技术领域
本发明涉及一种一种用于恩拉霉素微生物效价测定的检定培养基，更具体地，本 发明涉及一种检定恩拉霉素效价的培养基制备方法。
背景技术
恩拉霉素，又名恩来霉素、安来霉素、恩霉素、持久霉素，系1966年自日本兵库县西 宫市土壤中分离出来的放线菌StreptomycesfungicidiousNO.B5477发酵产生的一种多 肽类抗生素。恩拉霉素是由包括13个不同种类的17个氨基酸分子和脂肪酸分子所组成的有 机碱，主要成分为恩拉霉素A和恩拉霉素B，还有少量的C和D组分。
恩拉霉素具有广泛的抗革兰氏阳性菌活性、优良的促生长、改善饲料利用率作用 及其低毒低残留等优点，在临床上常把恩拉霉素作为禽、猪、鱼的抗生素促生长剂。恩拉霉 素作为一种新型肽类抗生素，具有广谱、无残留、不产生耐药性等优点，已成为新型抗生素 的来源。
目前，恩拉霉素含量测定主要有HPLC法和微生物检定法(管碟法)。HPLC测定恩拉 霉素的文献如ZL201010226506.6、ZL201010528367.2和ZL201410105471.9等，用恩拉霉 素A和恩拉霉素B作为标准品，虽然HPLC测定恩拉霉素的方法操作相对简单，但是HPLC测定 恩拉霉素的方法还不是通用标准，国内和国际上还是不太认同该方法，同时涉及的HPLC仪 器价格也比较昂贵。现在我国国家标准和国际上通用的恩拉霉素含量测定标准仍然是微生 物检定法，可能与恩拉霉素成分复杂，用其中主要成分恩拉霉素A和恩拉霉素B标定的HPLC 方法不能够完全反应出产品的质量有关。
在公开的关于恩拉霉素检测方法的文献中，微生物检定法(管碟法)耗时长，高浓 度和低浓度抑菌圈差异不显著，检测范围受限等缺陷。朱曦等的《恩拉霉素含量测定方法的 改进》通过对样品提取、缓冲液及终浓度等检测条件进行优化，使改进后标准品高浓度抑菌 圈直径范围在18-22mm之间，大小圈差异明显，使得检测结果更精准。刘雅妮等的《恩拉霉素 预混剂含量测定方法的改进》将《进口兽药质量标准》检测方法中pH值4.0的醋酸盐缓冲液 改为pH值7.8的磷酸盐缓冲液，将储备液浓度由1000单位/mL降低为200单位/mL，提取时间 延长至2～3h，对培养基组成、菌浓、缓冲液、样品提取液和提取时间等检测条件进行优化， 找出抑菌圈大小合适，边缘清晰的试验条件，提高了测定的准确性。虽然如此，但是发明人 发现现有技术的恩拉霉素微生物鉴定法的抑菌圈边缘模糊的缺陷并没有没消除，而测量抑 菌圈直径是取得试验结果的重要环节，抑菌圈的模糊会使的测定误差大。
发明内容
为了克服管碟法的边缘不清晰的缺陷，本发明提供一种恩拉霉素微生物效价测定 的检定培养基，更具体地，本发明涉及一种恩拉霉素微生物效价测定的检定培养基制备方 法，以及新的检定培养基在恩拉霉素微生物效价测定中的应用。
抑菌圈边缘清晰度是影响测定结果的主要因素，导致抑菌圈边缘不清晰的原因有 多种，在抑菌圈形成过程中抗生素的扩散系数紊乱、不均一，不符合动力学公式中各项之间 的关系或各扩散系统交叉，如培养基原材料的成分及质量、pH值、盐浓度及培养时间均可影 响抑菌圈边缘的清晰度；多组分抗生素例如恩拉霉素中，各组分抗菌活性的不同，扩散系数 也不同，其交叉作用影响抑菌圈边缘的清晰度。
一种恩拉霉素检定培养基，其特征在于所述培养基按重量计包括蛋白胨5份、肉膏 3-5份、NaCl18-20份、磷酸氢二钠2.2-3.5份、琼脂14份。
优选的，所述恩拉霉素检定培养基按重量计包括蛋白胨5份、肉膏4.4份、NaCl20 份、磷酸氢二钠2.4份、琼脂14份。
优选的，所述恩拉霉素检定培养基pH值为7.8-8.1.
一种恩拉霉素检定培养基，其特征在于所述培养基的制备方法包括：(1)称取蛋白 胨5份、肉膏3-5份、NaCl18-20份、磷酸氢二钠2.2-3.5份、琼脂14份，加蒸馏水使成1000mL 混合物；
(2)用6MNaOH试液调步骤((1)所述的1000mL混合物pH值，使灭菌后1000mL混合物 的pH值为7.9～8.1，混合物分装。
(3)灭菌：将分装的混合物高压蒸汽灭菌，贴上标签备用。
优选的，所述培养基的制备方法包括：(1)称取蛋白胨5份、肉膏4.4份、NaCl20份、 磷酸氢二钠2.4份、琼脂14份，加蒸馏水使成1000mL混合物；
(2)用6MNaOH试液调步骤((1)所述的1000mL混合物pH值，使灭菌后1000mL混合物 的pH值为7.9～8.1，混合物分装。
(3)灭菌：将分装的混合物高压蒸汽灭菌，贴上标签备用。
发明人意外的发现，本发明使用所述的恩拉霉素检定培养基培养后得到的抑菌圈 边缘清晰，无双圈，无荚膜，抑菌圈直径适中，大大减少了测定误差。
具体实施方式
下面结合具体实施例详细描述本发明，但这些实施例仅是示例性的，并不对本发 明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下 可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的 保护范围内。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照厂 商所建议的条件。
实施例1
1准备
1.1试液的准备
按照常规方法制备pH7.8磷酸盐缓冲液、6mol/L氢氧化钠试液、1N盐酸试液、丙酮- 0.1N盐酸-水混合液、0.1％新洁尔灭溶液、75％乙醇溶液。
1.2检定培养基的制备
(1)称取蛋白胨、肉膏、NaCl、磷酸氢二钠、琼脂，加蒸馏水使成1000mL混合物；
(2)用6MNaOH试液调步骤((1)所述的1000mL混合物pH值，使灭菌后1000mL混合物 的pH值为7.9～8.1，混合物分装。
(3)灭菌：将分装的混合物高压蒸汽灭菌，贴上标签备用。
1.3平皿的制备
A、将配制好的检定培养基加热溶解。
B、将培养皿平铺在水平台上，用量杯取培养基于培养皿中呈水平状扩散，放置使 之凝固作底层。
C、底层所需培养基作菌层培养基并保温在水浴锅中。用时取出，待冷却后往菌层 培养基里加试验菌悬液，充分混合。
D、在上述盛有底层培养基的平板中，分别加入试验菌悬液的菌层培养基5mL。用陶 瓦盖盖上，放置备用。
1.4接种物的制备(枯草芽孢杆菌CMCC53501，购自中国兽医药品监察所)
A、将接种好的增殖培养基斜面的茄子瓶倒过来，在36±1℃的电热恒温培养箱中 培养7天。
B、培养结束后，从电热恒温培养箱中取出，取一支加灭菌水约40mL，从培养基的斜 面洗下菌苔制成芽孢悬液，并倒回至灭菌大试管中。
C、将大试管放进65±1℃的电热恒温水浴锅里，加热30分钟待冷后放入冰箱(1～ 10℃)贮藏，这称为枯草芽孢杆菌菌悬液，保存期限为3个月。
2.仪器设备TOMYES215高压蒸汽灭菌锅；干燥箱；恒温培养箱；ZY-300IV多功能微 生物自动测量分析仪，北京先驱威锋技术开发公司生产。
3.恩拉霉素样品效价测定
A、吸取适量对照品储备液(1000ug/mL)，用PH7.8磷酸盐缓冲液精确定量稀释，配 制成低稀释度(高浓度)40u/mL的恩拉霉素对照品溶液和高稀释度(低浓度)10u/mL的恩拉 霉素对照品溶液
D、按前面方法制备好平皿，把钢圈放置在平板上，每个平板均一地放置4个钢圈。
E、点样：每份取8张平板，往平板上相对的2个钢圈中注入对照品稀释液(40u/mL)， 其它2个钢圈中注入对照品稀释液(10u/mL)。
F、培养：在36±1℃的隔水式电热恒温培养箱里培养16-18小时。
G、培养结束后，从培养箱里取出平板，拆下钢圈。
步骤1.2中检定培养基的组分如下表1所示：
表1：检定培养基组分
组份 培养基1 培养基2 培养基3 培养基4 培养基5 蛋白胨 5g 5g 5g 5g 5g 肉膏 4.6g 3g 5g 5g 6g 氯化钠 18g --- 30g 80g --- 磷酸氢二钠 2.2g 3g 2g 20g 20g 琼脂 14g 15g 15g 15g 15g
实验结果：培养基2和培养基5的平皿，产生的抑菌圈边缘模糊或不整齐，产生双 圈，与菌层反差不够明显；培养基3的抑菌圈呈现心形或椭圆形，抑菌圈边界比培养基2和培 养基5的抑菌圈边缘清楚，但是仍然可以看到双圈，与菌层反差比比培养基2和培养基5的得 到改善；培养基4的高浓度和低浓度抑菌圈直径差异不大，并且边缘模糊，不利于测量；培养 基1平皿上的抑菌圈边缘比培养2-5都清楚，无双圈，无荚膜，并且抑菌圈性状为规则的圆 形，抑菌圈直径适中，高低浓度的抑菌圈差异较大。基于此实验结果发明人将在培养基1的 基础上进行进一步的精密实验，以找出更加合适的恩拉霉素检定培养基成分配方。
实施例2
按照实施例1的步骤1和2准备实验。另外，为了找出更加合适的恩拉霉素检定培养 基成分配方，发明人根据实施例1中培养基1成分配方进行了调整。
按照实施例1的步骤1和2完成准备实验后，按照以下步骤进行操作：
A、吸取适量对照品储备液(1000ug/mL)，用PH7.8缓冲液精确定量稀释，配制成低 稀释度(高浓度)40u/mL的恩拉霉素对照品溶液和高稀释度(低浓度)10u/mL的恩拉霉素对 照品溶液
B、称量：精密地称取恩拉霉素预混剂样品适量于具塞三角瓶中(共6个)。
C、溶解与稀释：用酸式滴定管加丙酮-0.1N盐酸-水(35∶12∶56)的混合液于具塞三 角瓶中稀释成1000u/mL溶液，超声30分钟。用1N盐酸试液调节PH为2.8～3.2，过滤，再吸取 过滤液2mL置50mL容量瓶中，加PH7.8缓冲液稀释至刻度，混匀，即为40u/mL的低稀释度(高 浓度)样品溶液；吸取适量(高浓度)样品溶液，用PH7.8缓冲液定量稀释4倍，得到浓度为 10u/mL的高稀释度(低浓度)样品溶液。(40u/mL、10u/mL，剂间比为4∶1)这就是供试溶液。
D、按前面方法制备好平板，把钢圈放置在平板上，每个平板均一地放置4个钢圈。
E、点样：每份取8张平板，往平板上相对的2个钢圈中注入对照品稀释液(40u/mL、 10u/mL)，其它2个钢圈中注入供试溶液(40u/mL、10u/mL)。
F、培养：在36±1℃的隔水式电热恒温培养箱里培养16-18小时。
G、培养结束后，从培养箱里取出平板，拆下钢圈。(小心地拆下不要破坏琼脂培养 基)
H、测量：用抑菌圈自动测量仪测量平板抑菌圈的直径，精确到0.01mm，对效价测定 结果进行精密度分析。
检定培养基的组分以及用相应的检定培养基检测的结果如下：
培养基1-1：
每1000mL培养基的组成
组份 比例 胨 5g 肉膏 4.6g 氯化钠 18g 磷酸氢二钠 2.2g 琼脂 14g 蒸馏水 加至1000mL
测试结果：
培养基1-2：
每1000mL培养基的组成
测试结果：
培养基1-3：
每1000mL培养基的组成
组份 比例 胨 5g 肉膏 4.4g 氯化钠 20g 磷酸氢二钠 2.4g 琼脂 14g 蒸馏水 加至1000mL
测试结果：
培养基1-4：
每1000mL培养基的组成
组份 比例 胨 5g 肉膏 5g 氯化钠 20g 磷酸氢二钠 3g 琼脂 14g 蒸馏水 加至1000mL
测试结果：
培养基1-5：
每1000mL培养基的组成
组份 比例 胨 6g 肉膏 4g 氯化钠 20g 磷酸氢二钠 3.5g 琼脂 14g 蒸馏水 加至1000mL
测试结果：
从实验结果可以看到，5组培养基回归非常显著(P＜0.01)，偏离平行不显著(P＞ 0.05)，5组培养基实验都成立。但是第三组培养基1-3的平均可信限率Pt的FL％值最低，为 平均可信限率Pt的FL％＝1.98％，其他四组的平均可信限率Pt的FL％值均不低于3.0％，因 此第三组培养基1-3的成分配方比较好。
实施例3
按照实施例1的步骤1和2准备实验。准备完成后，按照下列步骤绘制标准曲线：
A、标准品溶液的配制(1000ug/mL)
精确称取恩拉霉素标准品0.02546g于100mL三角瓶中，对照品效价为1090μg/mg。
计算：称取标准品重量0.02546g×1090μg/mg×1000/1000μg/mL＝27.75mL(加 80％甲醇溶液量)。用50mL滴定管把27.75mL80％甲醇溶液轻轻地放进三角瓶中，溶解后成 1000μg/mL标准液。
B、经试验确定直线中心点的抗生素浓度为：20u/ml，中心点浓度使所致抑菌圈的 直径在16～17mm之间。
C、线性测定的剂距用等比级数，采用的等比级数为1∶0.80。
D、每个浓度组为一组，设9组，每组3个双碟。
浓度组以中心点浓度20u/ml为中心，按等比级数为0.8计算各浓度组为：
E、分别从1000μg/mL标准液中吸取1-9组各浓度的标准液于25ml容量瓶中，吸取量 依次为：0.2048ml、0.256ml、0.32ml、0.4ml、0.5ml、0.625ml、0.78125ml、0.97625ml、 1.22075ml，加pH7.8缓冲液到25ml容量瓶至刻度。
F、取制备好底层及菌层培养基的双碟，每3个双碟为一组浓度组，共分9组，每一个 双碟中滴加相同浓度的标准液4点，各组滴加完毕后，将双碟在规定的36℃±1℃培养16～ 18小时，然后测定各抑菌圈直径。
G、管碟法的线性考察，其直线的最低浓度段与最高浓度段的确定，选择所致抑菌 圈直径在18～22mm高的浓度为最高浓度，按中心浓度等比的关系，算出最低浓度，最低浓度 涵盖效价测定时高、低剂量之比4∶1的低剂量浓度，最低浓度对应的直径不得少于14mm。
H、以各组浓度的对数值log与相对应各浓度的直径与中心点浓度直径的差值作线 性分析，得回方程及相关系数r，并对相关系数作显著性检验，同时绘制线性图。
通过以上试验及线性图证实，恩拉霉素标准液的浓度8.192μg/ml～48.83μg/ml (对数浓度值)中均与所产生的抑菌圈区域直径呈线性关系。
实施例4
恩拉霉素检定培养基的制备
(1)称取蛋白胨5g、肉膏4.6g、NaCl18g、磷酸氢二钠2.2g、琼脂14g，加蒸馏水使成 1000mL混合物；
(2)用6MNaOH试液调步骤((1)所述的1000mL混合物pH值，使灭菌后1000mL混合物 的pH值为7.9～8.1，混合物分装。
(3)灭菌：将分装的混合物高压蒸汽灭菌，贴上标签备用。
实施例5
恩拉霉素检定培养基的制备
(1)称取蛋白胨5g、肉膏3.8g、NaCl18g、磷酸氢二钠2.6g、琼脂14g，加蒸馏水使成 1000mL混合物；
(2)用6MNaOH试液调步骤((1)所述的1000mL混合物pH值，使灭菌后1000mL混合物 的pH值为7.9～8.1，混合物分装。
(3)灭菌：将分装的混合物高压蒸汽灭菌，贴上标签备用。
实施例6
恩拉霉素检定培养基的制备
(1)称取蛋白胨5g、肉膏4.4g、NaCl20g、磷酸氢二钠2.4g、琼脂14g，加蒸馏水使成 1000mL混合物；
(2)用6MNaOH试液调步骤((1)所述的1000mL混合物pH值，使灭菌后1000mL混合物 的pH值为7.9～8.1，混合物分装。
(3)灭菌：将分装的混合物高压蒸汽灭菌，贴上标签备用。
实施例7
恩拉霉素检定培养基的制备
(1)称取蛋白胨5g、肉膏5g、NaCl20g、磷酸氢二钠3.0g、琼脂14g，加蒸馏水使成 1000mL混合物；
(2)用6MNaOH试液调步骤((1)所述的1000mL混合物pH值，使灭菌后1000mL混合物 的pH值为7.9～8.1，混合物分装。
(3)灭菌：将分装的混合物高压蒸汽灭菌，贴上标签备用。
实施例8
恩拉霉素检定培养基的制备
(1)称取蛋白胨6g、肉膏4.0g、NaCl20g、磷酸氢二钠3.5g、琼脂14g，加蒸馏水使成 1000mL混合物；
(2)用6MNaOH试液调步骤((1)所述的1000mL混合物pH值，使灭菌后1000mL混合物 的pH值为7.9～8.1，混合物分装。
(3)灭菌：将分装的混合物高压蒸汽灭菌，贴上标签备用。