罗伊氏乳杆菌的罗伊氏菌素生产机制的控制活化 【技术领域】
本发明涉及罗伊氏乳杆菌 (Lactobacillus reuteri) 的罗伊氏菌素 (reuterin) 生产机 制的控制活化，通过在细胞培养物的生产期间添加甘油和其他物质并在保存和贮存期间 在细菌细胞中保持产生的罗伊氏菌素。 特别地，本发明涉及载有罗伊氏菌素的大量罗伊 氏乳杆菌的制造，以及该负载的细菌用于例如预防和治疗疾病的应用、用于食物应用等 等的用途。背景技术
原核生物的细胞被认为是原始的，尽管一些细胞含有异乎寻常的包围物，称为 微区室 (microcompartments，MCS)，其似乎充当了细菌细胞内的原始的细胞器。 羧酶体 (carboxysome，其涉及固定二氧化碳 ) 是近 30 年来在微生物细胞内认识到的仅有的微区 室。 在 2005 年， Todd O.Yeates 教授和他的同事揭示了细菌微区室的一级结构细节。 细菌微区室蛋白质的一级高分辨率结构揭示了高度相似于在某些病毒中所见的那些的结 构的原理。 六个相同的蛋白质亚单位聚集到一起形成六聚单元，六聚单元组成了壳的构 建块。 这些六聚单元紧密地包装在一起形成仅含有极小的孔隙的分子层。 除了通过所述 孔隙之外，这种紧密的包装似乎限制了分子进出微区室的运动。
微生物微区室 - 特异性蛋白质的同源物的聚类分析表明，这样的包围物可 能涉及到各种细菌物种中多达七种不同的代谢过程 (Thomas A.Bobik.2007. 细菌微区 室 .Microbe.1 ：25-31.)。 细菌微区室的构建块只有蛋白质和糖蛋白。 电子显微镜检查 ( 观察微区室所需的 ) 显示没有脂质单层或双层 ( 如在真核生物的泡囊中的 ) 环绕这样的 微区室，使得它们成为已知仅有的在活细胞中基于蛋白质的代谢区室。 细菌的属，包括 沙门氏菌属 (Salmonella)、埃希杆菌属 (Escherichia)、克氏杆菌属 (Klebsiella)、梭状芽胞 杆菌属 (Clostridium)、梭杆菌属 (Fusobacterium)、志贺氏菌属 (Shigella)、利斯特氏杆菌 属 (Listeria) 和耶尔森氏菌属 (Yersinia)，在它们的微区室中含有降解 1，2- 丙二醇 (1， 2-PD) 或乙醇胺所需的成分 (1)。 微区室的另一种性质被认为是它们作为对细菌自身有毒 的基底的容器，如在罗伊氏乳杆菌的抗微生物罗伊氏菌素的情况下。
由 Bobik 对微区室壳基因的 GenBank 检索显示，约 25％ (337 种中的 85 种 ) 的细 菌基因组含有壳基因同源物。 在带有那些同源基因的这 25％的细菌基因组的大部分中， 壳基因与编码微区室相关酶的其他基因簇。 显示的是，编码罗伊氏菌素产生的基因和编 码微区室结构的编码是邻近的。
在 2008 年 5 月， Sriramulu 等人 (Sriramulu DD， Liang M， Hernandez-Romero D， Raux-Deery E， Lunsdorf H， Parsons JB， Warren MJ， Prentice MB ：罗伊氏乳杆菌 DSM 20016 在新陈代谢体 (metabolosomes) 中生产钴胺素依赖性二醇脱水酶并通过歧化作 用代谢 1，2- 丙二醇 .JBacteriol 2008，190(13) ：4559-4567.) 提出了首次的证明，当在含 有 65mM 1，2- 丙二醇 (PD) 和少量的葡萄糖的改良的 MRS 培养基上生长时，生产抗微生
物剂的生物体罗伊氏乳杆菌具有合成细菌微区室 ( 羧酶体或新陈代谢体 ) 的能力。 该生 物体产生由 1，2-PD 诱导的钴胺素依赖性二醇脱水酶。 相连的钴胺素合成和 pdu( 丙二醇 利用 ) 操纵子存在于罗伊氏乳杆菌 DSM 20016 基因组序列中，通过 PCR 从罗伊氏乳杆菌 DSM20016 的实验室菌株扩增了完整的 pdu 操纵子，确认了它在丙二醇代谢生物体中的存 在。 然而，在具有 65mM 1，2-PD 和少量量的葡萄糖的改良的 MRS 培养基中生长，由 于细菌在这种培养基中非常低的生长速度，在工业环境中不可用。 与本发明不同，它们 没有描述在细胞培养物的生产期间添加甘油，使得它可能用罗伊氏菌素装载微区室。
罗伊氏乳杆菌是已知的产生抗微生物物质 3- 羟基丙醛 (HPA)、也称为罗伊氏菌 素的细菌。 在例如美国专利 No.5,439,678、5,458,875、5,534,253、5,837,238 和 5,849,289 中描述了罗伊氏菌素的抗菌活性。 罗伊氏菌素是低分子量、中性、水溶性的化合物，能 够抑制代表了迄今测试的所有细菌属的物种的生长，包括 ：埃希杆菌属 (Escherichia)、 沙 门 氏 菌 属 (Salmonella)、 志 贺 氏 菌 属 (Shigella)、 变 形 菌 属 (Proteus)、 假 单 胞 菌 属 Pseudomonas)、梭状芽胞杆菌属 (Clostridium)、葡萄球菌属 (Staphylococcus)、链球菌属 (Streptococcus) 和幽门螺旋杆菌 (Helicobacter pylori) ；以及几种真菌和其他微生物。当甘 油被用作外部电子受体，并因而被转化成 1，3 丙二醇时，罗伊氏菌素作为中间物产生。 当与糖类例如葡萄糖的发酵偶联时，完成这种反应。
罗伊氏菌素的生产依赖于复杂的机制，包括 ：催化该反应的酶甘油 / 二醇脱水 酶 ；钴胺素 ( 维生素 B12)，酶的辅助因子，其经过复杂的途径合成 ；用于酶的再生的因 子 ；跨度超过 100nm、由多肽形成的微区室结构。 所有这些在一起涉及在需要它们时诱 导的超过 50 种基因。 向生长培养基添加 1，2-PD 或甘油引发了大量微区室结构的生产。 在后期阶段向细菌培养物添加甘油引起了罗伊氏菌素的生产。 罗伊氏菌素被负载、贮存 和保存在微区室之内，直到这些微区室准备释放该罗伊氏菌素物质时。 没有任何生长和 基底 ( 包括甘油 )，当在罗伊氏乳杆菌的正常状态 ( 没有满负载的微区室 ) 将其施加到例 如皮肤上时，通常将没有罗伊氏菌素的释放。 令人惊讶的是，根据本发明活化的和在微 区室保存有罗伊氏菌素的罗伊氏乳杆菌在不利的环境中，成功地和快速地释放罗伊氏菌 素，如在人类的皮肤上、在食物和其他类似的位置上，当然还有益生菌的更为传统的应 用领域，例如包括人类在内的动物的胃肠道和泌尿生殖道、口腔和鼻部。
皮 肤 病 原 体 例 如 金 黄 色 葡 萄 球 菌 (Staphylococcus aureus)、 化 脓 性 链 球 菌 (Streptococcus pyogenes) 或痤疮丙酸杆菌 (Propionibacteriumacnes) 的增殖，或某些酵母 菌的增殖，能够引起伤口感染和皮肤系统的失调，或甚至更为严重的皮肤疾病或粘膜疾 病，例如，湿疹、念珠菌病、皮炎、脓疱，等等。 对这些病原体的许多治疗手段是已知 的。 最常使用的是抗生素或化学抗菌剂。 例如，它们是基于醛和衍生物的组合物。
治疗涉及口服和 / 或局部用抗生素的另一种皮肤疾病是红斑痤疮，影响面部的 中三分之一部分，引起在通常脸红的面部和鼻部区域持续的发红。
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)(MRSA) 和相关的格兰氏 阳性病原体引起的感染是日益关注的医学问题。 这些细菌包括 MRSA、耐甲氧西林 表皮葡萄球菌 (Staphylococcusepidermidis)(MRSE) 和耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌 (Staphylococci)(MRCNS)。 一种糖肽抗生素万古霉素当前是针对这些感染而选择的试 剂。 随着万古霉素使用的增加，耐万古霉素葡萄球菌 (VRSA) 的抗性菌株的出现正如所料成为事实。 因而，越来越需要对该病原体 (MRSA/VRSA) 有效同时无副作用的试剂。
金黄色葡萄球菌最常定殖在鼻孔，而呼吸道、开放创口、静脉内的导管和泌尿 道也是感染的潜在位点。 健康的个体可以无症状地携带 MRSA 持续几周到多年的时间。
难以治疗并且具有多种原因的皮肤病的另一个实例是接触性皮炎，其可以通过 皮肤与外界刺激 / 试剂的接触在敏感的受试者中触发。
利用乳杆菌治疗皮肤病是本领域已知的，例如，在美国专利申请 No.05/201996 中进行了描述。 本发明涉及皮肤病预防和 / 或治疗的领域，利用含有益生细菌，例如发 酵乳杆菌 (Lactobacillus fermentum)VRI-002 菌株的制剂。 优选地施药途径是口服。
其他细菌试剂，例如，芽胞杆菌属 (Bacillus)，也可以在皮肤或粘膜上使用。 具 体地，在申请 WO98/47374 中，芽胞杆菌属的菌株被用于意图预防皮肤的细菌、病毒或 真菌感染的组合物中。
然而，利用现有技术中描述的其他细菌，局部或在其他不利的环境中用乳杆菌 治疗的难题是，由于皮肤或其它地方的不利的生长环境，细菌的寿命很短。 本发明通过 施用处于分泌罗伊氏菌素的 “预备” 模式中、负载微区室的罗伊氏乳杆菌，解决了这个 难题。 因而，罗伊氏乳杆菌在它们相继死亡之前实现罗伊氏菌素的分泌。 发明内容 本发明涉及控制罗伊氏乳杆菌的罗伊氏菌素生产机制的活化的方法，通过用 1， 2-PD 或甘油引发罗伊氏菌素生产机制，之后在保存前的某个时点在细胞培养物的制造过 程中向细菌培养物添加甘油。 本发明还涉及向生长培养基添加维生素 B12、钴和维生素 C 用于改善在制造过程中罗伊氏乳杆菌的微区室和罗伊氏菌素的最佳生长条件和生产。
特别地，本发明涉及装载有罗伊氏菌素的大量罗伊氏乳杆菌细胞的制造，以及 该制备的细菌在例如疾病预防和治疗的组合物和食品组合物中的用途。 更具体地，这些 组合物旨在施用给人类，例如，局部用于预防或治疗由皮肤系统的病原体诱导的疾病。 这些组合物还可以用于 MRSA 治疗的鼻部应用。 本发明避免了罗伊氏乳杆菌在不利的环 境中生长和存活的需要。
在这方面，在详细地解释根据本发明的某些实施例之前，要理解的是本发明在 其应用中不限于在下文的说明中阐述的、或在附图中示出的结构的细节和组成的布置。 本发明能够是其他实施例，和以各种方式实践和实施。 并且，要理解的是，在此采用的 措辞和术语是用于描述的目的，而不应认为是限制。
附图简要说明
图 1 是说明在有或者没有维生素 B12( 上图 ) 或钴 ( 下图 ) 的 B12 培养基中生长 到稳定期的菌株 DSM 17938( 空心柱 ) 和 MM4-1A( 黑色柱 ) 的上清液中罗伊氏菌素水平 的效果的图形。
图 2 是说明在 MRS 培养基中生长到稳定期的菌株 DSM 17938 和 MM4-1A 的上 清液的水平的效果的图形。
图 3a 是说明添加 1，2-PD 对在没有添加钴、维生素 B12(B、E)、添加 50ng/ml 钴 (C、F)、1μg/ml 维生素 B12 的 MRS(A、D) 中生长到稳定期的菌株 MM4-1A 的上清 液中罗伊氏菌素水平和存活率的影响的图形。 黑色柱表明没有添加 1，2-PD。 白色柱表
明添加 65mM 1，2-PD。 灰色柱表明添加 200mM 的 1，2-PD。 在细胞在 200mM 甘油 / 水溶液中孵育之前 (0h) 和之后 (2h) 测量存活率。
图 3b 是说明添加 1，2-PD 对在添加有 1μg/ml 维生素 B12 的 B12 培养基中生长 到稳定期的菌株 DSM 17938 的上清液中罗伊氏菌素水平和存活率的影响的图形。 黑色柱 表明没有添加 1，2-PD。 白色柱表明添加 65mM 1，2-PD。 灰色柱表明添加 200mM 的 1，2-PD。 在细胞在 200mM 甘油 / 水溶液中孵育之前 (0h) 和之后 (2h) 测定存活率。
图 4 是利用透射电子显微镜 (TEM) 对 MCS 的可视化。 菌株 DSM17938(A) 和 MM4-1A(B) 在 MRS 中生长。 菌株 DSM 17938(A) 和 MM4-1A(B) 在添加了维生素 B12(1μg/ml) 和 200mM 1，2-PD 的 MRS 中生长。 白色箭头表示在细菌内形成的 MCS。
图 5a 说明了在暴露于 200mM 甘油水溶液 45 分钟之后 MM4-1A 细胞的上清液中 罗伊氏菌素水平的效果。 细菌在添加 200mM 1，2-PD、200mM 甘油或不添加任何物质 的 B12 培养基 (50ng/ml 钴 ) 中生长。
图 5b 说明了在暴露于 200mM 甘油水溶液 45 分钟之后 MM4-1A 细胞的上清液中 罗伊氏菌素水平的效果 ( 上图 )。 下部的图说明了在暴露于 200mM 甘油水溶液 45 分钟 之后与细胞团块相关的罗伊氏菌素水平的效果。 细菌在 MRS(1)、添加维生素 B121μg/ ml(2) 的 MRS、 添 加 维 生 素 B121μg/ml 和 200mM 1，2-PD 的 MRS(3)、 添 加 维 生 素 B121μg/ml 和 200mM 甘油的 MRS(4)，和添加维生素 B 121μg/ml 和 500mM 甘油的 MRS 中生长。 图 6 是细胞在被洗涤和暴露于 200mM 甘油 / 水溶液 45 分钟之后，检测到的与 MM4-1A 细胞相关的物质的 MAS-NMR 显微照片 ( 上图 )。 细胞在添加了 1μg/ml 维生 素 B12 和 200mM 甘油的 MRS 中生长。 箭头指向 3-HPA 中的醛基基团。 下部的图形显 示了与罗伊氏菌素生产相关的物质。 利用 MAS-NMR 检测 Asterix 标记的物质。
图 7 是表明蔗糖的存在不干扰罗伊氏菌素生产的图形。
具体实施方式
被用作益生菌的罗伊氏乳杆菌培养物的制造是在不存在甘油的情况下培养，然 后冻干。 在这些细菌中，用于罗伊氏菌素生产的机制没有被活化，但是在适宜的条件 下，系统可以在细菌接触甘油之后 30-60 分钟活化。 在非适宜条件下，这种活化可能需 要长得多的时间，或根本不发生。
在需要能快速产生罗伊氏菌素的含罗伊氏乳杆菌的产品、或罗伊氏乳杆菌的生 长条件不适宜的应用中，罗伊氏乳杆菌培养物可以通过在培养物的制造期间存在甘油来 改进。 甘油 (1-500mM) 可以在发酵步骤期间添加，或可以在发酵以及可能的洗涤之后但 在冻干之前的步骤中，与冷保护剂一起添加。 包括罗伊氏乳杆菌的微区室形成的罗伊氏 菌素生产机制可以通过在发酵的开始时用 1，2-PD 或甘油引发罗伊氏菌素生产机制来改 进。
细胞培养产物可以以不同的方式制造，包括但不限于以下的三种不同方式 ：
允许含有罗伊氏乳杆菌的冻干的产品在制造过程的发酵步骤结束时，但在冻干 步骤之前将甘油转化成罗伊氏菌素。 用这种方式制备的产品将含有冻干的细胞以及在所 述细胞之内和周围的罗伊氏菌素。 根据这种制造设计，冻干的细菌载有罗伊氏菌素。类似第一种，但是细菌的罗伊氏菌素生产机制在发酵步骤的开始时用 1，2-PD 或甘油、以及可能地钴或维生素 B-12 来引发。 根据这种制造设计，冻干的细菌载有罗伊 氏菌素，并且被引发而具有产生和存储罗伊氏菌素的能力。
允许含有罗伊氏乳杆菌细胞的冻干的产品在发酵和可能的洗涤步骤之后随着甘 油的添加将甘油转化成罗伊氏菌素，然后在冻干步骤之前在 37℃容许罗伊氏菌素生产约 30-45 分钟。 例如，用于罗伊氏菌素形成的甘油的添加可以与冷保护剂一起进行。 细菌 的罗伊氏菌素生产机制在发酵步骤的开始时用 1，2-PD 或甘油引发。 相对于方法 2，制 造设计 3 的优点是，方法 3 更适合于在许多工业制造环境使用，可以容许罗伊氏菌素形成 的更好的控制。
向生长培养基添加 1，2-PD 或甘油对存活率和 MCS 形成都有影响。 对 1， 2-PD 向丙醛的转化负责的酶复合物 PduCDE 也对甘油向罗伊氏菌素的转化负责，其提供 了这样的可能性，即如果细菌与甘油接触，当细菌在存在 1，2-PD 的情况下生长时形成 的 MCS 也可以作为用于罗伊氏菌素的生产的工厂并且该酶复合物 PduCDE 缺少罗伊氏菌 素的进一步新陈代谢的方法 ( 即，细菌处于稳定期或在水溶液中暴露于甘油 )。 与缺乏 MCS 的细胞相比，在 MCS 中形成的罗伊氏菌素以更高的数量保持在细胞之内。 这使细 菌在冻干之前能够 “装载有” 罗伊氏菌素。 我们用我们的 MM4-1A 和 DSM 17938 菌株重复了 Sriramulu 等人对 DSM 20016 菌株观察到的结果。 然而，在具有 65mM 1，2-PD 和少量葡萄糖的改良的 MRS 培养基 中生长，由于在这种培养基中细菌的极低生长速度，在工业环境中是不可用的。 我们另 外向未改良的 MRS 培养基添加 200mM 1，2-PD 和 1μg/ml 的维生素 B12，测试在 37℃ 生长 24 小时之后该细菌是否产生可见的 MCS( 使用电子显微镜可视化 )。 MM4-1A 和 DSM 17938 菌株都在这些条件下产生 MCS( 图 4)。
类似于 1，2-PD，甘油通过称为 PduCDE 的相同的酶复合物代谢，因而可能也 利用甘油来诱导细菌内 MCS 的形成，与对 1，2-PD 所观察到的类似。 MM4-1A 菌株在 200mM 甘油或 1，2-PD 中的生长产生了细胞，当达到罗伊氏菌素形成和它与细菌细胞团 块相关时，产生的细胞以相同的方式运转，在这之后细菌暴露于水溶液中的甘油在 1 小 时以内 ( 图 5a&5b)。
除了洗涤团块之外 ( 参见上文，图 5b)，我们也利用 MAS-NMR 测试了洗涤的细 胞团块的罗伊氏菌素含量。 然后 MM4-1A 菌株在添加了 B12(1μgl) 和 200mM 1，2-PD 的 MRS 培养基中生长到稳定期。 在生长之后，细菌暴露于水溶液中的 200mM 甘油并在 37℃孵育 1 小时。 细胞保持在冰上，在含有 200mM 甘油的氘水 (D2O) 中洗涤 2 次。 来 自最后的步骤的团粒 ( 大约 20μl 湿重 ) 溶于 20μl 没有甘油的 D2O 中，利用 MAS-NMR 测定罗伊氏菌素含量。 我们可以利用这种方法检测三种罗伊氏菌素形式中的两种和来自 罗伊氏菌素和 1，2-PD 的某些降解产物 ( 图 6a&6h)。
除了用甘油和 1，2-PD 引发之外，向生长培养基添加某些其他物质显示了对细 胞的存活率、 MCS 的形成、罗伊氏菌素的产生和细菌的适应有影响，这些物质为例如维 生素 B12、钴和维生素 C。
为了显示向生长培养基添加维生素 B12 或钴对罗伊氏乳杆菌的适应有影响，针 对罗伊氏乳杆菌菌株 DSM 17938 和 MM4-1A 的罗伊氏菌素生产和适应研究了两种不同类
型的生长培养基，MRS(Oxoid) 和 B12 分析培养基 (Fluka)。 这两种生长培养基之间的主 要区别是 MRS 含有以酵母提取物的形式添加的不明确的维生素组合物，而 B12 分析培养 基 ( 以下称为 B12 培养基 ) 具有除了其缺乏的 B12 之外细菌正常地发挥功能所需的所有 维生素的明确的组合物。 当提到这两种培养基的维生素组成之间的差异时最值得注意的 是， B12 培养基由 4g/l 的维生素 C 组成，可能比 MRS 大几个数量级。
我们使用 B12 培养基作为工具来监测对于添加维生素 B12 或钴的罗伊氏菌素、 微区室 (MCS) 形成和细菌的适应。 维生素 B12 是对甘油向罗伊氏菌素的转化负责的酶复 合物 PduCDE 的关键成分。 为了使维生素 B12 分子具有生物学功能，其需要钴离子。 如 果培养基中存在钴而维生素 B12 中不含钴，罗伊氏菌素只能在 cob- 操纵子的基因被表达 的情况下形成，因为它们对于含有钴的 B12 分子的形成是关键的。 cob 操纵子的表达可能 经由调节物 PocR 与上游 pdu 操纵子的表达连接 (Santos F， Vera JL， van der Heijden R， Valdez G， de Vos WM， Sesma F， Hugenholtz J ：罗伊氏乳杆菌 CRL1098 的完整辅酶 B12 生物合成基因簇 .Microbiology2008，154(Ptl) ：81-93 ；Cheng S， Liu Y， Crowley CS， Yeates TO， BobikTA ：细菌微区室 ：它们的性质和悖论 .Bioessays 2008，30(11-12) ： 1084-1095)，我们测试了与维生素 B12 或钴向 MRS 或 B12 培养基的添加相关的罗伊氏菌 素生产和适应。
当在具有各种数量的维生素 B12 或者钴的 B12 培养基中培养时，考虑它们的罗 伊氏菌素生产，两种菌株 (DSM 17938 和 MM4-1A) 都受到强烈地影响 ( 图 1)。 没有功 能性的 B12 分子不能发生罗伊氏菌素生产是合逻辑的，B12 分子必需在存在钴离子的情况 下被直接添加或由细菌合成。
与 B12 培养基相反， MRS 培养基已经含有不确定数量的维生素 B12，因为添 加的酵母提取物含有维生素的混合物。 从在简单的 MRS 培养基中培养的 MM4-1A 和 DSM 17938 测量的罗伊氏菌素生产与早先在文献中报道的相符，其中 MM4-1A 不会达到 与 DSM 17938 菌株相同的罗伊氏菌素生产水平 ( 图 2)(Spinler JK， Taweechotipatr M， RognerudCL， Ou CN， Tumwasorn S， Versalovic J ：人源性益生菌罗伊氏乳杆菌证明具有 靶向不同的肠细菌病原体的抗微生物活性 .Anaerobe 2008，14(3) ：166-171)。 与 B12 培 养基相反，向 MRS 培养基添加维生素 B12 或钴没有得到关于 MM4-1A 和 DSM 17938 的 罗伊氏菌素生产的提高的决定性的结果。
然而，当涉及 MM4-1A 细菌的适应时，向 MRS 培养基添加维生素 B12 与 1， 2- 丙二醇 (1，2-PD) 一起具有协同效应 ( 图 3)。 当在添加维生素 B12 和 200mM 1， 2-PD 的 MRS 中培养时， MM4-1A 菌株的适应的提高与围绕细菌的培养基中可检测的罗 伊氏菌素的降低相关 ( 图 3)。 我们怀疑这种现象可能是由于向 MRS 添加维生素 B12 和 1，2-PD 提高了细菌内微区室 (MCS) 的出现。 MCS 出现的增加将使得产生的罗伊氏菌 素保持在细菌带有的形成的 MCS 之内。
总之，我们显示了向正常的 MRS 添加 B12 维生素和 1，2-PD ：
在 MM4-1A 和 DSM 17938 中都产生了可见的 MCS( 图 4)，提高了在添加维生 素 B12(1μg/l) 和 200mM 1，2-PD 的 MRS 中生长的 MM4-1A 对产生的罗伊氏菌素的抗 性 ( 图 3)- 提高了在添加维生素 B12(1μgl) 和 200mM 1，2-PD 的 B12 培养基中生长的 DSM 17938 对产生的罗伊氏菌素的抗性 ( 图 3b)。我们还显示了，这样生长的 ( 或添加甘油而不是 1，2-PD)MM4-1A 细菌保持了 在细菌细胞体之内的更高数量的罗伊氏菌素和外部的更低数量的罗伊氏菌素 ( 图 5b)。
当涉及到提高 MM4-1A 抵抗内源产生的罗伊氏菌素的能力时，向补充有 1， 2-PD 的 MRS 中添加维生素 B12 具有作用。 维生素 B12 饱和的生长培养基帮助细菌在存 在 1，2-PD 的情况下生长时形成功能性的 MCS( 图 3&3b)。
载有含有罗伊氏菌素的活化的微区室的保存的罗伊氏乳杆菌可以被配制成各种 组合物，一般是乳膏剂、洗液、糊剂、粉剂、胶囊、片剂、软膏剂、乳剂、鼻喷雾，等 等。 这样的制剂可以通过已知的方法，利用药学上可接受的载体、赋形剂、溶剂或佐剂 来制备。 这样的操作和成分是公知的和在标准教科书和手册中充分地描述。
根据本发明的细菌可以用于制备组合物，所述组合物意图用于例如与皮肤系统 的病原体，如金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、粉刺丙酸杆菌或酵母菌相关的疾病的预 防或治疗。 这些皮肤病可以特别是特异反应性皮炎、痤疮、念珠菌病、脓疱病或湿疹的 二次感染。 皮肤病也可以具有非细菌性原因，例如，红斑痤疮、银屑病、烧伤的创口、 褥疮和其他缓慢愈合的创口。 根据本发明的细菌可以用于制造用于皮肤系统的病原体诱 导的疾病的治疗的组合物。 特别地细菌可以用于制造用于 MRSA 的预防或治疗的组合 物。 上文仅被认为是本发明的原理的说明。 进一步的，由于许多修改和改变对本领 域技术人员是容易想到的，不希望将本发明限制到所显示和描述的确切的结构和操作， 因而，所有适合的修改和等同物可以被包括在本发明的范围之内。
本发明还提供了包含通过本文描述的发明方法获得的产品的
药物组合物。
实施例
实施例 1 具有在发酵步骤期间活化的、含有罗伊氏菌素的负载微区室的 冻干罗伊氏乳杆菌粉剂的制造 发酵培养基组成 葡萄糖一水合物 60g/l 酵母提取物 KAV 20g/l PS 型蛋白胨 ( 猪来源的 )20g/l 柠檬酸氢二铵 5g/l 醋酸钠 (x 3H20)4.7g/l 磷酸氢二钾 2g/l Tween800.5g/l Silibione( 抗泡沫 )0.14g/l 硫酸镁 0.10g/l 硫酸锰 0.03g/l 硫酸锌七水合物 0.01g/l 水适量离心介质
蛋白胨 0-24Orthana( 猪来源的 )
防冻剂
乳糖 ( 牛来源的 )33％
明胶水解产物 ( 牛来源的 )22％
谷氨酸钠 22％
麦芽糊精 11％
抗坏血酸 11％
冻干的罗伊氏乳杆菌粉剂的生产步骤
20ml 的培养基用来自工作细胞库小瓶的 0.6ml 冻干的罗伊氏乳杆菌粉剂接种。 在 37℃在瓶子中进行发酵 18-20 小时，没有搅动或 pH 值控制，即，静态的。
两个 1 升烧瓶的培养基用每升 9ml 细胞浆液来接种。 发酵在 37℃进行 20-22 小 时，没有搅动或 pH 值控制，即，静态的。
来自步骤 2 的两个一升细胞浆液接种到 600 升容器中。 发酵在 37℃进行 13 小 时，伴有搅动和 pH 值控制。 发酵开始时 pH 值是 6.5。 当 pH 值降至低于 5.4，利用 20％ 氢氧化钠溶液开始 pH 值控制。 pH 值控制设置到 pH 5.5。 第四和最终的发酵步骤用步骤 3 的接种物在 15000 升容器中进行。 在 37℃进行 发酵 9 到 12 小时，伴有搅动和 pH 值控制。 发酵开始时 pH 值是 6.5。 当 pH 值降至低 于 5.4，利用 20％氢氧化钠溶液开始 pH 值控制。 pH 值控制设置到 pH 5.5。 在培养物即 将达到稳定期之前，100mM 甘油添加到发酵的末期之中。 当培养物到达稳定期，发酵完 成，稳定期可以通过氢氧化钠溶液添加的降低来看出。 在发酵期间，大约 930 升的氢氧 化钠溶液添加到 10200 升的培养基和 600 升的接种物中。
来自最终发酵的细胞浆液在来自 Alfa Laval 的连续离心机中在 10℃下分离两次。 在首次离心之后，细胞浆液的体积从约 11730 升降低到 1200 升。 这个体积在 3000 升容 器中用 1200 升蛋白胨 (Peptone 0-24， Orthana) 溶液洗涤，在与防冻剂混合前再次分离。 进行蛋白胨的洗涤步骤以避免冻干过程中任何凝固点降低。
在第二次离心之后，细胞浆液的体积降低到 495 升。 该体积与 156kg 的防冻剂 溶液混合，达到大约 650 升的细胞浆液。
将细胞浆液泵送到 1000 升容器中。 该容器然后转运到冻干厂。
在冻干厂，刚好 2 升的细胞浆液倾倒在冰冻干燥器的每个平板上。 冰冻干燥器 的最大容量是 600 升，所有过多的细胞浆液体积被弃去。
罗伊氏乳杆菌的细胞浆液干物质含量为 18％，冻干四到五天。
在冻干过程中，所述过程中的压力在 0.176mbar 和 0.42mbar 之间。 当压力达到 0.42mbar 时开启真空泵。 当过程完成时，使用 PRT( 密封测试 ) 来测定。 如果 PRT 或压 力的提高在 120 秒后低于 0.02mbar，停止该过程。
实施例 2
具有在发酵步骤期间引发和活化的、含有罗伊氏菌素的负载微区室的冻干罗伊 氏乳杆菌粉剂的制造
生产过程与实施例 1 类似，但是用生长培养基中另外的 200mM1，2-PD、维生
素 C(4g/l) 和维生素 B12(1μg/ml) 引发。
实施例 3
在发酵步骤期间引发的，在冻干步骤之前对罗伊氏菌素形成来活化的，具有含 罗伊氏菌素的负载微区室的冻干的罗伊氏乳杆菌粉剂的制造
生产过程与实施例 1 类似，但是用生长培养基中另外的 200mM1，2-PD、维生 素 C(4g/l) 和维生素 B12(1μg/ml) 引发。 但是没有在发酵期内添加的 100mM 甘油，而 是在转运到冻干厂之前添加到细胞浆液中。
实施例 4
具有活化的罗伊氏菌素生产机制的罗伊氏乳杆菌的软膏剂的制备
从以下成分制备软膏剂 ：
罗伊氏乳杆菌的冻干粉剂，利用例如任何上述生产方法，具有活化的罗伊氏菌 素生产机制。
产品的赋形剂 ( 用固体脂肪或蜡稳定的无水油 )。 油，优选地植物油，例如油菜 籽油或棕榈油。
固体脂肪，例如蜂蜡 . 防腐剂和稳定剂，软膏剂领域中任何已知的 .
过程将包括，熔化固体部分，与油 (AkomedR， AAK) 和其他成分混合。 冻干 的粉剂罗伊氏乳杆菌在低于 55℃的温度下添加到混合物中。 搅动混合物直到它固化得到 软膏剂。
. 将软膏剂填充到小管中，并密封。产生的软膏剂含有每克软膏剂约 10E+08CFU 的制备的罗伊氏乳杆菌培养物。
实施例 5
人类受试者中红斑痤疮的治疗
用根据本发明生产的冻干罗伊氏乳杆菌培养物治疗具有长期红斑痤疮病史的女 性受试者。 受试者每天接受治疗两次，分别在早晨和晚上。 在每一种场合，将软膏剂薄 层涂抹到皮肤上。
2 周后，在没有治疗所述状况而开具处方的抗生素的情况下，红斑痤疮得到明显 的改善。 在停止罗伊氏乳杆菌治疗时，状况复发，但是被罗伊氏乳杆菌的定期施用所抑 制。
实施例 6
鼻喷雾制品
利用分配器或其他需要的设备，包含载有准备用于罗伊氏菌素生产的微区室结 构的罗伊氏乳杆菌的鼻制剂可以采取各种形式来施用，例如，喷雾剂、滴剂、凝胶、软 膏剂、乳膏剂、粉剂或悬浮液。 各种分配器和递送工具是本领域已知的，包括单剂量安 瓿、喷雾器、雾化器、泵、鼻托、鼻部海绵、鼻囊，等等。
更一般地，制剂可以采取固体、半固体或液体形式。 对于固体形式来说，成分 可以通过混合、翻转混合、冻干、溶剂蒸发、共研磨、喷雾干燥和其他本领域已知的技 术混合在一起。
适合于鼻内施用的半固体的制剂可以采取基于油的凝胶或软膏剂的形式。
在发酵步骤期间引发的，在冻干步骤之前对罗伊氏菌素形成来活化的，具有含 罗伊氏菌素的负载微区室的冻干的罗伊氏乳杆菌粉剂的制造
生产过程与实施例 1 类似，但是用生长培养基中另外的 200mM1，2-PD、维生 素 C(4g/l) 和维生素 B12(1μg/ml) 引发。 但是没有在发酵期内添加的 100mM 甘油，而 是在转运到冻干厂之前添加到细胞浆液中。
实施例 4
具有活化的罗伊氏菌素生产机制的罗伊氏乳杆菌的软膏剂的制备
从以下成分制备软膏剂 ：
罗伊氏乳杆菌的冻干粉剂，利用例如任何上述生产方法，具有活化的罗伊氏菌 素生产机制。
产品的赋形剂 ( 用固体脂肪或蜡稳定的无水油 )。 油，优选地植物油，例如油菜 籽油或棕榈油。
固体脂肪，例如蜂蜡 . 防腐剂和稳定剂，软膏剂领域中任何已知的 .
过程将包括，熔化固体部分，与油 (AkomedR， AAK) 和其他成分混合。 冻干 的粉剂罗伊氏乳杆菌在低于 55℃的温度下添加到混合物中。 搅动混合物直到它固化得到 软膏剂。
. 将软膏剂填充到小管中，并密封。产生的软膏剂含有每克软膏剂约 10E+08CFU 的制备的罗伊氏乳杆菌培养物。
实施例 5
人类受试者中红斑痤疮的治疗
用根据本发明生产的冻干罗伊氏乳杆菌培养物治疗具有长期红斑痤疮病史的女 性受试者。 受试者每天接受治疗两次，分别在早晨和晚上。 在每一种场合，将软膏剂薄 层涂抹到皮肤上。
2 周后，在没有治疗所述状况而开具处方的抗生素的情况下，红斑痤疮得到明显 的改善。 在停止罗伊氏乳杆菌治疗时，状况复发，但是被罗伊氏乳杆菌的定期施用所抑 制。
实施例 6
鼻喷雾制品
利用分配器或其他需要的设备，包含载有准备用于罗伊氏菌素生产的微区室结 构的罗伊氏乳杆菌的鼻制剂可以采取各种形式来施用，例如，喷雾剂、滴剂、凝胶、软 膏剂、乳膏剂、粉剂或悬浮液。 各种分配器和递送工具是本领域已知的，包括单剂量安 瓿、喷雾器、雾化器、泵、鼻托、鼻部海绵、鼻囊，等等。
更一般地，制剂可以采取固体、半固体或液体形式。 对于固体形式来说，成分 可以通过混合、翻转混合、冻干、溶剂蒸发、共研磨、喷雾干燥和其他本领域已知的技 术混合在一起。
适合于鼻内施用的半固体的制剂可以采取基于油的凝胶或软膏剂的形式。
在优选的实施例中，鼻部制剂是液态的，其可以包括油溶液、油悬浮液。 液体 制剂可以利用本领域已知的设备作为鼻喷雾或滴鼻剂施用，包括能够作为液滴气雾剂递 送选定体积的制剂的喷雾器。 例如，具有 50μL 或 100μL 的递送体积的商业上可获得的 喷雾泵可从例如 Valois(Congers，N.Y.) 获得，具有成人尺寸和儿童尺寸的喷雾嘴。
液体制剂可以通过已知的过程来生产。 例如，用于鼻部施用的制剂可以通过在油脂性基 质，例如药学上可接受的油，如橄榄油、羊毛脂、硅油、甘油脂肪酸等等中混合载有罗 伊氏菌素的罗伊氏乳杆菌来生产。
要理解的是，制剂、稳定性和 / 或生物利用度所需的赋形剂可以被包括在制剂 中。 示例性的赋形剂包括糖类 ( 葡萄糖、山梨醇、甘露醇、蔗糖 )、摄取增强剂 ( 壳聚 糖 )、增稠剂和稳定性增强剂 ( 纤维素、聚乙烯基吡咯烷酮、淀粉，等等 )、缓冲剂、防 腐剂，和 / 或调整 pH 值的酸和碱，等等。
虽然参考具体的实施例描述了本发明，本领域技术人员将理解的是，本发明可 以被包括在许多其他形式中。