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一种人载脂蛋白AV单克隆抗体及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体的说，涉及一种单克隆抗体，更具体地说，涉及一种人载脂蛋白AV单克隆抗体及其应用。
背景技术
载脂蛋白AV是2001年Pennacchio等发现的一种新的载脂蛋白，它位于ApoAIV下游-27kb的位置，与小鼠ApoAV和人类ApoAIV的碱基序列高度同源，其表达的蛋白质与相邻基因产物ApoAIV也有高度的同源性，故命名为ApoAV。
根据研究显示，ApoAV与血脂水平有关，特别是与甘油三酯水平密切相关，而甘油三酯是冠心病独立的危险因素，载脂蛋白AV是目前为止发现的唯一与甘油三酯代谢有关的载脂蛋白。因此，制备ApoAV单克隆抗体，以用于测定人血清中ApoAV浓度，对于尽早筛选出冠心病高危人群并进行及时预防与早期治疗具有重要意义。
而现在尚未见到有关于ApoAV单克隆抗体的报道。
发明内容
本发明的目的，在于提供一种人载脂蛋白AV的单克隆抗体，以用于测定人血清中ApoAV浓度。
本发明的第二个目的，在于提供所述人载脂蛋白AV的单克隆抗体的制备方法。
本发明的第三个目的，在于提供所述人载脂蛋白AV的单克隆抗体的应用。
本发明的第四个目的，在于提供用于一种人载脂蛋白AV的检测产品。
本发明的第五个目的，在于提供一种可产生人载脂蛋白AV的单克隆抗体的融合细胞。
本发明的人载脂蛋白AV的单克隆抗体，通过将人载脂蛋白AV免疫小鼠，取免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，然后培养融合细胞而获得。
相应的，本发明的人载脂蛋白AV的单克隆抗体的制备方法包括以下步骤：
A、用人载脂蛋白AV免疫小鼠；
B、取小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合；
C、培养融合细胞以获得人载脂蛋白AV的单克隆抗体。
本发明提供的人载脂蛋白AV单克隆抗体可用于检测人载脂蛋白AV。
本发明的人载脂蛋白AV的检测产品利用所述人载脂蛋白AV的单克隆抗体制备。
根据本发明，所述检测产品可以是快速检测产品，优选的，所述快速检测产品为胶体金试纸条或ELISA试剂盒。
使用本发明提供的Apo AV的单克隆抗体可用于检测血清中的Apo AV，使用Apo AV单抗检测ApoAV时，其线性检测范围大，血清中的ApoAI、ApoB和Lp(a)对检测结果无影响，且检测结果稳定性好；因此，可使用本发明提供的Apo AV单克隆抗体制备相应的检测产品，以测定人血清中ApoAV浓度，尽早筛选出冠心病高危人群并进行及时预防与早期治疗。
附图说明
图1是PCR产物凝胶电泳结果，其中，泳道1为蛋白Marker(DL2000)，泳道2为PCR产物。
图2是western blot检测Apo AV的电泳结果，其中，泳道M为蛋白标准，泳道1为重组ApoAV蛋白，泳道2为原倍人血清标本。
图3是重组ApoAV蛋白标准曲线。
图4是人血清滴度曲线。
本发明所获得的可产生人载脂蛋白AV的单克隆抗体的融合细胞AV2G1和AV1F1，已于2008年4月2日提交中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号分别为CCTCC NO：C200805和CCTCC NO：C200804。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆：实验室手册》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件进行。
在下述实施例中使用的样本稀释液配方为：1％BSA+0.1％Triton X-100 0.1M Tris pH8.0。
在下述实施例中所有数据均采用SPSS 11.0统计软件分析，正态性检验用Shapiro-Wilk，相关性分析用Spearman计算相关系数。
在下述实施例中，血清TG，TCHO，HDL-C及LDL-C的测定，均采用酶法在日立7170全自动分析仪上完成。
实施例1、抗原的制备
以EX-W0804-B01(购自GeneCopoeia)为模板，以F.primer和R.primer为引物，进行PCR扩增，然后将获得的PCR产物与PQE30载体连接，获得重组菌株，并将其发酵培养并纯化，获得所需抗原，具体过程如下所示：
1、引物设计
根据目标基因Genbank Acc#：NM_052968.3的序列，设计引物F.primer和R.primer，其序列分别如下所示：
F.primer：CGCGGATCCGCACGGAAAGGCTTCTGGGA；
R.primer：CCCAAGCTTTCAGGGGTCCCCCAGATGGCT。
其中，引物F.primer和R.primer中用下划线标识的分别是其BamH I和Hind III的酶切位点。
2、PCR扩增
以EX-W0804-B01(购自GeneCopoeia)为模板，以F.primer和R.primer为引物，进行PCR扩增，具体条件如下所示：
扩增体系：10×Buffer 5μl；dNTP(10mM)各1μl；F.primer和R.primer各1μl；模板DNA 1μl；Pfu DNA Polymerase 0.5μl；Nuclease-Free Water，40.5μl；
扩增条件：94℃，120s；94℃，30s，55℃，30s，72℃，120s，30个循环；72℃，360s；4℃，过夜。
然后，将扩增产物进行1％Agarose凝胶电泳，结果如图1所示，在1100bp处有条带，与预期的结果一致，使用胶回收纯化试剂盒(购自QIAGEN)回收目的条带并对其进行测序，测序结果显示，插入片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其对应的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，根据上述结果，经PCR扩增获得了所需的目标片段。
3、重组质粒载体构建
将纯化的PCR扩增片段经BamH I和Hind III酶切，与同样经BamH I和Hind III酶切的PQE30载体(购自Novagen，含有Ampicillin(氨苄青霉素)抗性基因)，使用连接酶连接，并将获得的连接产物转化感受态细胞，培养，筛选，获得转化子。
随机挑选3个转化子，抽提质粒进行测序，测序结果显示，其核苷酸序列如SEQ IDNO：3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，根据该结果，获得的转化子中含有目标重组质粒。
将转化子培养，并收获重组质粒。
4、重组质粒转化、发酵及纯化
将获得的重组质粒，转化E.coli JM109，获得重组菌株，然后，将获得的重组菌株发酵培养，将获得的发酵液离心，并常规方法纯化，获得重组人血清脂质蛋白AV。
实施例2、单克隆抗体的制备
以人血清脂质蛋白AV为抗原，以Balb/c小鼠为免疫对象，制备单克隆抗体细胞，并将获得的稳定的阳性单克隆抗体细胞进行培养，并进行纯化，以获得人血清脂质蛋白AV的单克隆抗体，具体过程如下：
2.1、动物免疫
以Balb/c小鼠(购自中国科学院上海实验动物中心)为免疫对象，以实施例1制备获得的人血清脂质蛋白AV为抗原，按照表1的免疫方案进行动物免疫，其中，第1-4次采用皮下免疫注射方式进行免疫，第5次采用尾静脉注射方式进行加强免疫，并于免疫4天后，将免疫好的Balb/c小鼠处死，并收获其脾细胞，以用于细胞融合。
表1、免疫方案

  次数  1  2  3  4  5  计量  50ug/只  25ug/只  25ug/只  25ug/只  50ug/只  间隔  -  3周  2周  2周  4天  佐剂  完全氟氏佐剂  氟氏佐剂  氟氏佐剂  氟氏佐剂  /
2.2、细胞融合
将骨髓瘤细胞(购自武汉生物制品研究所)放大培养，以用于进行细胞融合。
将制备好的骨髓瘤细胞和脾细胞进行融合，并依次使用完全HAT培养液和HAT培养液培养，获得融合细胞。
2.3、阳性单克隆筛选和细胞培养
采用ELISA检测、western-blot和ICC染色方法从融合细胞中挑选阳性克隆，并将阳性克隆进行连续的有限稀释，筛选得到两株稳定的阳性单克隆抗体细胞，命名为AV2G1和AV1F1，该两株细胞已于2008年4月2日提交中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号分别为CCTCC NO：C200805和CCTCC NO：C200804。。
将筛选出的阳性单克隆抗体细胞AV2G1和AV1F1进行培养，收获人血清脂质蛋白AV的单克隆抗体。
实施例3、人血清脂质蛋白检测
收集中南大学湘雅二医院2006年6月至7月门诊体检人群血清标本505例，其中男259例，女246例，年龄20～76(平均44±12)岁；排除糖尿病、高血脂、高血压、肾病、肿瘤及其他免疫系统疾病，且血脂测定结果中TG≤2.4mmol/L，TCHO≤5.6mmol/L。清晨空腹抽血2ml于速凝管内，室温放置2h后3000r/min离心，取血清备用。
将实施例2中制备获得的人血清脂质蛋白AV的单克隆抗体，按以下方案进行westernblot或ELISA检测：
3.1、western blot检测
以获得的单克隆抗体作为一抗，HRP标记羊抗鼠IgG作为二抗，采用western blot方法检测人血清，并以重组Apo AV蛋白作为对照，结果如图2所示，其中，重组Apo AV蛋白在约40KD处有一条明显的目标带，人血清标本在同一位置也呈现了明显条带，根据图2的结果，制备的Apo AV的单克隆抗体可用于检测血清中的Apo AV。
3.2、ELISA检测
使用竞争结合法和Scatchard作图法，对AV2G1和AV1F1抗体进行亲合性测定，根据检测结果，AV2G1的亲合常数为1.054×10¹¹/M，AV1F1亲和常数为7.153×10¹⁰/M。
3.2.1、标准曲线绘制方法
根据两株抗体亲合性测定结果和ELISA的方法学要求，选择双抗体夹心法，进行ELISA检测，其中，将抗体AV2G1用作包被抗体(根据棋盘滴定结果，采用5μg/ml的浓度)，抗体AV1F1用作标记抗体(根据棋盘滴定结果，采用5μg/ml的浓度)，具体过程如下：
将5μg/ml的包被抗体AV2G1包板，150μl/孔4℃过夜；pH7.4PBST洗板3次，每孔加入300μl浓度为10g/L的BSA，37℃温度下封闭1h，PBST洗板1次；每孔加入100μl标准重组蛋白溶液和血清标本(使用样本稀释液以1∶10倍稀释)，37℃孵育1h；使用PBST洗板6次后，每孔加入100μl辣根过氧化物酶标记的AV1F1抗体，37℃孵育1h；加入TMB显色液100μl，37℃避光显色15分钟；每孔加入50μl 2mol/L硫酸中止反应，检测OD450值，然后根据所获得的OD450值作Apo AV浓度标准曲线。
3.2.2、重组Apo AV蛋白标准曲线与血清稀释滴度曲线绘制
重组Apo AV蛋白从3000ng/mL对倍稀释至1∶2048，人血清标本从1∶1开始对倍稀释至1∶1024，然后采用3.2.1的方法测定其OD450值，然后根据测定结果，分别作重组ApoAV蛋白对OD450值的标准曲线，该标准曲线如图3所示，和不同稀释倍数的人血清对OD450值的滴度标准曲线，该标准曲线如图4所示。
根据图3的结果，重组蛋白标准曲线在1.47ng/mL至3000ng/mL之间呈S型，线性范围为5.86～187.5ng/m；根据图4的结果，混合血清在1∶1到1∶1024之间曲线呈反S型，在1∶2到1∶16范围内线性关系良好。因此，重组蛋白标准曲线可在5.86～187.5ng/m范围内用于重组蛋白浓度的标定，滴度标准曲线可在1∶2到1∶16范围内稀释，用于血清中ApoAV的浓度测定。
3.2.3、最低检测限确定
用样本稀释液代替标准蛋白和血清标本，并采用3.2.1的方法测定20孔样本空白的吸光度值，取其均值，并根据P/N值应≥2.1的原则，将均值×2.1，再根据Apo AV浓度标准曲线，计算出其代表的ApoAV浓度，该浓度即为该方法的最低检测限。
检测结果显示，20孔样本空白的吸光度值均值为0.088，即最低检测吸光度的数值为0.1848，根据蛋白标准曲线，Apo AV对应的浓度为2.34ng/ml，即该方法的最低检测限为2.34ng/ml Apo AV。
3.2.4、非特异性脂蛋白的干扰检测
用不同浓度的ApoAI(2.4、1.32、0.66、0.33g/L)、ApoB(2.1、0.88、0.44、0.22g/L)及Lp(a)(800、400、200、100mg/ml)代替标准蛋白和血清标本，用3.2.2的方法测定OD450值，并与样本空白吸光度值及标准曲线相比较，从而判断其干扰情况。
检测结果如表1所示，根据表1的结果，ApoAV单克隆抗体的特异性好，与上述三种脂蛋白没有特异性反应，上述三种脂蛋白和/或载脂蛋白对Apo AV检测结果无影响。
表1、不同浓度Lp(a)、APO A1及APO B测定的OD450结果

3.2.5、批内、批间变异的检测
收集ApoAV浓度为93.75、54.20、6.54ng/ml高、中、低的三个混合血清标本，少量分装于-20℃保存，每天拿出一组，用3.2.1的方法测定OD450值，同时作出蛋白标准曲线，计算Apo AV浓度，连续测定10天，得到三组结果的均数和标准差，通过上述结果，计算获得的变异系数为该方法的批间变异结果，结果如表2所示；将三个血清标本同时测定10孔，得到三组结果的均数和标准差，通过上述结果，计算获得的变异系数为该方法的批内变异结果，结果如表2所示。
表2ELISA法测定人血清ApoAV浓度批内、批间变异

根据表2结果，对于高、中、低三个混合血清标本，其批内变异和批间变异的结果均＜10％，因此，使用人载脂蛋白AV单抗用于检测血清中的人载脂蛋白AV，其稳定性好，对结果的影响小。
根据上述结果，本发明提供的ApoAV的单克隆抗体可用于检测血清中的ApoAV，使用Apo AV单抗采用本发明提供的ELISA方法检测Apo AV，其线性检测范围大，为5.86～187.5ng/m，且能检测最低为2.34ng/ml的Apo AV，血清中的ApoAI、ApoB和Lp(a)对检测结果无影响，检测结果稳定性好。
虽然，本发明没有利用获得的Apo AV单克隆抗体制备相应的产品，但对本领域的技术人员而言，根据本发明的内容，利用上述ApoAV单克隆抗体，制备相应的检测产品，例如快速检测试纸条和/或酶标试剂盒等，是显而易见的，因此，也是本发明所要求保护的内容。
综上所述，本发明提供的Apo AV的单克隆抗体可用于检测血清中的Apo AV，使用Apo AV单抗检测Apo AV，其线性检测范围大，血清中的ApoAI、ApoB和Lp(a)对检测结果无影响，且检测结果稳定性好；因此，可使用本发明提供的Apo AV单克隆抗体制备相应的检测产品，以测定人血清中ApoAV浓度，尽早筛选出冠心病高危人群并进行及时预防与早期治疗。
<110>湖南远泰生物技术有限公司
     中南大学湘雅二医院
<120>一种人载脂蛋白AV单克隆抗体及其应用
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<160>4
<170>PatentIn version 3.1
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Gln Asp Pro Val Gly Met Arg Arg Gln Leu Gln Glu Glu Leu Glu Glu
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Pro His Ala Pro Ala Ser Pro Ala Arg Leu Ser Arg Cys Val Gln Val
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Val Ser Gly Ile Gly Arg His Val Gln Glu Leu His Arg Ser Val Ala
            180                 185                 190
Pro His Ala Pro Ala Ser Pro Ala Arg Leu Ser Arg Cys Val Gln Val
        195                 200                 205
Leu Ser Arg Lys Leu Thr Leu Lys Ala Lys Ala Leu His Ala Arg Ile
    210                 215                 220
Gln Gln Asn Leu Asp Gln Leu Arg Glu Glu Leu Ser Arg Ala Phe Ala
225                 230                 235                 240
Gly Thr Gly Thr Glu Glu Gly Ala Gly Pro Asp Pro Gln Met Leu Ser
                245                 250                 255
Glu Glu Val Arg Gln Arg Leu Gln Ala Phe Arg Gln Asp Thr Tyr Leu
            260                 265                 270
Gln Ile Ala Ala Phe Thr Arg Ala Ile Asp Gln Glu Thr Glu Glu Val
        275                 280                 285
Gln Gln Gln Leu Ala Pro Pro Pro Pro Gly His Ser Ala Phe Ala Pro
    290                 295                 300
Glu Phe Gln Gln Thr Asp Ser Gly Lys Val Leu Ser Lys Leu Gln Ala
305                 310                 315                 320
Arg Leu Asp Asp Leu Trp Glu Asp Ile Thr His Ser Leu His Asp Gln
                325                 330                 335
Gly His Ser His Leu Gly Asp Pro
            340