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1、(10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201410090201.5 (22)申请日 2014.03.12 C07D 491/107(2006.01) C09K 11/06(2006.01) G01N 21/64(2006.01) (73)专利权人 西安交通大学 地址 710049 陕西省西安市碑林区咸宁西路 28 号 (72)发明人 张祯 邓成权 孟列素 颜晓梅 (74)专利代理机构 西安通大专利代理有限责任 公司 61200 代理人 陆万寿 CN 101302220 A,2008.11.12, 权利要求 1， 实施例 1、 3-4. WO 2005102176 A1,200。
2、5.11.03, 全文 . CN 101870864 A,2010.10.27, 全文 . CN 102093372 A,2011.06.15, 全文 . CN 102746313 A,2012.10.24, 全文 . CN 103571457 A,2014.02.12, 全文 . Shyamaprosad Goswami 等 .CHEF induced highly selective and sensitive turn-on fluorogenic and colorimetric sensor for Fe3+.Dalton Transactions .2013, 第 42 卷 ( 第。
3、 42 期 ), 第 15113-15119 页 . Shyamaprosad Goswami 等 .A highly selective and sensitive probe for colorimetric and fluorogenic detection of Cd2+ in aqueous media.Analyst .2013, 第 138 卷 ( 第 6 期 ), 第 1903-1907 页 . Lin Yuan 等 .A fast-responsive fluorescent probe for detection of gold ions in water and synt。
4、hetic products. Chemical Communications .2011, 第 47 卷 ( 第 16 期 ), 第 4703-4705 页 . Zhen Zhang 等 .Sensitive and selective offon rhodamine hydrazide fluorescent chemosensor for hypochlorous acid detection and bioimaging.Talanta .2011, 第 85 卷 ( 第 1 期 ), 第 779-786 页， 尤其 Scheme 2， 第 780 页左 栏第1段、 右栏末段， 第78。
5、1页第2.4节， Fig.1-3. (54) 发明名称 罗丹明 6G 酰肼衍生物、 其制备方法、 应用及 作为荧光探针对次氯酸进行荧光分析的方法 (57) 摘要 本发明公开了一种罗丹明 6G 酰肼衍生物、 其 制备方法、 应用及作为荧光探针对次氯酸进行荧 光分析的方法， 该罗丹明 6G 酰肼衍生物可选择性 地与次氯酸发生反应， 快速产生明显的荧光增强 效应。本发明可以在水中和细胞内实现对微量次 氯酸的高灵敏性和高选择性的定量检测， 在环境 和生物等领域有广泛的应用前景。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 李军勇 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书。
6、2页 说明书9页 附图3页 CN 103880853 B 2016.06.29 CN 103880853 B 1.一种罗丹明6G酰肼衍生物， 其特征在于， 所述罗丹明6G酰肼衍生物的化学结构为 2.一种罗丹明6G酰肼衍生物的制备方法， 其特征在于， 包括以下步骤： 1)称取一定量的罗丹明6G、 乙醇以及质量浓度为80的肼一水化合物， 并将罗丹明6G 溶解于乙醇中， 再逐滴加入肼一水化合物， 然后经回流及过滤后得沉淀， 洗涤及干燥后， 得 粉红色固体的罗丹明6G酰肼， 其中罗丹明6G、 乙醇及肼一水化合物的比例为1.0g： 20-30mL： 2-4mL； 2)称取一定量的1萘甲酰氯及乙腈， 然后。
7、将1萘甲酰氯溶解到乙腈中， 得1萘甲酰氯 的乙腈溶液， 其中1萘甲酰氯的乙腈溶液中1萘甲酰氯与乙腈的比例为76-115 L： 10- 15mL； 3)称取一定量的罗丹明6G酰肼及乙腈， 然后将罗丹明6G酰肼溶解到乙腈中， 得罗丹明 6G酰肼的乙腈溶液， 其中罗丹明6G酰肼的乙腈溶液中罗丹明6G酰肼与乙腈的比例为0.21g： 15-25mL； 4)将步骤2)得到的1萘甲酰氯的乙腈溶液逐滴加入到步骤3)得到的罗丹明6G酰肼的 乙腈溶液中， 其中罗丹明6G酰肼与1萘甲酰氯的物质的量的比为1： 1-1.5， 并在温度为40- 60的条件下搅拌反应， 然后冷却至室温， 并去除溶剂， 再经柱层析洗脱后得粉。
8、红色固体的 罗丹明6G酰肼衍生物； 罗丹明6G酰肼衍生物的化学结构为 步骤1)回流时间为2-4h； 步骤4)搅拌时间为4-8h； 步骤4)柱层析洗脱的具体过程为以沸点为60-90的石油醚及乙酸乙酯的混合物为洗 脱剂进行洗脱， 其中石油醚与乙酸乙酯的体积比为5:1-3:2。 3.如权利要求1所述的罗丹明6G酰肼衍生物作为对次氯酸进行荧光分析的荧光探针的 应用。 4.一种罗丹明6G酰肼衍生物作为荧光探针对次氯酸进行荧光分析的方法， 基于权利要 求1所述的罗丹明6G酰肼衍生物， 其特征在于， 包括以下步骤： 1)称取一定量的罗丹明6G酰肼衍生物及乙醇， 然后将罗丹明6G酰肼衍生物溶解到乙醇 中， 得。
9、罗丹明6G酰肼衍生物的乙醇溶液， 其中罗丹明6G酰肼衍生物的乙醇溶液中罗丹明6G 酰肼衍生物的溶度为0.1-1.0mM； 权利要求书 1/2 页 2 CN 103880853 B 2 2)将相同体积的N份步骤1)得到的罗丹明6G酰肼衍生物的乙醇溶液分别放置于N个离 心管中， 然后给N个离心管中分别加入N组不同体积的次氯酸钠标准溶液， 再通过磷酸盐缓 冲溶液定容， 得N组混合溶液， 其中， N组混合溶液中罗丹明6G酰肼衍生物的浓度为10-50 M， N组混合溶液中罗丹明6G酰肼衍生物与次氯酸的物质的量的比为1： 0.05-3.5， N为正整数， 然后再将得到的N组混合溶液放置到室温环境中， 待其。
10、反应完成后， 将N组反应完成后的混 合溶液分别放置到石英比色皿中， 设置激发和发射狭缝宽度为2.5-5.0nm， 光电倍增管电压 为700V， 用480-510nm范围的波长激发， 测得N组荧光发射光谱， 然后再根据测得的N组荧光 发射光谱对次氯酸进行荧光分析； 步骤2)磷酸盐缓冲溶液的浓度为10-100mM， pH值为7.0-7.4； 步骤2)室温反应时间为2-10min。 权利要求书 2/2 页 3 CN 103880853 B 3 罗丹明6G酰肼衍生物、 其制备方法、 应用及作为荧光探针对次 氯酸进行荧光分析的方法 技术领域 0001 本发明涉及一种检测次氯酸的衍生物、 其制备方法、 应。
11、用及检测方法， 具体涉及一 种罗丹明6G酰肼衍生物、 其制备方法、 应用及作为荧光探针对次氯酸进行荧光分析的方法。 背景技术 0002 次氯酸(HOCl)是一种强氧化剂， 能够在环境水处理过程中和活性生物体内起到抗 菌作用。 在日常生活中， 次氯酸因为杀菌效果好、 价格低廉和使用方便， 已被广泛地用作自 来水消毒剂。 但是高浓度的次氯酸溶液刺激性强， 伤害呼吸系统， 易与水中有机物反应生成 氯仿、 四氯化碳等严重致癌物质， 对人类的健康存在着潜在的危害。 在生物体内， 次氯酸是 一类重要的活性氧物种(ROS)， 在许多具有重要生理学和生物学意义的过程中起着关键性 的作用。 但是过量次氯酸的形成。
12、会诱发组织损伤， 引起动脉硬化、 关节炎甚至癌症等系列疾 病的产生。 因此， 发展具有高灵敏性和高选择性的分析试剂和检测方法， 用于环境和生物体 内次氯酸的检测， 具有十分重要的应用价值。 0003 目前， 检测次氯酸的方法主要有硫代硫酸钠滴定法(HG/T2498-93)、 邻联甲苯胺比 色法(GB5750-85)和四甲基联苯胺(TMB)比色法等。 这些试剂选择性差， 易受干扰， 在应用方 面有很大限制。 另外， 近年来发展的若干有机荧光探针对次氯酸检测显示出较好的灵敏性、 选择性和生物相容性(Org.Lett.2013， 15： 878-881； J.Am.Chem.Soc.2012， 13。
13、4： 1200-1211； Chem .Eur .J .2012， 18： 2700-2706； J .Am .Chem .Soc .2011， 133： 5680-5682； Chem.Commun.2011， 47： 12691-12693)。 但是， 这些试剂的合成过程工序繁琐、 技术复杂， 制 约了它们在环境分析和生物分析中的实际应用。 发明内容 0004 本发明的目的在于克服上述现有技术的缺点， 提供了一种罗丹明6G酰肼衍生物、 其制备方法、 应用及作为荧光探针对次氯酸进行荧光分析的方法， 该罗丹明6G酰肼衍生物 可以有效对次氯酸进行检测。 0005 为 达 到 上 述目 的 ， 本。
14、 发 明 所 述的 罗丹 明 6 G 酰 肼 衍 生 物的 化 学 结 构 为 0006 相应的， 本发明所述的罗丹明6G酰肼衍生物的制备方法包括以下步骤： 0007 1)称取一定量的罗丹明6G、 乙醇以及质量浓度为80的肼一水化合物， 并将罗丹 明6G溶解于乙醇中， 再逐滴加入肼一水化合物， 然后经回流及过滤后得沉淀， 洗涤及干燥 说明书 1/9 页 4 CN 103880853 B 4 后， 得粉红色固体的罗丹明6G酰肼， 其中罗丹明6G、 乙醇及肼一水化合物的比例为1.0g20- 30mL2-4mL； 0008 2)称取一定量的1-萘甲酰氯及乙腈， 然后将1-萘甲酰氯溶解到乙腈中， 得1。
15、-萘甲 酰氯的乙腈溶液， 其中1-萘甲酰氯的乙腈溶液中1-萘甲酰氯与乙腈的比例为76-115 L10- 15mL； 0009 3)称取一定量的罗丹明6G酰肼及乙腈， 然后将罗丹明6G酰肼溶解到乙腈中， 得罗 丹明6G酰肼的乙腈溶液， 其中罗丹明6G酰肼的乙腈溶液中罗丹明6G酰肼与乙腈的比例为 0.21g15-25mL； 0010 4)将步骤2)得到的1-萘甲酰氯的乙腈溶液逐滴加入到步骤3)得到的罗丹明6G酰 肼的乙腈溶液中， 其中罗丹明6G酰肼与1-萘甲酰氯的物质的量的比为11-1.5， 并在温度为 40-60的条件下搅拌反应， 然后冷却至室温， 并去除溶剂， 再经柱层析洗脱后得粉红色固 体的。
16、罗丹明6G酰肼衍生物。 0011 步骤1)回流时间为2-4h； 0012 步骤4)搅拌时间为4-8h； 0013 步骤4)柱层析洗脱的具体过程为以沸点为60-90的石油醚及乙酸乙酯的混合物 为洗脱剂进行洗脱， 其中石油醚与乙酸乙酯的体积比为51-32。 0014 所述的罗丹明6G酰肼衍生物作为对次氯酸进行荧光分析的荧光探针的应用。 0015 相应的， 本发明所述的罗丹明6G酰肼衍生物作为荧光探针对次氯酸进行荧光分析 的方法包括以下步骤： 0016 1)称取一定量的罗丹明6G酰肼衍生物及乙醇， 然后将罗丹明6G酰肼衍生物溶解到 乙醇中， 得罗丹明6G酰肼衍生物的乙醇溶液， 其中罗丹明6G酰肼衍生。
17、物的乙醇溶液中罗丹 明6G酰肼衍生物的溶度为0.1-1.0mM； 0017 2)将相同体积的N份步骤1)得到的罗丹明6G酰肼衍生物的乙醇溶液分别放置于N 个离心管中， 然后给N个离心管中分别加入N组不同体积的次氯酸钠标准溶液， 再通过磷酸 盐缓冲溶液定容， 得N组混合溶液， 其中， N组混合溶液中罗丹明6G酰肼衍生物的浓度均为 10-50 M， N组混合溶液中罗丹明6G酰肼衍生物与次氯酸的物质的量的比均为10.05-3.5， N 为正整数， 然后再将得到的N组混合溶液放置到室温环境中， 待其反应完成后， 将N组反应完 成后的混合溶液分别放置到石英比色皿中， 设置激发和发射狭缝宽度为2.5-5.。
18、0nm， 光电倍 增管电压为700V， 用480-510nm范围的波长激发， 测得N组荧光发射光谱， 然后再根据测得的 N组荧光发射光谱对次氯酸进行荧光分析。 0018 步骤2)磷酸盐缓冲溶液的浓度为10-100mM， pH值为7.0-7.4； 0019 步骤2)室温反应时间为2-10min。 0020 本发明具有以下有益效果： 0021 本发明制备的罗丹明6G酰肼衍生物可以选择性的与次氯酸发生反应， 产生明显的 荧光增强效应； 反应速度快， 短时间内即可显示出强烈的荧光， 并且荧光检测信号十分稳 定； 灵敏度高， 当次氯酸浓度为0.05 M时也能产生明显的荧光响应； 具有很高的选择性， 仅 。
19、在次氯酸存在的条件下， 该罗丹明6G酰肼衍生物显示明显的荧光信号， 其他常见的金属离 子和活性物种均不产生干扰。 本发明提供的荧光探针合成方法简单便捷， 适用于水中和细 胞内微量次氯酸的高灵敏性和高选择性的荧光检测， 在环境和生物等领域有广泛的应用前 说明书 2/9 页 5 CN 103880853 B 5 景。 附图说明 0022 图1为本发明中实施例六得到的荧光发射光谱； 0023 图2为本发明中罗丹明6G酰肼衍生物与次氯酸的反应体系的荧光强度对次氯酸浓 度的工作曲线； 0024 图3为本发明中罗丹明6G酰肼衍生物与次氯酸的反应体系的荧光强度对反应时间 的工作曲线； 0025 图4为本发明。
20、中罗丹明6G酰肼衍生物对次氯酸和各种常见金属离子的荧光响应强 度； 0026 图5为本发明中罗丹明6G酰肼衍生物对次氯酸和各种常见活性物种的荧光响应强 度； 0027 图6为本发明中罗丹明6G酰肼衍生物对A549细胞中次氯酸的共聚焦荧光成像。 具体实施方式 0028 下面结合附图对本发明做进一步详细描述： 0029本发明所述的罗丹明6G酰肼衍生物的化学结构为 0030 以下将结合实施例来说明罗丹明6G酰肼衍生物的制备方法。 0031 实施例一 0032 本发明所述的罗丹明6G酰肼衍生物的制备方法包括以下步骤： 0033 1)称取一定量的罗丹明6G、 乙醇以及质量浓度为80的肼一水化合物， 并将。
21、罗丹 明6G溶解于乙醇中， 再逐滴加入肼一水化合物， 然后经回流及过滤后得沉淀， 洗涤及干燥 后， 得粉红色固体的罗丹明6G酰肼， 其中罗丹明6G、 乙醇及肼一水化合物的比例为1.0g 20mL3mL； 0034 2)称取一定量的1-萘甲酰氯及乙腈， 然后将1-萘甲酰氯溶解到乙腈中， 得1-萘甲 酰氯的乙腈溶液， 其中1-萘甲酰氯的乙腈溶液中1-萘甲酰氯与乙腈的比例为100 L15mL； 0035 3)称取一定量的罗丹明6G酰肼及乙腈， 然后将罗丹明6G酰肼溶解到乙腈中， 得罗 丹明6G酰肼的乙腈溶液， 其中罗丹明6G酰肼的乙腈溶液中罗丹明6G酰肼与乙腈的比例为 0.21g15mL； 0036。
22、 4)将步骤2)得到的1-萘甲酰氯的乙腈溶液逐滴加入到步骤3)得到的罗丹明6G酰 肼的乙腈溶液中， 其中罗丹明6G酰肼与1-萘甲酰氯的物质的量的比为11.3， 并在温度为40 的条件下搅拌反应， 然后冷却至室温， 并去除溶剂， 再经柱层析洗脱后得粉红色固体的罗 丹明6G酰肼衍生物。 0037 步骤1)回流时间为2.5h； 说明书 3/9 页 6 CN 103880853 B 6 0038 步骤4)搅拌时间为8h； 0039 步骤4)柱层析洗脱的具体过程为以沸点为60-90的石油醚及乙酸乙酯的混合物 为洗脱剂进行洗脱， 其中石油醚与乙酸乙酯的体积比为51。 0040 实施例二 0041 本发明所。
23、述的罗丹明6G酰肼衍生物的制备方法包括以下步骤： 0042 1)称取一定量的罗丹明6G、 乙醇以及质量浓度为80的肼一水化合物， 并将罗丹 明6G溶解于乙醇中， 再逐滴加入肼一水化合物， 然后经回流及过滤后得沉淀， 洗涤及干燥 后， 得粉红色固体的罗丹明6G酰肼， 其中罗丹明6G、 乙醇及肼一水化合物的比例为1.0g 30mL2mL； 0043 2)称取一定量的1-萘甲酰氯及乙腈， 然后将1-萘甲酰氯溶解到乙腈中， 得1-萘甲 酰氯的乙腈溶液， 其中1-萘甲酰氯的乙腈溶液中1-萘甲酰氯与乙腈的比例为90 L13mL； 0044 3)称取一定量的罗丹明6G酰肼及乙腈， 然后将罗丹明6G酰肼溶解到。
24、乙腈中， 得罗 丹明6G酰肼的乙腈溶液， 其中罗丹明6G酰肼的乙腈溶液中罗丹明6G酰肼与乙腈的比例为 0.21g20mL； 0045 4)将步骤2)得到的1-萘甲酰氯的乙腈溶液逐滴加入到步骤3)得到的罗丹明6G酰 肼的乙腈溶液中， 其中罗丹明6G酰肼与1-萘甲酰氯的物质的量的比为11.5， 并在温度为50 的条件下搅拌反应， 然后冷却至室温， 并去除溶剂， 再经柱层析洗脱后得粉红色固体的罗 丹明6G酰肼衍生物。 0046 步骤1)回流时间为4h； 0047 步骤4)搅拌时间为6h； 0048 步骤4)柱层析洗脱的具体过程为以沸点为60-90的石油醚及乙酸乙酯的混合物 为洗脱剂进行洗脱， 其中石。
25、油醚与乙酸乙酯的体积比为21。 0049 实施例三 0050 本发明所述的罗丹明6G酰肼衍生物的制备方法包括以下步骤： 0051 1)称取一定量的罗丹明6G、 乙醇以及质量浓度为80的肼一水化合物， 并将罗丹 明6G溶解于乙醇中， 再逐滴加入肼一水化合物， 然后经回流及过滤后得沉淀， 洗涤及干燥 后， 得粉红色固体的罗丹明6G酰肼， 其中罗丹明6G、 乙醇及肼一水化合物的比例为1.0g 25mL4mL； 0052 2)称取一定量的1-萘甲酰氯及乙腈， 然后将1-萘甲酰氯溶解到乙腈中， 得1-萘甲 酰氯的乙腈溶液， 其中1-萘甲酰氯的乙腈溶液中1-萘甲酰氯与乙腈的比例为115 L11mL； 00。
26、53 3)称取一定量的罗丹明6G酰肼及乙腈， 然后将罗丹明6G酰肼溶解到乙腈中， 得罗 丹明6G酰肼的乙腈溶液， 其中罗丹明6G酰肼的乙腈溶液中罗丹明6G酰肼与乙腈的比例为 0.21g25mL； 0054 4)将步骤2)得到的1-萘甲酰氯的乙腈溶液逐滴加入到步骤3)得到的罗丹明6G酰 肼的乙腈溶液中， 其中罗丹明6G酰肼与1-萘甲酰氯的物质的量的比为11.2， 并在温度为55 的条件下搅拌反应， 然后冷却至室温， 并去除溶剂， 再经柱层析洗脱后得粉红色固体的罗 丹明6G酰肼衍生物。 0055 步骤1)回流时间为2h； 0056 步骤4)搅拌时间为5h； 说明书 4/9 页 7 CN 10388。
27、0853 B 7 0057 步骤4)柱层析洗脱的具体过程为以沸点为60-90的石油醚及乙酸乙酯的混合物 为洗脱剂进行洗脱， 其中石油醚与乙酸乙酯的体积比为32。 0058 实施例四 0059 本发明所述的罗丹明6G酰肼衍生物的制备方法包括以下步骤： 0060 1)称取一定量的罗丹明6G、 乙醇以及质量浓度为80的肼一水化合物， 并将罗丹 明6G溶解于乙醇中， 再逐滴加入肼一水化合物， 然后经回流及过滤后得沉淀， 洗涤及干燥 后， 得粉红色固体的罗丹明6G酰肼， 其中罗丹明6G、 乙醇及肼一水化合物的比例为1.0g 28mL2.5mL； 0061 2)称取一定量的1-萘甲酰氯及乙腈， 然后将1-。
28、萘甲酰氯溶解到乙腈中， 得1-萘甲 酰氯的乙腈溶液， 其中1-萘甲酰氯的乙腈溶液中1-萘甲酰氯与乙腈的比例为76 L10mL； 0062 3)称取一定量的罗丹明6G酰肼及乙腈， 然后将罗丹明6G酰肼溶解到乙腈中， 得罗 丹明6G酰肼的乙腈溶液， 其中罗丹明6G酰肼的乙腈溶液中罗丹明6G酰肼与乙腈的比例为 0.21g22mL； 0063 4)将步骤2)得到的1-萘甲酰氯的乙腈溶液逐滴加入到步骤3)得到的罗丹明6G酰 肼的乙腈溶液中， 其中罗丹明6G酰肼与1-萘甲酰氯的物质的量的比为11， 并在温度为60 的条件下搅拌反应， 然后冷却至室温， 并去除溶剂， 再经柱层析洗脱后得粉红色固体的罗丹 明6。
29、G酰肼衍生物。 0064 步骤1)回流时间为3h； 0065 步骤4)搅拌时间为4h； 0066 步骤4)柱层析洗脱的具体过程为以沸点为60-90的石油醚及乙酸乙酯的混合物 为洗脱剂进行洗脱， 其中石油醚与乙酸乙酯的体积比为52。 0067 对本发明所述的罗丹明6G酰肼衍生物分别进行核磁共振氢谱测定、 核磁共振碳谱 测定及高分辨质谱测定， 测定结果如下： 0068 核磁共振氢谱测定： 1HNMR(400MHz， CDCl3)， 6(ppm)： 8.04(m， 1H)， 7.80-7.67(m， 3H)， 7.54-7.49(m， 2H)， 7.43(m， 2H)， 7.34-7.32(m， 1。
30、H)， 7.12-7.07(m， 2H)， 6.54(s， 2H)， 6.36(s， 2H)， 3.56(br， 2H)， 3.18(q， J6.3Hz， 4H)， 3.0(br， 1H)， 1.91(s， 6H)， 1.28(t， J 7.0Hz， 6H)。 0069 核磁共振碳谱测定： 13CNMR(100MHz， CDCl3)， 6(ppm)： 167.0， 164.8， 152.3， 151.4， 147.6， 133.2， 132.0， 130.5， 130.2， 129.2， 128.4， 127.8， 127.0， 126.3， 125.5， 125.1， 124.4， 124.。
31、2， 123.5， 117.8， 104.7， 96.3， 66.3， 38.2， 29.6， 16.6， 14.7。 0070 高分辨质谱测定： HRMS(ESI)： m/zM+H+calcdforC37H35N4O3： 583.2709， Found： 583.2689。 0071 所述的罗丹明6G酰肼衍生物作为对次氯酸进行荧光分析的荧光探针的应用。 0072 以下将通过实施例来具体说明： 0073 实施例一 0074 本发明所述的罗丹明6G酰肼衍生物作为荧光探针对次氯酸进行荧光分析的方法 包括以下步骤： 0075 1)称取一定量的罗丹明6G酰肼衍生物及乙醇， 然后将罗丹明6G酰肼衍生物溶。
32、解到 乙醇中， 得罗丹明6G酰肼衍生物的乙醇溶液， 其中罗丹明6G酰肼衍生物的乙醇溶液中罗丹 说明书 5/9 页 8 CN 103880853 B 8 明6G酰肼衍生物的溶度为0.1mM； 0076 2)将相同体积的五份步骤1)得到的罗丹明6G酰肼衍生物的乙醇溶液分别放置于 五个离心管中， 然后给五个离心管中中分别加入五组不同体积的次氯酸钠标准溶液， 再通 过磷酸盐缓冲溶液定容， 得五组混合溶液， 其中， 五组混合溶液中罗丹明6G酰肼衍生物的浓 度均为10 M， 五组混合溶液中罗丹明6G酰肼衍生物与次氯酸的物质的量的比分别为1 0.05、 10.3、 10.8、 12.0及13.5， 然后再将。
33、得到的五组混合溶液放置到室温环境中， 待其 反应完成后， 将五组反应完成后的混合溶液分别放置到石英比色皿中， 设置激发和发射狭 缝宽度为5.0nm， 光电倍增管电压为700V， 用480nm的波长激发， 测得五组荧光发射光谱， 然 后再根据测得的五组荧光发射光谱对次氯酸进行荧光分析。 0077 步骤2)磷酸盐缓冲溶液的浓度为100mM， pH值为7.4； 0078 步骤3)室温反应时间为2min。 0079 实施例二 0080 本发明所述的罗丹明6G酰肼衍生物作为荧光探针对次氯酸进行荧光分析的方法 包括以下步骤： 0081 1)称取一定量的罗丹明6G酰肼衍生物及乙醇， 然后将罗丹明6G酰肼衍生。
34、物溶解到 乙醇中， 得罗丹明6G酰肼衍生物的乙醇溶液， 其中罗丹明6G酰肼衍生物的乙醇溶液中罗丹 明6G酰肼衍生物的溶度为0.4mM； 0082 2)将相同体积的八份步骤1)得到的罗丹明6G酰肼衍生物的乙醇溶液分别放置于 八个离心管中， 然后给八个离心管中分别加入八组不同体积的次氯酸钠标准溶液， 再通过 磷酸盐缓冲溶液定容， 得八组混合溶液， 其中， 八组混合溶液中罗丹明6G酰肼衍生物的浓度 均为30 M， 八组混合溶液中罗丹明6G酰肼衍生物与次氯酸的物质的量的比分别为10.05、 1 0.2、 10.3、 10.6、 10.8、 11.4、 12.0及13.5， 然后再将得到的八组混合溶液放。
35、置到室 温环境中， 待其反应完成后， 将八组反应完成后的混合溶液分别放置到石英比色皿中， 设置 激发和发射狭缝宽度为3nm， 光电倍增管电压为700V， 用490nm的波长激发， 测得八组荧光发 射光谱， 然后再根据测得的八组荧光发射光谱对次氯酸进行荧光分析。 0083 步骤2)磷酸盐缓冲溶液的浓度为80mM， pH值为7.3； 0084 步骤3)室温反应时间为3min。 0085 实施例三 0086 本发明所述的罗丹明6G酰肼衍生物作为荧光探针对次氯酸进行荧光分析的方法 包括以下步骤： 0087 1)称取一定量的罗丹明6G酰肼衍生物及乙醇， 然后将罗丹明6G酰肼衍生物溶解到 乙醇中， 得罗丹。
36、明6G酰肼衍生物的乙醇溶液， 其中罗丹明6G酰肼衍生物的乙醇溶液中罗丹 明6G酰肼衍生物的溶度为0.5mM； 0088 2)将相同体积的十份步骤1)得到的罗丹明6G酰肼衍生物的乙醇溶液分别放置于 十个离心管中， 然后给十个离心管中分别加入十组不同体积的次氯酸钠标准溶液， 再通过 磷酸盐缓冲溶液定容， 得十组混合溶液， 其中， 十组混合溶液中罗丹明6G酰肼衍生物的浓度 均为40 M， 十组混合溶液中罗丹明6G酰肼衍生物与次氯酸的物质的量的比均为10.05、 1 0.2、 10.3、 10.6、 10.8、 11.4、 12.0、 13.0、 13.2及13.5， 然后再将得到的十组混合溶 液放置。
37、到室温环境中， 待其反应完成后， 将十组反应完成后的混合溶液分别放置到石英比 说明书 6/9 页 9 CN 103880853 B 9 色皿中， 设置激发和发射狭缝宽度为3nm， 光电倍增管电压为700V， 用500nm的波长激发， 测 得十组荧光发射光谱， 然后再根据测得的十组荧光发射光谱对次氯酸进行荧光分析。 0089 步骤2)磷酸盐缓冲溶液的浓度为50mM， pH值为7.2； 0090 步骤3)室温反应时间为5min。 0091 实施例四 0092 本发明所述的罗丹明6G酰肼衍生物作为荧光探针对次氯酸进行荧光分析的方法 包括以下步骤： 0093 1)称取一定量的罗丹明6G酰肼衍生物及乙醇。
38、， 然后将罗丹明6G酰肼衍生物溶解到 乙醇中， 得罗丹明6G酰肼衍生物的乙醇溶液， 其中罗丹明6G酰肼衍生物的乙醇溶液中罗丹 明6G酰肼衍生物的溶度为1.0mM； 0094 2)将相同体积的十二份步骤1)得到的罗丹明6G酰肼衍生物的乙醇溶液分别放置 于十二个离心管中， 然后给十二个离心管中分别加入十二组不同体积的次氯酸钠标准溶 液， 再通过磷酸盐缓冲溶液定容， 得十二组混合溶液， 其中， 十二组混合溶液中罗丹明6G酰 肼衍生物的浓度均为50 M， 十二组混合溶液中罗丹明6G酰肼衍生物与次氯酸的物质的量的 比分别为10.05、 10.2、 10.3、 10.6、 10.8、 11.0、 11.4。
39、、 12.0、 12.5、 13.0、 13.2及1 3.5， 然后再将得到的十二组混合溶液放置到室温环境中， 待其反应完成后， 将十二组反应 完成后的混合溶液分别放置到石英比色皿中， 设置激发和发射狭缝宽度为2.5nm， 光电倍增 管电压为700V， 用510nm的波长激发， 测得十二组荧光发射光谱， 然后再根据测得的十二组 荧光发射光谱对次氯酸进行荧光分析。 0095 步骤2)磷酸盐缓冲溶液的浓度为10mM， pH值为7.0； 0096 步骤3)室温反应时间为10min。 0097 实施例五 0098 1)称取一定量的罗丹明6G酰肼衍生物及乙醇， 然后将罗丹明6G酰肼衍生物溶解到 乙醇中，。
40、 得罗丹明6G酰肼衍生物的乙醇溶液， 其中罗丹明6G酰肼衍生物的乙醇溶液中罗丹 明6G酰肼衍生物的溶度为1.0mM； 0099 2)将相同体积的十六份步骤1)得到的罗丹明6G酰肼衍生物的乙醇溶液分别放置 于十六个离心管中， 然后给十六个离心管中分别加入十六组不同体积的次氯酸钠标准溶 液， 再通过磷酸盐缓冲溶液定容， 得十六组混合溶液， 其中， 十六组混合溶液中罗丹明6G酰 肼衍生物的浓度均为50 M， 十六组混合溶液中罗丹明6G酰肼衍生物与次氯酸的物质的量的 比均为10.05、 10.1、 10.2、 10.3、 10.4、 10.6、 10.8、 11.0、 11.2、 11.4、 12.0。
41、、 1 2.2、 12.5、 13.0、 13.2及13.5， 然后再将得到的十六组混合溶液放置到室温环境中， 待 其反应完成后， 将十六组反应完成后的混合溶液分别放置到石英比色皿中， 设置激发和发 射狭缝宽度为5.0nm， 光电倍增管电压为700V， 用500nm的波长激发， 测得十六组荧光发射光 谱， 然后再根据测得的十六组荧光发射光谱对次氯酸进行荧光分析。 0100 步骤2)磷酸盐缓冲溶液的浓度为10mM， pH值为7.4； 0101 步骤2)室温反应时间为2min。 0102 实施例六 0103 1)称取一定量的罗丹明6G酰肼衍生物及乙醇， 然后将罗丹明6G酰肼衍生物溶解到 乙醇中， 。
42、得罗丹明6G酰肼衍生物的乙醇溶液， 其中罗丹明6G酰肼衍生物的乙醇溶液中罗丹 说明书 7/9 页 10 CN 103880853 B 10 明6G酰肼衍生物的溶度为1.0mM； 0104 2)将相同体积的二十份步骤1)得到的罗丹明6G酰肼衍生物的乙醇溶液分别放置 于二十个离心管中， 然后给二十个离心管中分别加入二十组不同体积的次氯酸钠标准溶 液， 再通过磷酸盐缓冲溶液定容， 得二十组混合溶液， 其中， 二十组混合溶液中罗丹明6G酰 肼衍生物的浓度均为10 M， 二十组混合溶液中罗丹明6G酰肼衍生物与次氯酸的物质的量的 比分别为10.05、 10.1、 10.15、 10.2、 10.3、 10。
43、.4、 10.6、 10.8、 11.0、 11.2、 11.4、 1 1.6、 11.8、 12.0、 12.2、 12.5、 12.8、 13.0、 13.2及13.5， 然后再将得到的二十组混 合溶液放置到室温环境中， 待其反应完成后， 将二十组反应完成后的混合溶液分别放置到 石英比色皿中， 设置激发和发射狭缝宽度为5.0hm， 光电倍增管电压为700V， 用500nm的波长 激发， 测得二十组荧光发射光谱， 然后再根据测得的二十组荧光发射光谱对次氯酸进行荧 光分析。 0105 步骤2)磷酸盐缓冲溶液的浓度为10mM， pH值为7.4； 0106 步骤2)室温反应时间为10min。 01。
44、07 经检测， 图1为实施例六中罗丹明6G酰肼衍生物与次氯酸的反应体系的荧光发射 光谱。 图2为次氯酸浓度在0.5-35 M范围内， 10 M罗丹明6G酰肼衍生物与次氯酸的反应体系 在550nm荧光发射波长处的荧光强度对次氯酸浓度的工作曲线。 图1和图2所示结果表明， 罗 丹明6G酰肼衍生物本身没有荧光， 但可以与次氯酸发生反应， 产生明显的荧光增强效应， 而 且具有长的荧光激发波长(500nm)和长的最大发射波长(550nm)； 当次氯酸浓度为0.5 M时 也能产生明显的荧光响应， 并且随着次氯酸浓度的提高， 反应体系的荧光强度逐渐增强。 使 用10 M罗丹明6G酰肼衍生物时， 550nm的。
45、荧光发射强度在0-25 M次氯酸浓度范围内呈线性 关系。 次氯酸浓度达到约30 M时， 550nm的荧光发射强度增加了1800倍并达到最大。 因此， 该 罗丹明6G酰肼衍生物对次氯酸具有很高的检测灵敏性。 0108 图3所示结果表明， 罗丹明6G酰肼衍生物与次氯酸反应速度快， 2min内即可显示出 强烈的荧光， 继而荧光信号在1h内基本保持不变。 因此， 罗丹明6G酰肼衍生物不仅本身具有 优良的光学稳定性， 而且该荧光探针能够迅速捕获次氯酸， 反应后也具有高的光稳定性。 荧 光探针背景信号和检测信号的稳定性确保了实验方法的准确性。 0109 罗丹明6G酰肼衍生物作为荧光探针对次氯酸和各种常见金。
46、属离子的选择性研究： 0110 将10 L浓度为1.0mM的罗丹明6G酰肼衍生物的乙醇溶液加入到离心管中， 再分别 加入适量的次氯酸钠标准溶液或各种金属离子的标准溶液， 使体系中次氯酸的浓度为2 M， 或者其他各种金属离子的浓度分别为Ca2+Cu2+400 M， Mg2+K+Na+Ni2 +Cr2+Hg2+500 M， Zn2+Mn2+Co2+Cd2+300 M， Fe3+200 M， Pb2 +100 M， 然后用浓度为10mM、 pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液定容到1mL， 在室温下含有次氯 酸的溶液反应2min， 其他含有金属离子的溶液反应10min， 再分别将样品放置于光径为 1.0em。
47、、 体积为1.0mL的石英比色皿中， 设置激发和发射狭缝宽度为5.0nm， 光电倍增管电压 为700V， 用500nm的波长激发， 测量其荧光发射光谱。 0111 图4为10 M罗丹明6G酰肼衍生物分别对浓度为2 M的次氯酸和各种不同浓度的常 见金属离子的荧光响应强度。 0112 罗丹明6G酰肼衍生物作为荧光探针对次氯酸和各种常见活性物种的选择性研究： 0113 各种活性物种按照下面的方法制备： 说明书 8/9 页 11 CN 103880853 B 11 0114 H2O2： H2O2标准溶液在室温下加入。 0115 ROO： 由2， 2 -偶氮(2-甲基丙基脒)二盐酸盐生成。 0116 N。
48、O： 由氰铁(III)硝酸钠二水化合物生成。 0117 O2-： 超氧化物从黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶体系产生。 黄嘌呤氧化酶先加入检测体 系， 待其溶解后， 溶解于1.6MNaOH溶液中的黄嘌呤储备液再加入。 0118 OH： 氯化亚铁加入10倍浓度的H2O2中。 0119 ONOO-： 含有0.01mol/L的羟胺、 0.8mol/L的氢氧化钠和0.001mol/L的EDTA在需氧 条件下剧烈搅拌4-5h， 之后加入少量的MnO2粉末以除去反应溶液中产生的H2O2。 溶液过滤后 保存在-18。 过氧亚硝酸盐的浓度通过在302nm的紫外吸收测量( 1670Lmol-1cm-1) (Talanta2。
49、002， 57： 883-890)。 0120 1O2： 由ONOO-和10倍浓度的H2O2制备(FEBSLett.1994， 355： 287-289)。 0121 HOCl： NaOCl标准溶液在室温下加入。 0122 将10 L浓度为1.0mM的罗丹明6G酰肼衍生物的乙醇溶液加入到离心管中， 再分别 加入适量的活性物种的标准溶液， 使体系中次氯酸的浓度为2 M， 或者其他各种活性物种的 浓度依次为10 M、 50 M和100 M， 然后用10mM磷酸盐(pH为7.4)缓冲溶液定容到1mL。 室温下 含有次氯酸的溶液反应2min， 含有OH、 ONOO-、 1O2的溶液反应10min， 含有NO的溶液反应 30min， 含有H2O2、 ROO和O2-的溶液反应60min。 分别将样品放置于光径为1.0cm、 体积为 1.0mL的石英比色皿中， 设置激发和发射狭缝宽度为5.0nm， 光电倍增管电压为700V， 用 500nm的波长激发， 测量其550nm的荧光发射强度。 0123 图5为10 M罗丹明6G酰肼衍生物分别对2 M次氯酸和10 M、 50 M、 100 M各种常见活 性物种的荧光响应强度。 0124 图4及图5所示， 罗丹明6G酰肼衍生物。