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一种 rRNA 嵌合启动子及含有该嵌合启动子的表达载体
    技术领域 本发明属于分子生物学领域， 涉及一种 rRNA 嵌合启动子及含有该嵌合启动子的 表达载体， 特别涉及一种含 DNA 环调控元件的 rRNA rrnB P1 嵌合启动子， 及含有该嵌合启 动子的表达载体。
     背景技术
     在大肠杆菌中， 核糖体的数量是由染色体上七个拷贝的 rRNA 操纵元的转录水平 控制的。当大肠杆菌代时是 20 min 时， 每个细胞中的核糖体数量约有 7 万个， 当生长速率 较慢时， 每个细胞中也大约有 2 万个。核糖体在细胞中如此巨大的数量说明了 rRNA 操纵元 启动子的超强能力。
     E.coli rRNA 操纵元中的启动子 P1 是由包括 -10 区和 -35 区的核心启动子、 位 于 -35 区上游的富含 AT 碱基的 UP 元件和位于 UP 元件上游的 3 到 5 个转录因子 (Fis) 的 结合位点组成的。尽管已经证明 rRNA 启动子 P1 具有超强能力， 但它仍未被用于 E.coli 进 行高水平表达， 其主要原因是， rRNA 的体内合成从属于细胞生长速度的控制。在细胞快速 增殖期， P1 是活化的， 当细胞处于生长的静息期， 则 P1 被负调节。所以， rRNA 启动子在前诱 导期将持续活化， 故难以对其进行调控。因此， 实现 rRNA 启动子 P1 的可调控将对外源基因 进行高水平表达具有重要的意义。
     在目前常用的表达载体中， 使用的大部分大肠杆菌启动子均来自相应操纵元， 它 们都带有可与阻遏蛋白特异性结合的操纵子区域。
     在 lac 操纵元中有 3 个操纵子， 除了主要的操纵子 lacO1 (O1) ， 还有两个辅助的 lacO ， 它们是 lacO2 (O2) 和 lacO3 (O3) ， O2 中心位于 O1 下游 401 bp 处 lac Z 基因的内 部， O3 中心位于 O1 上游 92 bp 处， 它们都与阻遏作用有关， Lac 阻遏蛋白可以同时结合在两 个操纵子位点上从而形成 DNA 环， 稳定的 DNA 环使得阻遏效果达到最大程度的。
     在 ara 操纵元中有 4 个操纵子， 分别是 araI1 ， araI2 ， araO1 和 araO2 。当没有阿 拉伯糖存在时， 调节蛋白同时结合在 araI1 和 araO2 上， 形成稳定的 DNA 环， PBAD 启动子的转 录被抑制。 发明内容
     本发明的目的在于针对现有技术难以对大肠杆菌 rRNA 启动子 P1 进行调控的不 足， 根据基因表达中的 DNA 环状调控结构设计特殊的 rRNA rrnB P1 嵌合启动子， 以期实现 rrnB P1 启动子的可控表达。
     本发明的另一目的是提供含有该嵌合启动子的表达载体。
     本发明的又一目的是提供一种 β-1,4- 葡聚糖内切酶基因重组表达载体以及利 用该重组表达载体表达 β-1,4- 葡聚糖内切酶的方法。
     本发明的目的可通过如下技术方案实现 : 一种 rRNA rrnB P1 嵌合启动子， 该嵌合启动子是在大肠杆菌 rRNArrnB 操纵元启动子P1 的上下游分别插入乳糖操纵元的两个 lacO1 启动子 ； 或者在大肠杆菌 rRNA 操纵元启动 子 P1 的上下游分别插入阿拉伯糖操纵元的 araI1 和 araO2 启动子， 形成环状 DNA 结构实现 对启动子 P1 的控制。
     其中， 所述的大肠杆菌 rRNA 操纵元启动子 P1 的上下游分别插入乳糖操纵元的两 个 lacO1 启动子，rRNA rrnB P1 嵌合启动子序列为 SEQ ID NO. 1， 命名为 P16S-2。
     所述的在大肠杆菌 rRNA 操纵元启动子 P1 的上下游分别插入阿拉伯糖操纵元的 araI1 和 araO2 启动子，rRNA rrnB P1 嵌合启动子序列为 SEQ ID NO. 2， 命名为 P16S-B。
     一种大肠杆菌诱导型表达载体， 该诱导型表达载体由载体 pET29a 的 T7 启动子被 本发明所述的 rRNA rrnB P1 嵌合启动子代替所得。
     所述的诱导型表达载体优选由载体 pET29a 的 T7 启动子被序列为 SEQ ID NO. 1 的 rRNA rrnB P1 嵌合启动子代替所得， 命名为 pRNP2。
     所述的诱导型表达载体优选由载体 pET29a 的 T7 启动子被序列为 SEQ ID NO. 2 的 rRNA rrnB P1 嵌合启动子代替所得， 命名为 pRBB。
     一种 β-1,4- 葡聚糖内切酶基因重组表达载体， 该重组表达载体是将 β-1,4- 葡 聚糖内切酶基因 cel5 G 插入到本发明所述大肠杆菌诱导型表达载体的 Xho I 和 Nde I 位点之 间所得。 所述的 β-1,4- 葡聚糖内切酶基因重组表达载体优选将 β-1,4- 葡聚糖内切酶 基因 cel5 G 插入到大肠杆菌诱导型表达载体 pRNP2 的 Xho I 和 Nde I 位点之间所得， 命名为 pRNP2-cel5 G。
     所述的 β-1,4- 葡聚糖内切酶基因重组表达载体优选将 β-1,4- 葡聚糖内切酶 基因 cel5 G 插入到大肠杆菌诱导型表达载体 pRBB 的 Xho I 和 Nde I 位点之间所得， 命名为 pRBB-cel5G 。
     一种利用 pRBB-cel5G 重组表达载体表达 β-1,4- 葡聚糖内切酶的方法， 包括如下 步骤 ： （1） 构建调节蛋白 AraC 重组表达载体 ： 以载体 pET22b 为出发载体， 用含自身启动子的 araC 基因替代载体 pET22b 中的 T7 启动子得到所述的调节蛋白 AraC 重组表达载体 ； （2） 构建 pRBB-cel5G 重组表达载体 ； （3） 利用步骤 （1） 和步骤 （2） 构建的重组表达载体共转化大肠杆菌 TOP10 感受态细胞， 在同时含有氨苄青霉素和卡那霉素的双抗性 LB 平板上筛选单菌落 ； （4） 培养步骤 （3） 筛选得到的阳性菌株表达 β-1,4- 葡聚糖内切酶。
     本发明所述的表达载体 pRNP2 和 pRBB 构建方法， 包括以下步骤 ： 1) 根据待合成的嵌合启动子序列设计一对重叠引物， 其中上游引物包含一个调节蛋 白结合位点及 rRNA rrn B 核心启动子序列、 UP 元件和转录因子 (Fis) 结合位点， 下游引物 包含一个调节蛋白结合位点， 使得扩增获得的启动子上下游各有一个调节蛋白位点， 一个 位于核心启动子 -10 区下游， 另外一个位于 Fis 结合位点上游。
     2) 以 PCR 技术或重叠延伸 PCR 技术， 用 DNA 聚合酶进行 PCR 扩增， 获得嵌合启动 子片段 P16S-2 及 P16S-B ； 3) 将扩增获得的嵌合启动子片段与商品化的 pMD18-T 载体混合， 按照 T 载体使用说 明书上介绍的方法进行操作， 通过转化子菌落颜色， 筛选出菌落呈白色的阳性克隆， 提取质
     粒， 酶切并测序鉴定阳性克隆子， 得到含目的片段的重组 T 载体 p16S-2 和 p16S-B。
     4) 将步骤 3) 中得到的含正确目的片段的重组 T- 载体用限制性内切酶双酶切， 回 收目的片段， 用 T4 DNA 连接酶与同样双酶切后回收的 pET29a 连接， 转化克隆宿主菌， 提取 转化子质粒， 测序鉴定阳性重组子， 得到表达载体 pRNP2 和 pRBB。
     本发明的有益效果 ： 1) 通过 DNA 环来调控启动子的活性， 实现了对 rrnB P1 强启动子的人工控制并用于基 因表达， DNA 环的形成在很大程度上提高了阻遏的水平， 它大大地消除了在诱导前不希望的 本底转录。
     2) 表达载体 pRNP2 可以利用多种不同类型的大肠杆菌作为宿主菌， 比如 E. coli DH10B、 DH5a 和 BL21 (DE3)， 优选为E. coli DH10B， 调控严谨性优选为E. coli BL21 (DE3) 。 在 BL21 (DE3) 中， 在没有诱导剂诱导的情况下， 外源基因被完全抑制表达， 因此不会造成 质粒的不稳定， 细胞生长速度的下降和重组蛋白产量的降低。 另外在表达有毒蛋白时， 可以 使目的基因完全处于沉默状态而不转录， 从而避免目的基因毒性对宿主细胞以及质粒稳定 性的影响。表达载体 pRBB 可以高效的用于外源基因的表达， 在 AraC 缺乏的大肠杆菌菌株 中， 该载体可以不受控表达， 并且广泛的宿主范围， 因此可以用于外源基因的定向进化。
     3） pAC+pRBB 共表达体系中通过 pAC 的高表达， 实现了 pRBB 的严谨控制表达。
     4） 本发明所述嵌合启动子及表达载体 pRNP2 和 pRBB 可以方便的实现在多种大肠 杆菌菌株中进行外源基因的高效表达， 其中 pRBB 还可以用于基因的定向进化。 附图说明
     图 1 E.coli rRNA 启动子 P1 结构图 图 2 嵌合启动子 P16S-2 结构图 图 3 嵌合启动子 P16S-2 调控图 图 4 表达载体 pRNP2 构建示意图 图 5 嵌合启动子 P16S-B 结构图 图 6 嵌合启动子 P16S-2 调控图 图 7 表达载体 pRBB 构建示意图 图 8 重组质粒 pAC 构建示意图。具体实施方式
     实施例 1 ： 启动子片段 P16S-2 的扩增及中间质粒 p16S-2 的构建 根据 E. coli rRNA rrnB P1 启动子序列及 lac 操纵子 lacO 序列设计 PCR 引物， 具体 为： 上游引物 S1 ： SEQ ID NO. 3 （含 Sph I 酶切位点） ， 下游引物 S2 ： SEQ ID NO. 4。用重叠 长引物对 S1/S2 互为模板扩增获得 P16S-2 启动子片段。PCR 条件为 ： 10 μL 5×PrimeSTAR 2+ Buffer (Mg plus)， 50 μM dNTP Mixture， 0.5 μM S1， 0.5 μM S2， 1.25 U PrimeSTAR HS DNA 聚合酶 (TAKARA)， 用无菌水调反应体积至 50 μL。PCR 扩增反应程序为 ： 98 ℃， 10 s， 55 ℃， 15 s， 72 ℃， 30 s， 循环 29 次 ； 72 ℃， 10 min。
     用 2% 的琼脂糖凝胶电泳提纯 PCR 产物， 并利用 Taq 酶能使扩增片段末端加脱氧腺苷的特性， 再次进行 PCR 使每个片段的粘性末端都被补平并加上一个 dA。PCR 条件为 ： 2.5 2+ μL 10× Taq Buffer (Mg plus)， 50 μM dNTP Mixture， 10 ng DNA 回收片段， 1 UTaq DNA 聚合酶， 用无菌水调反应体积至 25μL。PCR 扩增反应程序为 ： 72 ℃， 20 min ； 10 ℃， 10 min。
     T/A 克隆是对 PCR 产物直接克隆的一种方法， 利用 Taq 酶具有延伸酶活性， 将一个 A 残基添加到已完全延伸的 PCR 产物的 3’ 末端， 然后利用含有单个胸腺嘧啶 (T) 3’ 突出 端的线性化载体与带有单个腺苷酸 (A) 3’ 突出端的插入片段来进行的。pMD18-T simple 载体是由改建而成的， 具有同 pUC18 载体完全相同的功能。该载体的多接头区域位于基因 内部， 因此能用蓝 / 白斑筛选来鉴定含有插入片段的阳性克隆。载体含有氨苄青霉素抗性 基因， 可用于筛选含有载体的细菌。
     经 PCR 加 “A” 尾反应后的 DNA 片段与 pMD18-T Vector 按 2:1 比例混合， 在连接 液作用下， 16 ℃水浴过夜。酶连产物转化大肠杆菌 DH10B 感受态细胞， 在氨苄青霉素 (100 μg· mL-1)LB 平板上于 37 ℃培养过夜。 转化子经 PCR 及测序鉴定后得到中间质粒 p16S-2。 酶连采用 Takara 公司的酶连试剂盒进行， 其反应体系为 pMD18-T simple 载体 0.5 μL PCR 产物 4.0 μL 连接溶液 I 5 μL 总反应体系 10 μL 本专利中下述所有酶连过程均采用相同的酶连反应体系。 实施例 2 ： 表达载体 pRNP2 的构建 将 p16S-2 和 pET29a 质粒用 NdeI 和 SphI 双酶切得到启动子片段 P16S-2 和去除 T7 启 动子的 pET29a 的双酶切片段， 纯化回收后按照 2:1 比例混合酶连。酶连产物转化 E.coli DH10B 感受态细胞， 涂布含有 50 μg· mL-1 卡那霉素的 LB 平板。转化子经 PCR 及测序鉴定 后得到表达载体 pRNP2。
     实施例 3 ： 含有 β-1,4 葡聚糖内切酶基因 (cel5G) 重组质粒 pRNP2-cel5G 及表达 菌株的构建 将 pRNP2 以及本实验室已经构建好的重组质粒 pET29a-cel5 G ( 崔中利等， 中国专利申 请号 ： 201010018298.0) 分别用 Xho I 和 Nde I 进行双酶切。 酶切体系为 ： Nde I 酶 (10 U·μL -1) 1.0 μL Xho I 酶 (10 U·μL -1) 1.0 μL
     10× 通用缓冲液 pET29a-cel5 G 双蒸水 总体积5.0 μL 20.0 μL 24.0 μL 50.0 μL在 37 ℃水浴中反应 3 h 以上， 酶切产物进行 0.75% 的琼脂糖凝胶电泳切胶回收， 方法 同上。
     酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后用 DNA 凝胶回收试剂盒回收。然后将双酶 切得到的 cel5 G 基因片段和 pRNP2 双酶切片段于 16 ℃酶连过夜后转化 E.coli DH10B 新鲜 感受态细胞， 涂布含有 50 μg·mL-1 卡那霉素的 LB 平板。挑选阳性克隆， 得到重组表达菌 株 pRNP2-cel5 G (DH10B) 。
     再将重组表达质粒 pRNP2-cel5 G 分别转化 E.coli DH5a， BL21 (DE3) 新鲜感受态细胞， 得到表达菌株 pRNP2-cel5 G (DH5a) ， pRNP2-cel5 G [ BL21 (DE3) ]。
     实施例 4 ： β-1,4 葡聚糖内切酶 Cel5G 活力测定 将构建好的表达菌株 pRNP2-cel5 G(DH10B)、 pRNP2-cel5 G (DH5a) 、 pRNP2-cel5 G [ BL21 (DE3) ] 及 pET29a-cel5 G [ BL21 (DE3) ] 接入含卡那霉素的 LB 试管中以固定转速 200 r·min-1 振荡培养过夜， 然后按 1% 接种量转接至 100 mL 新鲜的含卡那霉素的 LB 培养 基中， 37℃振荡培养至 OD600 约为 0.6 ； 加入 IPTG 至终浓度 0.1 mM， 20 ℃诱导培养 20 h ； 同 -1 时以不加 IPTG 诱导的三个表达菌株作为对照。6000 r· min 、 4℃离心 10 min, 收集菌体。 -1 按照 10 mL· g 湿细胞的比例用 50 mM 柠檬酸缓冲液 (pH4.8) 悬浮菌体沉淀， 并加入蛋白 -1 酶抑制剂 PMSF 至终浓度为 0·1 mM， 用超声处理破碎菌体细胞， 12000 r· min 、 4 ℃离心 15 min 后， 所得上清即为含重组酶 Cel5G 的粗酶液。测定 β-1,4 葡聚糖内切酶的表达量及其 活性， 结果显示， cel5 G 基因可以在 P16S-2- 表达系统中很好的表达。在 P16S-2- 表达系统中， 目的蛋白经 IPTG 诱导后酶活达到 T7- 表达系统中的 50% 且未经诱导的目的蛋白的酶活仅 为诱导后的 2%， 在 T7- 系统中本底表达的目的蛋白的酶活也达到了诱导后蛋白酶活的 25%。 由此可见， DNA 环确实在转录调控中起到了重要的作用， DNA 环的形成在很大程度上提高了 阻遏水平。 另外， 构建在 pRNP2 表达载体上的 cel5 G 基因可以在不同的宿主菌中很好的诱导 表达， 但是表达效果不尽相同。 Cel5G 在 E.coli DH10B 中的表达水平最高， 在 E.coli BL21 (DE3) 中的表达水平最低， 并且在 E.coli BL21 (DE3) 中的非诱导条件下， cel5G 基因完全 处于沉默状态而没有转录。
     实施例 5 ： 启动子片段 P16S-B 的扩增及中间质粒 p16S-B 的构建 根据 E. coli rRNA rrnB P1 启动子序列及 ara 操纵子 araI1 和 araO2 序列设计 PCR 引物， 具体为 ： 上游引物 S1 ： SEQ ID NO. 5（含 SphI 酶切位点） ，下游引物 S2 ： SEQ ID NO. 5（含 XbaI 酶切位点） 。用引物对 S1/S2 以大肠杆菌基因组 DNA 为模板 （常规方法提取） 扩 增获得 P16S-B 启动子片段。PCR 条件为 ： 10 μL 5×PrimeSTAR Buffer (Mg2+ plus)， 50 μM dNTP Mixture， 0.5 μM S1， 0.5 μM S2， 1μL DNA 模板， 1.25 U PrimeSTAR HS DNA 聚 合酶 (TAKARA)， 用无菌水调反应体积至 50 μL。 PCR 扩增反应程序为 ： 98 ℃， 10 s， 55 ℃， 15 s， 72 ℃， 30 s， 循环 29 次 ； 72 ℃， 10 min。
     用 2% 的琼脂糖凝胶电泳提纯 PCR 产物， 并利用 Taq 酶能使扩增片段末端加脱氧腺 苷的特性， 再次进行 PCR 使每个片段的粘性末端都被补平并加上一个 dA。PCR 条件为 ： 2.5 2+ μL 10× Taq Buffer (Mg plus)， 50 μM dNTP Mixture， 10 ng DNA 回收片段， 1 UTaq DNA 聚合酶， 用无菌水调反应体积至 25μL。PCR 扩增反应程序为 ： 72 ℃， 20 min ； 10 ℃， 10 min。
     经 PCR 加 “A”尾反应后的 DNA 片段与 pMD18-T Vector 按比例混合， 在连接液 作用下， 16 ℃水浴过夜。酶连产物转化大肠杆菌 DH10B 感受态细胞， 在氨苄青霉素 (100 -1 μg· mL )LB 平板上于 37 ℃培养过夜。转化子经 PCR 及测序鉴定后得到中间质粒 p16S-B。
     实施例 6 ： 表达载体 pRBB 的构建 将 p16S-B 和 pET29a 质粒用 Xba I 和 Sph I 双酶切得到启动子片段 P16S-B 和去除 T7 启动 子的 pET29a 的双酶切片段， 纯化回收后按 2:1 例混合酶连。酶连产物转化 E.coli TOP10 感 受态细胞， 涂布含有 50 μg· mL-1 卡那霉素的 LB 平板。转化子经 PCR 及测序鉴定后得到表 达载体 pRBB。实施例 7 ： 重组质粒 pAC 的构建 将扩增获得的带自身启动子的 araC 基因片段回收纯化后经 NdeI 和 Sph I 双酶切， 与 pET22b 双酶切去除 T7 启动子的纯化片段按 2:1 摩尔比混合， 在连接液作用下， 16 ℃水浴过 -1 夜。酶连产物转化 E.coli TOP10 感受态细胞， 涂布含有 100 μg·mL 氨苄青霉素的 LB 平 板。转化子经酶切及测序鉴定后得到重组质粒 pAC。酶切体系为 ： Nde I 酶 (10 U·μL -1) 1.0 μL Sph I 酶 (10 U·μL -1) 1.0 μL10× 通用缓冲液 pET22b 或 PCR 产物 双蒸水 总体积 5.0 μL 20.0 μL 24.0 μL 50.0 μL在 37 ℃水浴中反应 3 h 以上， 酶切产物进行 0.75% 的琼脂糖凝胶电泳切胶回收， 方法 同上。
     实施例 8 ： 含有 β-1,4 葡聚糖内切酶基因 (cel5G ) 重组质粒 pRBB-cel5G 表达菌 株的构建 将 pRBB 以及本实验室已经构建好的重组质粒 pET29a-cel5 G ( 崔中利等， 中国专利申 请号 ： 201010018298.0) 分别用 Xho I 和 Nde I 进行双酶切。
     酶切体系为 ： Nde I 酶 (10 U·μL -1) 1.0 μL Xho I 酶 (10 U·μL -1) 1.0 μL10× 通用缓冲液 pET29a-cel5 G 双蒸水 总体积 5.0 μL 20.0 μL 24.0 μL 50.0 μL在 37 ℃水浴中反应 3 h 以上， 酶切产物进行 0.75% 的琼脂糖凝胶电泳切胶回收， 方法 同上。
     酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后用 DNA 凝胶回收试剂盒回收。然后将双酶 切得到的 cel5 G 基因片段和 pRBB 双酶切片段于 16 ℃酶连过夜后转化 E.coli TOP10 新鲜感 受态细胞， 涂布含有 50 μg·mL-1 卡那霉素的 LB 平板。挑选阳性克隆， 得到重组表达菌株 pRBB-cel5 G (TOP10) 。
     实施例 9 ： β-1,4 葡聚糖内切酶 Cel5G 活力测定 将等摩尔量的 pAC 和 pRBB-cel5 G 质粒共转化大肠杆菌 TOP10 感受态细胞， 在同时含有 -1 -1 100 mg·L 氨苄青霉素和 50 mg·L 卡那霉素的双抗性 LB 平板上筛选单菌落。
     从双抗性 LB 平板上挑取单菌落接种于含有 100 mg·L-1 氨苄青霉素和 50 mg·L-1 卡那霉素的双抗性 LB 液体培养基中， 37 ℃振荡培养至 OD600 约为 0.6， 加入 L- 阿拉伯糖至 -1 终浓度为 0.2 g·L ， 20 ℃继续振荡培养 20 h 后离心收集菌体， 以不加 L- 阿拉伯糖诱导 的表达菌株作为对照。超声破碎菌体细胞， 离心去除细胞碎片后， 所得上清即为含重组酶 Cel5G 的粗酶液。 测定 β-1,4 葡聚糖内切酶的表达量及其活性， 结果显示， 共表达 cel5 G 基 因和araC 基因后， 未诱导的酶活力仅为诱导后酶活力的 5%， 说明araC 基因产物可以有效地 阻遏 P16S-B 启动子的转录活性， 进一步说明 DNA 环的形成在一定程度上提高了阻遏的水平。8101993878 A CN 101993882序列表1/2 页<110> 南京农业大学 <120> 一种 rRNA 嵌合启动子及含有该嵌合启动子的表达载体 <160>6<210>1 <211>143 <212>DNA <213> 人工序列 <220> <223>rRNArrnB P1 嵌合启动子 P16S-2 <400>1 gcatgcattggttgaatgttgcgcggtcagaaaattattttaaatttcctcttgtcaggc60 cggaataactccctataatgcgccaccaattgtgagcggataacaattcccttgtttaac120 tttaagaaggagatatacatatg 143<210>2 <211>261 <212>DNA <213> 人工序列 <220> <223>rRNArrnB P1 嵌合启动子 P16S-B <400>2 gcatgctcaggtaggatccgctaatcttatggataaaaatgctaatggcaatgacgccag60 gagctgaacaattattgcccgttttacagcgttacggcttcgaaacgctcgaaaaactgg120 cagttttaggctgatttggttgaatgttgcgcggtcagaaaattattttaaatttcctct180 tgtcaggccggaataactccctataatgcgccaccactgacacggaacaacggcaaacta240 tggacaattggtttctctaga 261 <210>3 <211>91 <212>DNA <213> 人工序列 <220> <223> 用于扩增 P16S-2 的重叠 PCR 上游引物序列 <400>3 gcatgcaattgtgagcggataacaattattggttgaatgttgcgcggtcagaaaattatt 609101993878 A CN 101993882序列表912/2 页ttaaatttcctcttgtcaggccggaataact<210>4 <211>92 <212>DNA <213> 人工序列 <220> <223> 用于扩增 P16S-2 的重叠 PCR 下游引物序列 <400>4 catatgtatatctccttcttaaagttaaacaagggaattgttatccgctcacaattggtg 60 gcgcattatagggagttattccggcctgacaa 92<210>5 <211>64 <212>DNA <213> 人工序列 <220> <223> 用于扩增 P16S-B 的 PCR 上游引物序列 <400>5 gcatgctcaggtaggatccgctaatcttatggataaaaatgctaatggcaatgacgccag 60 gagc64<210>6 <211>41 <212>DNA <213> 人工序列 <220> <223> 用于扩增 P16S-B 的 PCR 下游引物序列 <400>6 tctagagaaaccaattgtccatagtttgccgttgttccgtg41