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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201510992676.8 (22)申请日 2015.12.24 C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (71)申请人 中南民族大学 地址 430074 湖北省武汉市洪山区民族大道 708 号 (72)发明人 沈金花 黄俊 (74)专利代理机构 武汉华旭知识产权事务所 42214 代理人 刘天钰 (54) 发明名称 一种检测人类EGFR基因L861Q位点突变的探 针和引物组合 (57) 摘要 本发明适用于生物技术及医学领域， 提供了 一种检测人类 EGFR 基因 L861Q 位点突变的方法， 具体。
2、而言， 本发明将荧光定量 PCR 技术与 ARMS 引 物及 TaqMan 荧光探针技术相结合， 发明了一种用 于人类EGFR基因L861Q位点突变检测方法。 该方 法包括特异性引物， 特异性探针。 本发明建立的检 测人类EGFR基因L861Q位点突变检测的方法具有 以下优点 ： 1. 方法简单有效 ； 2. 灵敏度高 ； 3. 特 异性强 ； 4. 操作简单快速。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 序列表3页 附图1页 CN 105385775 A 2016.03.09 CN 105385775 A 1/1 页 2。
3、 1.一种检测人类 EGFR 基因 L861Q 位点突变的探针和引物组合， 其特征在于 ： 所述的探 针的基因序列如 SEQ ID NO:3、 SEQ ID NO:6 以及 SEQ ID NO:9 所示 ： SEQ ID NO:35 FAMTCTCACCTTCTGGGATCCAGAGTCCCTATGACBHQ13 ； SEQ ID NO:65 FAMTCTTGACATGCTGCGGTGTTTTCACCAGTACBHQ13 ； SEQ ID NO:95 HEXCCAAGGACCACCTCACAGTTATTGAACATCBHQ13 ； 所述的引物组合为 ： SEQ ID NO:1GGCAGCATG。
4、TGGCACCATCTC ； SEQ ID NO:2GGATTTCCTTGTTGGCTTTCGG ； SEQ ID NO:4GGGTCTTCTCTGTTTCAGGGCATG ； SEQ ID NO:5GGTATTCTTTCTCTTCCGCACCCAGAT ； SEQ ID NO:7TTCCAGTTTGCCAAGGCACGAG ； SEQ ID NO:8GAAGGAAAGATCATAATTCCTCTGCACATA。 2.一种基于权利要求 1 所述探针和引物组合的检测人类 EGFR 基因 L861Q 位点突变的 方法， 其特征在于包括以下步骤 ： (1) ： 合成权利要求 1 所述的探针及引物组合。
5、 ； (2)、 对待检测样品进行处理并提取 DNA ； (3)、 配制荧光定量 PCR 反应体系 A， 对待测样品上样量进行监测， 利用引物 SEQ ID NO:1、 SEQ ID NO:2、 SEQ ID NO:7、 SEQ ID NO:8、 和探针 SEQ ID NO:3、 SEQ ID NO:9 扩增待 测样品 DNA， 得到样品 DNA 的检测 Ct 值和内参 CT 值， 以 FAM 荧光信号 CT 值作为样品的质控 Ct 值 ； (4)、 配制荧光定量 PCR 反应体系 B， 对待测样品进行 PCR 扩增检测， 利用引物 SEQ ID NO:4、 SEQ ID NO:5、 SEQ I。
6、D NO:7、 SEQ ID NO:8 和探针 SEQ ID NO:6、 SEQ ID NO:9 扩增待 测样品中可能存在的 EGFR 基因 L861Q 突变 DNA， 得到样品 DNA 的突变检测 Ct 值 ； (5)以质控Ct值作为上样量是否适当的标准， 质控Ct值30则上样量合适， 检测结果 有效 ； 30 质控 Ct 值 34 则上样量偏低， 可提高上样量后检测 ； 以突变检测 Ct 值判断是 否存在突变， 若突变检测 Ct 值 39 则样品存在突变， 若突变检测 Ct 值 39 则样品无该突 变或低于突变检测下限。 3.根据权利要求1所述的检测方法， 其特征在于 ： 步骤(3)中所述。
7、的荧光定量PCR反应 体系 A 包括 PCR MIX ； SEQ ID NO:10.5M ； SEQ ID NO:20.5M ； SEQ ID NO:30.25M ； SEQ ID NO:70.25M ； SEQ ID NO:80.25M ； SEQ ID NO:90.13M ； 样品 DNA 体积浓度 10。 4.根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于 ： 步骤 (4) 中所述的荧光定量 PCR 反应体 系B包括PCR MIX ； SEQ ID NO:40.5M ； SEQ ID NO:50.5M ； SEQ ID NO:60.25M ； SEQ ID NO:70.25M ； SEQ I。
8、D NO:80.25M ； SEQ ID NO:90.13M ； 样品 DNA 体积浓度 10。 权 利 要 求 书 CN 105385775 A 2 1/5 页 3 一种检测人类EGFR基因L861Q位点突变的探针和引物组合 技术领域 0001 本发明提供了一种用于检测人类EGFR基因L861Q位点突变的方法， 并提供了相关 的扩增引物及探针， 属于生物技术及医学领域。 背景技术 0002 EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor, 也称 ： 表皮生长因子受体 ) 基因 , 表 皮生长因子受体(HER)家族成员之一,在细胞生理过程中发挥重要的调节作用。 EG。
9、FR基因 定位于 7 号染色体短臂 7p12-14 区， 由 118kb 组成， 包含 28 个外显子， 其中， 酪氨酸激酶功 能区由外显子 18-24 编码， 外显子 18-20 编码 N 端小叶， 外显子 21-24 编码 C 端小叶。EGFR 蛋白是具有受体酪氨酸激酶活性的跨膜蛋白， 存在于哺乳动物上皮细胞、 角质细胞、 胶质细 胞、 成纤维细胞等细胞表面。EGFR 与 HER2(erb B2)， HER3(erb B3) 和 HER4(erb B4) 归入 Erb B 家族， 同属受体酪氨酸激酶家族。它们有着类似的分子结构 ： 细胞外配体结合区、 跨 膜区及细胞内酪氨酸激酶区。EGFR。
10、 蛋白与表皮生长因子、 转化生长因子 和表皮调节素 等配体结合成为二聚体或异二聚体后， 使受体酪氨酸激酶活化， 激活下游通路如 ERK/MAPK， PI3K/AKT 和 STAT， 参与调节细胞增殖和凋亡并控制信号转导。 0003 近年来， 科学家们发现 EGFR 基因能够在多种肿瘤中作为抗肿瘤治疗的靶标， 包括非小细胞肺癌 (NSCLC) 等。某些 EGFR 酪氨酸酶抑制剂 (EGFR-TKI) 如吉非替尼 (gefitinib ； Iressa,ZD1839 ； AstraZeneca,Wilmington,DE) 和 厄 洛 替 尼 (erlotinib ； Tarceva,OSI-77。
11、4 ； OSI Pharmaceuticals,Farmingdale,NY) 已经在临床上用于 NSCLC 的治 疗。EGFR-TKI 能通过阻断肿瘤细胞 EGFR 信号传导， 来抑制肿瘤细胞的增生、 侵袭、 转移、 血 管生成并促进肿瘤细胞的凋亡。但是临床实践显示仅有 8-18的非小细胞肺癌患者可以 受益， 这种疗效差异主要表现为 EGFR 基因突变的差异。研究表明， 某些含有 EGFR 基因酪氨 酸激酶区突变的个体服用 EGFR-TKI 具有更好的疗效， 而不含该基因突变的个体疗效并不 显著， 这些突变主要集中在 18-21 号外显子上。因此可以通过检测 EGFR 基因 18-21 号外。
12、 显子的突变达到预测吉非替尼等分子靶向药物的治疗效果的目的。本发明所述 EGFR 基因 L861Q 突变位点位于 21 号外显子区域， 通过检测该位点的突变能够预测分子靶向药物的治 疗效果。 0004 目前点突变检测方法主要有测序法， 该方法耗时长， 且灵敏度不高。 另一些用于临 床检测的荧光定量 PCR 法， 灵敏度相对较高， 但背景较强， 易产生假阳性结果。EGFR 基因 21 号外显子 L861Q 位点突变位于序列 2581bp 处， CTG 突变为 CAG( 见表 1)。因此需建立一种 高特异性 L861Q 位点突变检测方法。 0005 表 1 ： EGFR 基因 L861Q 位点突变。
13、 0006 说 明 书 CN 105385775 A 3 2/5 页 4 发明内容 0007 本发明提供了一种检测人类 EGFR 基因 L861Q 位点突变的方法以及相关的探针和 引物组合， 该方法能够解决背景技术中的不足， 检测灵敏度高， 操作简单快速， 结果判读简 单客观。 0008 实现本发明上述目的所采用的技术方案为 ： 0009 一种检测人类EGFR基因L861Q位点突变的探针和引物组合， 所述的探针的基因序 列如 SEQ ID NO:3、 SEQ ID NO:6 以及 SEQ ID NO:9 所示 ： 0010 SEQ ID NO:3 5 FAMTCTCACCTTCTGGGATCC。
14、AGAGTCCCTATGACBHQ1 3 ； 0011 SEQ ID NO:6 5 FAMTCTTGACATGCTGCGGTGTTTTCACCAGTACBHQ1 3 ； 0012 SEQ ID NO:9 5 HEXCCAAGGACCACCTCACAGTTATTGAACATCBHQ1 3 ； 0013 所述的引物组合为 ： 0014 SEQ ID NO:1 GGCAGCATGTGGCACCATCTC ； 0015 SEQ ID NO:2 GGATTTCCTTGTTGGCTTTCGG ； 0016 SEQ ID NO:4 GGGTCTTCTCTGTTTCAGGGCATG ； 0017 SEQ ID。
15、 NO:5 GGTATTCTTTCTCTTCCGCACCCAGAT ； 0018 SEQ ID NO:7 TTCCAGTTTGCCAAGGCACGAG ； 0019 SEQ ID NO:8 GAAGGAAAGATCATAATTCCTCTGCACATA。 0020 一种基于上述探针和引物组合的检测人类EGFR基因L861Q位点突变的方法， 包括 以下步骤 ： (1) ： 合成权利要求 1 所述的探针及引物组合 ； 0021 (2)、 对待检测样品进行处理并提取 DNA ； 0022 (3)、 配制荧光定量PCR反应体系A， 对待测样品上样量进行监测， 利用引物SEQ ID NO:1、 SEQ I。
16、D NO:2、 SEQ ID NO:7、 SEQ ID NO:8、 和探针 SEQ ID NO:3、 SEQ ID NO:9 扩增待 测样品 DNA， 得到样品 DNA 的检测 Ct 值和内参 CT 值， 以 FAM 荧光信号 CT 值作为样品的质控 Ct 值 ； 0023 (4)、 配制荧光定量 PCR 反应体系 B， 对待测样品进行 PCR 扩增检测， 利用引物 SEQ ID NO:4、 SEQ ID NO:5、 SEQ ID NO:7、 SEQ ID NO:8 和探针 SEQ ID NO:6、 SEQ ID NO:9 扩增 待测样品中可能存在的 EGFR 基因 L861Q 突变 DNA，。
17、 得到样品 DNA 的突变检测 Ct 值 ； 0024 (5)以质控Ct值作为上样量是否适当的标准， 质控Ct值30则上样量合适， 检测 结果有效 ； 30 质控 Ct 值 34 则上样量偏低， 可提高上样量后检测 ； 以突变检测 Ct 值判 断是否存在突变， 若突变检测 Ct 值 39 则样品存在突变， 若突变检测 Ct 值 39 则样品无 该突变或低于突变检测下限。 0025 步骤 (3) 中所述的荧光定量 PCR 反应体系 A 包括 PCR MIX ； SEQ ID NO:10.5M ； SEQ ID NO:20.5M ； SEQ ID NO:30.25M ； SEQ ID NO:70.。
18、25M ； SEQ ID NO:80.25M ； SEQ ID NO:90.13M ； 样品 DNA 体积浓度 10。 说 明 书 CN 105385775 A 4 3/5 页 5 0026 步骤 (4) 中所述的荧光定量 PCR 反应体系 B 包括 PCR MIX ； SEQ ID NO:40.5M ； SEQ ID NO:50.5M ； SEQ ID NO:60.25M ； SEQ ID NO:70.25M ； SEQ ID NO:80.25M ； SEQ ID NO:90.13M ； 样品 DNA 体积浓度 10。 0027 本发明中优选 PCR 反应条件为 ： 50 2min ； 95。
19、 30s ； 95 5s， 60 30s， 43 个循 环 ； 每个循环后收集 FAM 和 HEX 荧光信号。 0028 本发明中， 采用荧光定量 PCR 方法， 对单碱基突变区域序列进行特异性扩增检测。 本发明建立的检测方法简单有效， 检测灵敏度高， 操作简单快速， 结果判读简单， 能够准确 预测分子靶向药物的治疗效果， 是一种有效检测人类 EGFR 基因 L861Q 位点突变的方法。 附图说明 0029 图 1 为本发明提供的方法用于检测 EGFR 基因野生型样品的扩增曲线图及 L861Q 位点突变样品的扩增曲线图。 具体实施方式 0030 为了使本发明要解决的技术问题、 技术方案及有益效。
20、果更加清楚明白， 以下结合 附图及实施例， 对本发明进行进一步详细说明。 应当理解， 此处所描述的具体实施例仅仅用 以解释本发明， 并不用于限定本发明。 0031 本发明实施例中所用的技术， 除非特别说明， 均为本领域的技术人员已知的常规 技术 ； 所用的仪器设备、 试剂等， 除非特别说明， 均为本领域的研究和技术人员可以通过公 共途径获得。 0032 本发明实施例提供一种检测人类 EGFR 基因 L861Q 位点突变的方法， 包括一组引 物、 特异性探针。其中一组引物序列为 SEQ ID NO:1、 SEQ ID NO:2、 SEQ ID NO:4、 SEQ ID NO:5、 SEQ ID 。
21、NO:7、 SEQ ID NO:8 ； 特异性探针序列为 SEQ ID NO:3、 SEQ ID NO:6、 SEQ ID NO:9 ； 0033 具体的， 所述引物的基因序列如下所示 ： 0034 SEQ ID NO:1 GGCAGCATGTGGCACCATCTC ； 0035 SEQ ID NO:2 GGATTTCCTTGTTGGCTTTCGG ； 0036 SEQ ID NO:4 GGGTCTTCTCTGTTTCAGGGCATG ； 0037 SEQ ID NO:5 GGTATTCTTTCTCTTCCGCACCCAGAT ； 0038 SEQ ID NO:7 TTCCAGTTTGCCAA。
22、GGCACGAG ； 0039 SEQ ID NO:8 GAAGGAAAGATCATAATTCCTCTGCACATA。 0040 具体的， 所述特异性探针为 TaqMan 探针类型， 基因序列如下所示 ： 0041 SEQ ID NO:3 5 FAMTCTCACCTTCTGGGATCCAGAGTCCCTATGACBHQ1 3 0042 SEQ IDNO:6 5 FAMTCTTGACATGCTGCGGTGTTTTCACCAGTACBHQ1 3 0043 SEQ ID NO:9 5 HEXCCAAGGACCACCTCACAGTTATTGAACATCBHQ1 3 。 0044 上述特异性探针的 5端。
23、标记 FAM 或 HEX 荧光基团， 其 3端连接 BHQ1 修饰基团， 探针的Tm值为65， 长度为31bp左右， 3端的修饰BHQ1基团能够最大限度的淬灭FAM和 HEX 荧光信号并且无背景荧光信号， 最大限度的降低噪声干扰。 0045 实施例 1 说 明 书 CN 105385775 A 5 4/5 页 6 0046 首先制备本发明提供的 EGFR 基因 L861Q 位点突变检测体系。包括以下步骤 ： 0047 1. 引物及探针合成 0048 合成引物序列 SEQ ID NO:1、 SEQ ID NO:2、 SEQ ID NO:4、 SEQ ID NO:5、 SEQ ID NO:7、 S。
24、EQ ID NO:8 ； 合成特异性探针序列 SEQ IDNO:3、 SEQ ID NO:6、 SEQ ID NO:9， 并在 5 端标记 FAM 或 HEX 荧光基团， 3 端连接 BHQ1 修饰基团。 0049 将上述引物分别配制成 100M 的母液储存， 将上述探针分别配制成 100M 的母 液储存。 0050 2. 荧光定量 PCR 反应体系的制备 0051 分别制备质控检测反应体系和突变检测反应体系， 各组分如下表所示 ： 0052 0053 用本发明的方法检测 EGFR 基因 L861Q 位点突变， 本实施例中收集共 48 例临床病 理诊断为肿瘤的血液标本和组织标本， 并从中提取基。
25、因组 DNA， 用实施例 1 中得到的突变检 测体系检测样品是否存在 EGFR 基因 L861Q 位点突变， 其步骤具体为 ： 0054 1. 样品的处理 0055 使用DNA提取试剂盒(QIAamp DNA FFPE Tissue Kit,Cat No.56404)提取上述血 液和组织标本的基因组DNA。 提取方法参照说明书进行。 PCR MIX(TaqMan Gene Expression Master MIX， Lot No.1310186) 购置于 AB 公司。取 2L 所得溶液测 OD 值以确定 DNA 浓度， 然后将样品 DNA 稀释到 50ng/L 左右， 取 2L 进行下一步的。
26、 PCR 反应。 0056 2. 样本的荧光定量 PCR 检测 0057 将提取稀释后的 DNA 样品依次取 2L 分别加入质控检测反应体系和突变检测反 应体系， 并放入荧光定量 PCR 仪， 按如下所示设置 PCR 反应程序后进行扩增反应 ： 0058 50 2min ； 0059 95 30s ； 0060 95 5s， 60 30s， 43 个循环 ； 每个循环后收集 FAM 和 HEX 荧光信号。 0061 3. 样本的检测结果分析 0062 本发明通过检测的内参 Ct 值判断加样是否完成， 通过检测的质控 Ct 值判断样本 是否合格， 通过突变检测 Ct 值值判断是否发生 EGFR 。
27、基因 L861Q 位点突变。 说 明 书 CN 105385775 A 6 5/5 页 7 0063 具体的， 结果判读标准如下 ： 0064 质控 Ct 值 30 则表明上样量合适， 检测结果有效 ； 30 质控 Ct 值 34 则表明 上样量偏低， 可适当提高上样量后重新检测 ； 以突变检测 Ct 值大小判断是否发生突变的判 断标准， 突变检测 Ct 值 39 则样品无此突变或低于突变检测下限 ； 突变检测 Ct 值 39 则 样品存在此突变。 0065 本实施例中的检测结果如下 ： 0066 48 个样本中， 5 个未得到足量的基因组 DNA， 其余 EGFR 基因 L861Q 位点野生。
28、型样 本 43 例， 其中 42 例样本突变检测无 Ct 值， 1 例样本突变检测 Ct 值 39， 1 例样本突变检测 Ct 值 39， 检测结果如图 1 所示。将上述突变样本进行测序， 测序结果与本方法检测结果 相符。 0067 以上结果表明， 本发明提供的用于人类EGFR基因L861Q位点突变检测方法灵敏度 高于传统测序方法， 较其他荧光定量 PCR 法特异性更强， 假阳性率更低， 且操作简单快速， 利于大规模推广。 说 明 书 CN 105385775 A 7 1/3 页 8 0001 0002 序 列 表 CN 105385775 A 8 2/3 页 9 0003 序 列 表 CN 105385775 A 9 3/3 页 10 序 列 表 CN 105385775 A 10 1/1 页 11 图 1 说 明 书 附 图 CN 105385775 A 11 。