剂处理和未用 LPS+TNFα 刺激的对照称为 CD86 分子的 100％表达，测试表示为 “处理” 后、 “处理 + 刺激” 和 “刺激” 后 CD86 分子的残留表达。 我们还计算了应答危险信号的能力水平，其与处理 + 刺激后的 CD86 残留表达成正比。
    表 8 ：同时用 LPS+TNFα 刺激，和用所选择的活性成分处理的 LC/DDC 应答危 险信号的能力的研究。
     结论 ：
     如由处理 + 刺激后共刺激分子 CD86 的残留表达所表明，同时用活性成分处理和 用 TNFα/LPS 刺激的 LC/DDC 具有应答危险信号的能力。 因此细胞具有接近于其基础 状态的应答危险信号的能力。
     实施例 9 ：免疫抑制剂活性成分处理后 LC/DDC 应答危险信号的能力的研究
     如在实施例 8 中，我们检验了当已预先用活性成分处理且不再处于处理中时 LC/
     DDC 能够应答危险信号例如细菌感染。 为此，我们检验了用所述活性成分处理且然后用 LPS 和 TNFα( 在不存在活性成分的情况下 ) 刺激的 LC/DDC 能够在此刺激后过量表达共 刺激分子 CD86。
     按以下方式进行流式细胞术研究 ：
     1/ 按实施例 1 和步骤 3 中所述产生未成熟的 LC/DDC。
     2/ 按 400000 细胞 /cm2 的比率和在实施例 3 中所述的培养基中将细胞接种至 P24 孔板内。 用活性成分处理细胞描述于实施例 3 中。
     3/ 在无活性成分的情况下和在实施例 3 中所述的培养基中将用活性成分处理的 细胞再培养 48 小时。 将 LPS( 有利地按 50μg/mL) 和 TNFα( 有利地按 10μg/mL) 的混 合物加至所述培养基。 然后按实施例 6 中所述，通过流式细胞术分析细胞，以定量 “预 处理 + 刺激” 后 CD86 分子的残留表达。
     4/ 表 10 显示预先用所选择的活性成分处理且不再处于处理中的 LD/DDC 应答危 险信号的能力的分析结果。 按以下方式表示结果 ：未用活性剂处理和未用 LPS 和 TNFα 刺激的对照称为处于 CD86 分子的 100％表达，测试表示为 “刺激” 后和 “预处理 + 刺 激” 后 CD86 分子的残留表达。 我们还计算了应答危险信号的能力水平，其与预处理 + 刺激后 CD86 的残留表达成正比。
    表 9 ：用所选择的活性成分预处理且然后用 LPS+TNFα 刺激的 LC/DDC 应答危 险信号的能力的研究。
     结论 ：
     如由预处理 + 刺激后共刺激分子 CD86 的残留表达所表明，用活性成分预处理且 然后用 TNFα/LPS 刺激的 LC/DDC 具有应答此危险信号的能力。 因此细胞具有接近于 其基础状态的应答危险信号的能力。
     实施例 10 ：本发明的产品在水包油型乳状液类型的化妆品或药物制剂中的用途
     制剂 10a ：
    
    
    制剂 10b ：
    
    制剂 10c ：
    
    实施例 11 ：本发明的产品在油包水类型的制剂中的用途
    
    实施例 12 ：本发明的产品在洗发剂或沐浴凝胶类型的制剂中的用途
    
    实施例 13 ：本发明的产品在唇膏型制剂和其他无水产品中的用途
    
    实施例 14 ：本发明的产品在含水凝胶制剂 ( 眼部紧致、减肥等 ) 中的用途
    
    
    实施例 15 ：本发明的产品在三重乳状液类型的制剂中的用途 初级乳状液 W1/O ：
    
    二级乳状液 W1/O/W2 ：
    
    
    实施例 16 ：包含本发明的产品的药物制剂的制备 制剂 16a ：片剂的制备
    
    制剂 16b ：软膏剂的制备
    
    制剂 16c ：可注射制剂的制备29CN 102026616 A CN 102026631 A
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