技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种生物素化无机焦磷酸酶的储存试剂。
背景技术
无机焦磷酸酶(InorganicPyrophosphatase,PPase,EC3.6.1.1)是一类催化焦磷 酸(Pyrophosphoricacid，PPi)水解为正磷酸的酶。PPase通过分解PPi可为多种生物合成 途径提供能量，并推动其向合成方向进行。例如，葡萄糖和淀粉的合成、纤维素合成、氨酰 tRNA合成、脂酰辅酶A合成、DNA和RNA的聚合等。PPase广泛存在于自然界，随着技术手段的 发展，现已成功地从日本吸血虫、水稻、大麦、烟草、酵母、枯草芽胞杆菌、大肠杆菌以及嗜热 细菌中获得了PPase的cDNA克隆。PPase在催化反应中，需要结合三或四个2价金属阳离子， 例如二价镁离子(Mg2+)。PPase在体外具有增强DNA聚合酶的扩增效率以及增强RNA聚合酶在 体外转录反应中的产量的功能。除此之外，PPase在焦磷酸测序等DNA测序技术中发挥重要 作用。
焦磷酸测序技术(Pyrosequencing)是利用生物发光反应进行序列测定的新一代 测序技术。其基本原理为：在每一轮测序反应中，只加入四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)中的 一种，若该dNTP能够与DNA模板的下一个碱基配对，则会在DNA聚合酶的催化下，将其掺入到 测序引物链的3’末端，同时释放出一分子的PPi；在ATP硫酸化酶的作用下，生成的PPi可以 和5’-磷酰硫酸(Adenosine-5’-phosphosulfat，APS)结合形成等量的腺嘌呤核苷三磷酸 (ATP)；生成的ATP在荧光素酶的催化下，可以和荧光素结合形成氧化荧光素，同时产生可见 光，通过微弱光检测装置及处理软件可获得一个特异的检测峰，峰值的高低则和相匹配的 碱基数成正比；如果加入的dNTP不能和DNA模板的下一个碱基配对，则上述反应不会发生， 也就没有检测峰；反应体系中剩余的dNTP和残留的少量ATP在三磷酸腺苷双磷酸酶 (Apyrase)的作用下发生降解；待上一轮反应完成后，加入另一种dNTP，使上述反应重复进 行，根据获得的峰值图即可读取准确的DNA序列信息。近年来出现了一种高通量光导纤维微 反应池阵列焦磷酸测序技术，该技术一次可以测定上百万个样品，其出现带来了测序技术 的革命，极大地推动了后基因组计划的发展。在上述高通量焦磷酸测序技术中，除了DNA聚 合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶以外，PPase是另一个重要用酶，其作 用是通过清除多余的PPi来减少每一轮碱基加入期间反应仓微孔之间的交叉干扰，并且能 够降低测序反应中的背景噪音。
用于高通量焦磷酸测序技术的PPase通常是被生物素化修饰的，以便于将其通过 链亲合素固定于测序微球表面。尽管已有许多针对不同酶蛋白的储存试剂或保护试剂被公 开或被商业化利用，但目前并没有专门针对生物素化PPase的储存试剂。众所周知，每种酶 蛋白的催化特性不同，因此在不同的储存试剂中活性的稳定性也不同。对于焦磷酸测序反 应而言，PPase的酶活直接影响到测序反应中背景噪音的强弱和测序的精确性。储存试剂的 优劣直接影响PPase在在储存、运输和销售过程中的稳定性，因而间接影响焦磷酸测序的精 确性。
综上所述，开发一种专门针对生物素化PPase的储存试剂，最大可能保证其在储 存、运输和销售过程中的稳定性，是其在工业化生产以及实际应用中亟待解决的问题。
发明内容
本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技 术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
本发明要解决的一个问题是提供一种生物素化无机焦磷酸酶的储存试剂，该储存 试剂包括以下组分：pH8.5的Tris-HCl60～90mM、氯化钙25～75mM、氯化镁25～75mM、乙二醇 20～35％(v/v)和DTT2～4mM；溶剂为去离子水。
上述储存试剂中，Tris-HCl的浓度优选为65～85mM；进一步优选为70～80mM；再一 步优选为72～78mM。
上述储存试剂中，氯化钙的浓度为优选为25～60mM；进一步优选为30～50mM；再一 步优选为40～45mM。
上述储存试剂中，氯化镁的浓度为优选为25～50mM；进一步优选为25～40mM；再一 步优选为25～35mM。
上述储存试剂中，乙二醇的浓度优选为20～30％(v/v)；进一步优选为22～28％ (v/v)；再一步优选为26～28％(v/v)。
上述储存试剂中，DTT的浓度优选为2.2～3.6mM；进一步优选为2.6～3.4mM；再一 步优选为2.8～3.2mM。
在某些优选的实施方案中，所述的生物素化无机焦磷酸酶的储存试剂中还包括： 硫代硫酸钠、蔗糖酯和羧甲基壳聚糖中的一种或多种。
所述的硫代硫酸钠的浓度为2～5mM；优选为2～4mM；进一步优选为2～3mM。
所述的蔗糖酯的浓度为20～45mM；优选为25～40mM；进一步优选为30～38mM；再一 步优选为32～36mM。
所述的羧甲基壳聚糖的浓度为15～35mM；优选为15～30mM；进一步优选为17～ 25mM；再一步优选为18～20mM。
本发明要解决的另一个问题是提供上述生物素化无机焦磷酸酶的储存试剂的使 用方法：使用时，将所述的储存试剂、生物素化无机焦磷酸酶和甘油按照1:3:3的体积比混 合均匀。
本发明的有益效果：
本发明提供的生物素化无机焦磷酸酶储存试剂，对生无机焦磷酸酶活性有保护作 用，使得生物素化无机焦磷酸酶在-80℃、-20℃和4℃下放置3个月，活性几乎不变；在-80 ℃、-20℃和4℃下放置6个月，能够维持>97％的残余活力。此外，在25℃、30℃和35℃下放置 12h，活性几乎不变；在25℃、30℃和35℃下放置48h，能够维持>96％的残余活力。本发明提 供的生物素化无机焦磷酸酶储存试剂在以上各个储存条件下对无机焦磷酸酶的活性保护 均优于常规50％甘油的储存条件。
加入本发明提供的储存试剂后，生物素化无机焦磷酸酶在冻融3次和6次后，活性 不变；在冻融9次后，均能够维持>96％的残余活力；在冻融15次后，均能够维持>92％的残余 活力。而在50％甘油中，生物素化无机焦磷酸酶在反复冻融15次后，仅剩22.9％的残余活 力；不加任何试剂的生物素化无机焦磷酸酶在反复冻融15次后，仅剩9.7％的残余活力。
加入本发明提供的储存试剂后，生物素化无机焦磷酸酶在反复冻融9次和15次后， 分别仅有2.7％和3.1％左右的酶蛋白上的生物素标签脱落。而在50％甘油中，在反复冻融6 次、9次和15次后，分别有7.9％、9.2％和11.6％的酶蛋白上的生物素标签脱落。
综上所述，本发明提供的储存试剂对生无机焦磷酸酶活性有保护作用，能够延长 生物素化无机焦磷酸酶的储存时间，减少反复冻融对其活性的影响；还能够有效减少无机 焦磷酸酶上生物素标签的脱落。
具体实施方式
如无特殊说明，本发明涉及的化学或生物试剂均购自Sigma-Aldrich公司；分光光 度计购自上海谱元仪器有限公司，型号为Alpha1506。
实施例1一种生物素化无机焦磷酸酶的储存试剂
包括以下组分：pH8.5的Tris-HCl90mM、氯化钙75mM、氯化镁75mM、乙二醇35％(v/ v)和DTT4mM；溶剂为去离子水。
实施例2一种生物素化无机焦磷酸酶的储存试剂
包括以下组分：pH8.5的Tris-HCl85mM、氯化钙60mM、氯化镁50mM、乙二醇30％(v/ v)和DTT3.6mM；溶剂为去离子水。
实施例3一种生物素化无机焦磷酸酶的储存试剂
包括以下组分：pH8.5的Tris-HCl80mM、氯化钙50mM、氯化镁40mM、乙二醇28％(v/ v)和DTT3.4mM；溶剂为去离子水。
实施例4一种生物素化无机焦磷酸酶的储存试剂
包括以下组分：pH8.5的Tris-HCl78mM、氯化钙45mM、氯化镁35mM、乙二醇26％(v/ v)、DTT3.2mM和硫代硫酸钠5mM；溶剂为去离子水。
实施例5一种生物素化无机焦磷酸酶的储存试剂
包括以下组分：pH8.5的Tris-HCl72mM、氯化钙40mM、氯化镁25mM、乙二醇22％(v/ v)、DTT2.8mM和硫代硫酸钠4mM；溶剂为去离子水。
实施例6一种生物素化无机焦磷酸酶的储存试剂
包括以下组分：pH8.5的Tris-HCl76mM、氯化钙43mM、氯化镁32mM、乙二醇27％(v/ v)、DTT3.0mM和蔗糖酯45mM；溶剂为去离子水。
实施例7一种生物素化无机焦磷酸酶的储存试剂
包括以下组分：pH8.5的Tris-HCl77mM、氯化钙41mM、氯化镁33mM、乙二醇30％(v/ v)、DTT2.0mM和蔗糖酯40mM；溶剂为去离子水。
实施例8一种生物素化无机焦磷酸酶的储存试剂
包括以下组分：pH8.5的Tris-HCl77mM、氯化钙41mM、氯化镁33mM、乙二醇30％(v/ v)、DTT2.0mM和羧甲基壳聚糖35mM；溶剂为去离子水。
实施例9一种生物素化无机焦磷酸酶的储存试剂
包括以下组分：pH8.5的Tris-HCl76mM、氯化钙43mM、氯化镁32mM、乙二醇27％(v/ v)、DTT3.0mM和羧甲基壳聚糖30mM；溶剂为去离子水。
实施例10一种生物素化无机焦磷酸酶的储存试剂
包括以下组分：pH8.5的Tris-HCl70mM、氯化钙30mM、氯化镁30mM、乙二醇20％(v/ v)、DTT2.6mM、硫代硫酸钠3mM和蔗糖酯38mM；溶剂为去离子水。
实施例11一种生物素化无机焦磷酸酶的储存试剂
包括以下组分：pH8.5的Tris-HCl65mM、氯化钙25mM、氯化镁40mM、乙二醇26％(v/ v)、DTT2.2mM、硫代硫酸钠2mM和蔗糖酯36mM；溶剂为去离子水。
实施例12一种生物素化无机焦磷酸酶的储存试剂
包括以下组分：pH8.5的Tris-HCl60mM、氯化钙50mM、氯化镁30mM、乙二醇25％(v/ v)、DTT3.0mM、硫代硫酸钠2.5mM和羧甲基壳聚糖25mM；溶剂为去离子水。
实施例13一种生物素化无机焦磷酸酶的储存试剂
包括以下组分：pH8.5的Tris-HCl70mM、氯化钙55mM、氯化镁45mM、乙二醇35％(v/ v)、DTT3.5mM、硫代硫酸钠3.5mM和羧甲基壳聚糖20mM；溶剂为去离子水。
实施例14一种生物素化无机焦磷酸酶的储存试剂
包括以下组分：pH8.5的Tris-HCl75mM、氯化钙65mM、氯化镁25mM、乙二醇20％(v/ v)、DTT2.0mM、蔗糖酯32mM和羧甲基壳聚糖18mM；溶剂为去离子水。
实施例15一种生物素化无机焦磷酸酶的储存试剂
包括以下组分：pH8.5的Tris-HCl83mM、氯化钙70mM、氯化镁25mM、乙二醇20％(v/ v)、DTT2.0mM、蔗糖酯30mM和羧甲基壳聚糖17mM；溶剂为去离子水。
实施例16一种生物素化无机焦磷酸酶的储存试剂
包括以下组分：pH8.5的Tris-HCl65mM、氯化钙40mM、氯化镁30mM、乙二醇30％(v/ v)、DTT3.0mM、硫代硫酸钠3mM、蔗糖酯25mM和羧甲基壳聚糖18mM；溶剂为去离子水。
实施例17一种生物素化无机焦磷酸酶的储存试剂
包括以下组分：pH8.5的Tris-HCl80mM、氯化钙45mM、氯化镁35mM、乙二醇30％(v/ v)、DTT3.2mM、硫代硫酸钠4mM、蔗糖酯20mM和羧甲基壳聚糖15mM；溶剂为去离子水。
实施例18一种生物素化无机焦磷酸酶的储存试剂
包括以下组分：pH8.5的Tris-HCl60mM、氯化钙25mM、氯化镁25mM、乙二醇20％(v/ v)、DTT2mM、硫代硫酸钠5mM、蔗糖酯45mM和羧甲基壳聚糖35mM；溶剂为去离子水。
实施例19一种生物素化无机焦磷酸酶的储存试剂
包括以下组分：pH8.5的Tris-HCl90mM、氯化钙75mM、氯化镁75mM、乙二醇35％(v/ v)、DTT4mM、硫代硫酸钠2mM、蔗糖酯20mM和羧甲基壳聚糖15mM；溶剂为去离子水。
实验例1储存试剂对生物素化无机焦磷酸酶活性的保护作用
无机焦磷酸酶的活力测定：
显色剂配制：将13g钼酸铵溶解于100mL去离子水中，得到溶液A；将0.35g酒石酸锑 氧钾溶解于100mL去离子水中，得到溶液B；将溶液A、溶液B和硫酸溶液按3:3:1的体积比混 合均匀，得到显色剂。
测活标准曲线的绘制：配制不同浓度的磷酸根离子(PO43-)标准溶液：0mM、 0.008mM、0.012mM、0.016Mm、0.024mM、0.032mM；分别向上述标准溶液中加入终浓度为0.2％ (w/v)的抗坏血酸，反应30s；加入4％(v/v)的显色剂混合均匀后，放置15min；在分光光度计 中于700nm下测定吸光度A700。以吸光度A700对磷酸根离子浓度作图，绘制测活标准曲线。
活性测定方法：将待测样品加入500μL测活反应液中(100mMpH8.0的Tris-HCl+ 3mMMgCl2+100mMPPi)反应2min；以柠檬酸终止反应后，加入终浓度为0.2％(w/v)的抗坏 血酸，反应30s；加入4％(v/v)的显色剂混合均匀后，放置15min；在分光光度计中于700nm下 测定吸光度，并通过标准曲线计算生成的磷酸根(PO43-)的浓度。以每分钟生成磷酸根 (PO43-)的速度表征无焦磷酸酶的活性。
将实施例1-19所述的储存试剂按照以下体积比混合均匀，并将所得的酶液分别编 号为样品1-19，储存试剂：生物素化无机焦磷酸酶：甘油＝1:3:3；将生物素化无机焦磷酸酶 储存在50％的甘油中得到的酶液编号为样品20。
将样品1-20分别于-80℃、-20℃和4℃放置3、6、12个月，于25℃、30℃和35℃下放 置12、24、48h。测定放置前和放置后的生物素化无机焦磷酸酶活性，按下式计算残余活力 ar：
ar(％)＝放置后活性/放置前活性×100％
实验结果见下表：
表1生物素化无机焦磷酸酶在不同储存试剂中的活性
实验例2储存试剂减少反复冻融对生物素化无机焦磷酸酶活性的影响
将不加任何保护剂的生物素化无机焦磷酸酶编号为样品21，将样品21和实验例中 的样品1-20分别反复冻融3、6、9、15次后，测定残余活力ar。残余活力计算公式为ar(％)＝冻 融n次后的活性/冻融0次的活性×100％(其中n＝3、6、9或15)；无机焦磷酸酶活性测定方法 同实验例1。
实验结果见下表
表2反复冻融对生物素化无机焦磷酸酶活性的影响