技术领域
本发明涉及一种真菌代谢产物，尤其是涉及一种布雷菲德菌素A的羟基磷酸氨基酸酯类 衍生物及其制备方法和应用。
背景技术
(一)、(+)-Brefeldin A的研究概括
布雷菲徳菌素A(英文名：(+)-Brefeldin A,简称BFA，中文名称为：布雷菲德菌素A，也 称作斜卧菌素或蓝菌素或壳二孢素)，是一种大环内酯类真菌代谢产物，最早由Singleton等 在1958年从Penicilliumdecumben中分离得到。虽然BFA的平面结构早已被测定，但是其绝 对构型直到1971年才由Weber等用X射线晶体衍射法确立，其结构式如下：
(+)-BrefeldinA具有广泛的生物活性，包括抗病毒、抗真菌、抗线虫、抗有丝分裂和抗肿 瘤等，其主要功能是能诱导高尔基体的分解，抑制蛋白从内质网(简称：ER)中转移为高尔 基体的复合物，从而阻断高尔基体复合物的蛋白质传输，目前被作为一种重要的分子工具广 泛用于研究哺乳动物的信号传导途径。国际肿瘤协会发现，(+)-BrefeldinA能够诱导肿瘤细胞 分化和凋亡，作为化学治疗试剂用于抗肿瘤有很大的应用前景。
(+)-Brefeldin A在抗肿瘤方面显示了显著的药理活性，其抗肺癌细胞（HOP-62）、结肠癌 细胞(HCT-116)、黑色素瘤细胞(UAC-662)、卵巢癌细胞(OVCAR-3)、前列腺癌细胞(DU-145)、 乳癌细胞(MDA-MB-435)等的IC50均<0.1μmol/L（[1]Argade,A.B.;Devraj,R.;Vroman,J.A.; Haugwitz,R.D.;Hollingshead,M.;Cushman,M.Design and Synthesis of Brefeldin A Sulfide Derivatives as Prodrug Candidates with Enhanced Aqueous Solubilities[J].J.Med.Chem.1998,41: 3337）
(二)、(+)-Brefeldin A结构改造概括
(+)-BrefeldinA作为一个新的抗肿瘤候选药物，在国际上受到极为广泛的关注。该化合物 具有活性高等特点，同时对多种肿瘤均具有良好的抑制作用。近年来，国外对该化合物的研 发速度非常快，前景广阔。但是(+)-BrefeldinA作为一种抗癌候选药物，有许多药代动力学方 面的缺点，如(+)-BrefeldinA的溶解性很差；口服后吸收差；若静脉注射给药，则(+)-Brefeldin A在血液中浓度会迅速下降，从而被清空；(+)-BrefeldinA的毒副作用也较大。因此，为克服 上述缺点，化学家们对(+)-Brefeldin A的结构进行修饰，主攻方向是通过改善(+)-Brefeldin A 的亲水亲油性，使其有利于药物的吸收。
目前，国际上对(+)-Brefeldin A抗肿瘤活性方面的研究非常活跃，对(+)-Brefeldin A全合 成和表观合成也报道了30多种；而国内对(+)-BrefeldinA的研究主要集中在(+)-BrefeldinA原 料的发酵生产、剂型研究及其合成。2004年上海有机所有一篇关于(+)-Brefeldin A的全合成， 但也只是作为一种合成方法上的研究。由于这样合成(+)-BrefeldinA投入的人力、财力太多， 已无力进行(+)-BrefeldinA的结构改造。结构改造方面，国内研究较少，国际相对研究较多， 主要集中在（1）羟基的改造：(+)-Brefeldin A分子中有2个羟基，因此，在结构改造中占有 重要地位。反应类型主要有烷基化、酰化、氧化等。生物测试结果表明，烷基化和酰化的 (+)-Brefeldin A都具有一定抗肿瘤活性，但是其活性低；而氧化后的(+)-Brefeldin A则没有活 性，说明4位和7位上的羟基在(+)-BrefeldinA的生物活性中起着重要作用。（2）酯基的改 造：Hitoshi（[2]Zhu,J.W.;Hori,H.;Nojiri，H.;Tsukuda,T.;Taira,Z.Synthesis and Activity of Brefeldin A Analogs as Inducers of Cancer Cell Differentiation and Apoptosis[J].Bioorg. Med.Chem.Lett.1997,7:139）以BFA为原料用KOH水溶液水解开环，然后合成其开环化合 物的甲酯和苄酯。生物测试结果表明，水解和改造后的产物已经没有(+)-BrefeldinA的生物活 性，说明稳定的13元环的构型也是与Sec7d-ARF-GDP复合物结合的关键。（3）双键的改造： Zhu等（[3]Zhu,J.W.;Nagasawa,H.;Nagura,F.;Mohamad,S.B.;Uto,Y.;Ohkura,K.Elucidation of Strict Structural Requirements of Brefeldin A as an Inducer of Differentiation and Apoptosis[J]. Bioorg.Med.Chem.2000,8:455）从(+)-Brefeldin A出发合成了一些类似物并对这些类似物进 行了生物测试，结果发现，10,11位环氧化的(+)-BrefeldinA能够对人类直肠癌细胞和正常细 胞进行区分，而四氢化的(+)-Brefeldin A和其它一些类似物则不能进行区分，这说明双键在 (+)-BrefeldinA生物活性中同样起着重要的作用。
药物的脂溶性和酸碱度是影响药物生物利用度的主要原因。将含有羟基或羧基的药物制 成酯类前药，可以提高药物的脂溶性，增强药物通过生物膜的能力，从而提高生物利用度。 磷酸化氨基酸具有很好的生物活性，本申请人（[4]Li,Y.M.;Yin,Y.W.;Zhao,Y.F. Phosphoryl group participation leads to peptide formation from N‐phosphorylamino acidsInt[J]. Peptide Protein Res.1992;39:375；[5]Zhou,W.H.;Ju,Y.;Zhao,Y.F.;Wang,Q.G.;Luo,G.A. Simultaneous formation of peptides and nucleotides from N-phosphothreonine[J].Origins Life Evol.Biosphere.1996;26:547）早期的研究发现，它能够自催化生成多肽及核苷等，并用于抗 艾滋病活性分子AZT的前药改造中。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种布雷菲德菌素A的羟基磷酸氨基酸酯类衍生物。
本发明的第二目的在于提供一种布雷菲德菌素A的羟基磷酸氨基酸酯类衍生物的合成方 法。
本发明的第三目的在于提供一种布雷菲德菌素A的羟基磷酸氨基酸酯类衍生物的应用。
所述布雷菲德菌素A的羟基磷酸氨基酸酯类衍生物的结构式为：
(+)-BrefeldinA可购自百灵威科技有限公司CA号：20350-15-6。1H-NMR，13C-NMR由 Bruker av400超导核磁共振仪上测定，以TMS为内标在氘代有机溶剂中测得；31P-NMR由 Bruker av400超导核磁共振仪测得，以85%磷酸(H3PO4)作为外标，测量温度为室温(22℃)。 质谱系使用Bruker ESOSUIRE-3000测得，高分辨质谱在Bruker Daltonics APEX II质谱仪上测 得。X-Ray单晶衍射在Bruker APEX CCD面碳晶体衍射仪上测得。红外在红外吸收光谱仪 Nicolet Avatar360上测得。酶标仪使用Bio-Rad公司。药代动力学研究采用Applied Biosystems 3200Q TRAP LC/MS/MS System四极杆质谱仪。
所述布雷菲德菌素A的羟基磷酸氨基酸酯类衍生物包括(+)-Brefeldin A-4,7-二羟基磷酸 氨基酸酯、(+)-Brefeldin A-4-羟基磷酸氨基酸酯和(+)-Brefeldin A-7-羟基磷酸氨基酸酯。
所述(+)-Brefeldin A-4,7-二羟基磷酸氨基酸酯的结构式为：
其中，R是氢，甲基，异丙基，或苄基等；
所述(+)-BrefeldinA-4,7-二羟基磷酸氨基酸酯的合成方法包括以下步骤：
a）冰水浴，惰性气体保护下，将(+)-Brefeldin A、磷酰化氨基酸和4-二甲氨基吡啶溶解 于第一有机溶剂中，所述(+)-Brefeldin A、磷酰化氨基酸和4-二甲氨基吡啶的摩尔配比1∶4∶ 0.1；所述第一有机溶剂可选自二氯甲烷、DMF等中的一种；所述磷酰化氨基酸可选自磷酰 化甘氨酸、磷酰化丙氨酸、磷酰化缬氨酸、磷酰化苯丙氨酸等中的一种。
b）在冰浴条件下，将二环己基碳二亚胺的有机溶剂加入步骤a）所得的混合物中，反应 后，得4,7-二羟基磷酸氨基酸酯-(+)-Brefeldin A；
在步骤b）中，所述二环己基碳二亚胺的有机溶剂可选自二氯甲烷、DMF等中的一种； 所述反应可采用薄层层析色谱跟踪监测。
c）步骤b）反应后，过滤掉不溶物，减压，浓缩，除去有机溶剂，产物质量用5%的第 二有机溶剂溶解，进行硅胶柱层析分离，得到4,7-二羟基磷酸氨基酸酯-(+)-Brefeldin A。
在步骤c）中，所述第二有机溶剂可选自二氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯、氯仿等中的一 种。
所合成得到(+)-Brefeldin A-4,7-二羟基磷酸氨基酸酯的产率可达85%～97%。
所述(+)-Brefeldin A-4-羟基磷酸氨基酸酯的结构式为：
其中，R是氢，甲基，异丙基，或苄基等。
所述(+)-Brefeldin A-4-羟基磷酸氨基酸酯的合成方法包括以下步骤：
a）将(+)-Brefeldin A、咪唑和叔丁基二甲基氯硅烷在第一有机溶剂中反应后，再加入第 二有机溶剂后，洗涤，有机相减压浓缩，剩余物柱层析分离得到7-O-叔丁基二甲基硅 (+)-Brefeldin A；
在步骤a)中，所述(+)-Brefeldin A、咪唑和叔丁基二甲基氯硅烷的质量配比为280∶ 126-204∶165；所述的第一有机溶剂可选自DMF、DMSO等中的一种；所述反应可采用薄层 层析板跟踪监测反应，所述的第二有机溶剂加入量按(+)-Brefeldin A质量10mg/mL，所述第 二有机溶剂为乙酸乙酯，二氯甲烷，所述洗涤可采用加入水按(+)-Brefeldin A质量10mg/mL， 洗3次。
b)在惰性气体保护下，将步骤a）得到的7-O-叔丁基二甲基硅(+)-Brefeldin A、磷酰化氨 基酸和4-二甲氨基吡啶在第二有机溶剂中形成混合物，冰浴下，加入二环己基碳二亚胺的第 三有机溶剂，反应后，过滤除掉不溶物，减压浓缩，柱层析分离得到纯的7号位叔丁基二甲 基硅保护的(+)-Brefeldin A-4-羟基磷酸氨基酸酯；
在步骤b）中，所述在惰性气体可采用氩气等，所述(+)-Brefeldin A、磷酰化氨基酸和4- 二甲氨基吡啶的摩尔配比可为1∶2∶0.1；所述第二有机溶剂可选自乙酸乙酯、二氯甲烷等中 的一种；所述的第二有机溶剂加入量按(+)-Brefeldin A质量20mg/mL所述第三有机溶剂的 加入量按(+)-Brefeldin A质量10mg/mL，所述第三有机溶剂可选自二氯甲烷、氯仿、DMF 等中的一种；所述反应可采用薄层层析板跟踪监测反应；所述磷酰化氨基酸可选自磷酰化甘 氨酸、磷酰化丙氨酸、磷酰化缬氨酸、磷酰化苯丙氨酸等中的一种。
c）将7-O-叔丁基二甲基硅-(+)-Brefeldin A-4-O-磷酸氨基酸酯溶解在第四有机溶剂中， 再加入碘单质，反应后，再加入硫代硫酸钠，直到溶液变为澄清，然后加入第五有机溶剂， 再洗涤，有机相减压浓缩，剩余物柱层析分离得到(+)-Brefeldin A-4-羟基磷酸氨基酸酯。
在步骤c）中，所述7-O-叔丁基二甲基硅-(+)-Brefeldin A-4-羟基磷酸氨基酸酯、碘单质、 硫代硫酸钠、第四有机溶剂、第五有机溶剂的配比可为100～300mg：30～100mg：10～60mg： 3～5mL：10～30mL；所述第四有机溶剂可选自甲醇等；所述第五有机溶剂可选自乙酸乙 酯、二氯甲烷等中的一种；所述洗涤可采用的水洗涤加入水按(+)-Brefeldin A质量10mg/mL， 洗3次。
所述(+)-BrefeldinA-7-羟基磷酸氨基酸酯的结构式为：
其中，R是氢，甲基，异丙基，或苄基等。
所述(+)-Brefeldin A-7-羟基磷酸氨基酸酯的合成方法包括以下步骤：
a）将(+)-Brefeldin A、咪唑和叔丁基二甲基氯硅烷在第一有机溶剂中反应后，再加入第 二有机溶剂后，洗涤，有机相减压浓缩，剩余物柱层析分离得到形成4,7-O-叔丁基二甲基硅 (+)-Brefeldin A。
在步骤a)中，所述(+)-Brefeldin A、咪唑和叔丁基二甲基氯硅烷的摩尔配比为1∶3∶6； 所述第一有机溶剂可选自DMF、DMSO等中的一种；所述第二有机溶剂可选自乙酸乙酯、二 氯甲烷等中的一种；所述反应可采用薄层层析板跟踪监测反应，所述的第二有机溶剂加入量 按(+)-Brefeldin A质量10mg/mL，所述第二有机溶剂为乙酸乙酯，二氯甲烷，所述洗涤可采 用加入水按(+)-Brefeldin A质量10mg/mL，洗3次。
b）将4,7-双叔丁基二甲基硅-(+)-Brefeldin A溶于THF中，加入醋酸及水，反应后将反应 液减压浓缩，加入第三有机溶剂后，洗涤，有机相减压浓缩，剩余物柱层析分离得到4-O-叔 丁基二甲基硅(+)-Brefeldin A。
在步骤b）中，所述4,7号位TBS双保护的(+)-Brefeldin A、四氢呋喃、醋酸、水、第三 有机溶剂的配比1mL:1mL:2mL；所述反应的条件可为在50~60℃搅拌反应24h；所述第三 有机溶剂可选自乙酸乙酯、二氯甲烷等中的一种；所述洗涤可依次用水、碳酸氢钠,和水洗涤。
c)在惰性气体保护下，将4号位TBS保护的(+)-Brefeldin A、磷酰化氨基酸和4-二甲氨 基吡啶在第四有机溶剂中形成混合物，冰浴下，再加入二环己基碳二亚胺的第四有机溶剂， 反应后，过滤除掉不溶物，减压浓缩，柱层析分离得到4号位叔丁基二甲基硅保护的 (+)-Brefeldin A-7-羟基磷酸氨基酸酯；
在步骤c)中，所述惰性气体可采用氩气、氮气等；所述4号位叔丁基二甲基硅保护的 (+)-Brefeldin A、磷酰化氨基酸和4-二甲氨基吡啶的摩尔配比可为1∶2∶0.1；所述第四有机 溶剂可选自二氯甲烷、氯仿、DMF等中的一种；所述反应可采用薄层层析板跟踪监测反应； 所述磷酰化氨基酸可选自磷酰化甘氨酸、磷酰化丙氨酸、磷酰化缬氨酸、磷酰化苯丙氨酸等 中的一种。
d)将4号位TBS保护的(+)-Brefeldin A-7-羟基磷酸氨基酸酯溶解在第五有机溶剂中，再 加入碘，反应后，冷却至室温，再加入硫代硫酸钠，直到溶液变为澄清，然后加入水洗涤， 有机相减压浓缩，剩余物柱层析分离得到(+)-Brefeldin A-7-羟基磷酸氨基酸酯。
在步骤d）中，所述4号位叔丁基二甲基硅保护的(+)-Brefeldin A-7-羟基磷酸氨基酸酯、 碘、硫代硫酸钠、第五有机溶剂、水的配比可为100～300mg：30～100mg：10～60mg：3～ 5mL：10～30mL；所述反应的条件可为50～80℃下反应10～30h；所述洗涤可采用与原料 10%配比水洗涤3次；所述第五有机溶剂可选自乙酸乙酯、二氯甲烷等中的一种。
以下给出(+)-Brefeldin A的羟基磷酸氨基酸酯类衍生物的抗肿瘤活性：
本发明所述布雷菲德菌素A具有抗真菌、抗病毒、抗肿瘤等方面的药理作用与用途，本 发明对布雷菲德菌素A的羟基磷酸氨基酸酯类衍生物在抗肿瘤活性方面进行了多次试验，发 现其具有显著的抗肿瘤活性，所述肿瘤包括肺癌细胞、胃癌细胞、肠癌细胞或白血病细胞中 的至少一种所导致的肿瘤。
本发明合成了具有高度生物活性、较好溶解性及好的生物利用度的布雷菲德菌素A的羟 基磷酸氨基酸酯类衍生物，提供了一种设计布雷菲德菌素A的羟基磷酸氨基酸酯类衍生物前 药的新思路，其合成方法简单、低成本。另外，本发明对布雷菲德菌素A的羟基磷酸氨基酸 酯类衍生物的抗肿瘤细胞毒活性进行评价，并对布雷菲德菌素A的羟基磷酸氨基酸酯类衍生 物的动物体内药代动力学进行测试分析。
用本发明的方法制备的布雷菲德菌素A的羟基磷酸氨基酸酯类衍生物，是一类结构新颖 的、结构相对稳定(pH=5.5)且对胃癌、肠癌、肝癌、白血病、乳腺癌、肺癌等肿瘤细胞的增 殖具有显著的抑制活性。通过这个制备方法合成的布雷菲德菌素A的羟基磷酸氨基酸酯类衍 生物，在酯酶的催化下，能酶催化水解，并释放出原药(+)-BrefeldinA。同时，通过对布雷菲 德菌素A的羟基磷酸氨基酸酯类衍生物的大鼠体内代谢动力学研究表明，这类前药的半衰期 比原药(+)-Brefeldin A延长了。因此布雷菲德菌素A的羟基磷酸氨基酸酯类衍生物是一种具备 抑制肿瘤细胞功能性制品，相对原药(+)-BrefeldinA具有溶解性好，半衰期长等优点，由此可 见，布雷菲德菌素A的羟基磷酸氨基酸酯类衍生物可在制备抗癌药品中应用。
附图说明
图1为(+)-Brefeldin A-4-羟基磷酸氨基酸酯在不同pH值缓冲盐溶液中的降解图。在图1 中，横坐标为时间（h），纵坐标为相对浓度百分比；a为pH=1.2，b为pH=5.5，c为pH=7.4， d为pH=10.4。
图2为(+)-BrefeldinA-7-羟基磷酸氨基酸酯的广谱酯酶水解图。在图2中，横坐标为时间 （h），纵坐标为O.D.215nm；S7-01为(+)-Brefeldin A-7-羟基磷酸氨基酸酯；a为BFA，b为 S7-01。
图3为(+)-Brefeldin A-羟基磷酸氨基酸酯对肺癌A549细胞的抑制作用图。在图3中，横 坐标为样品编号；纵坐标为半数抑制率IC50(μmol·L-1)。
图4为静脉注射(+)-BrefeldinA和S7-01(5mg/kg)后大鼠体内(+)-BrefeldinA的血药浓度- 时间曲线(n=4)。在图4中，横坐标为时间（min），纵坐标为浓度（ng/mL）；a为(+)Brefldin A，b为S7-01。
具体实施方式
以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。
实施例1
在25mL的圆底烧瓶中加入0.5mmol的(+)-Brefeldin A、2mmol的磷酰化丙氨酸、0.05 mmol的4-二甲氨基吡啶在氩气保护下加入10mL的无水二氯甲烷，冰水浴下向反应体系中 滴加2mmol二环己基碳二亚胺的CH2Cl2溶液，滴加完后，室温下搅拌过夜，薄层层析板 监测反应完全后，过滤掉不溶物（DCU），滤液减压浓缩。用V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)＝1∶3 过柱得到纯产品(D-02)，产率90﹪。(波谱数据，31P-NMR(CDCl3):δ=5.08,4.93ppm;1H-NMR (400MHz,CDCl3):δ7.21(dd,J=15.9,3.5Hz,1H),5.66-5.78(m,2H),5.13-5.31(m,3H), 4.82-4.93(m,1H),4.53-4.66(m,4H),3.94-4.03(m,1H),3.82-3.92(m,1H),3.20(q,J=8.7Hz, 2H),2.41-2.53(m,1H),2.30-2.40(m,1H),1.99-2.21(m,4H),1.80-1.86(m,1H),1.68-1.78(m, 2H),1.60-1.65(m,1H),1.49-1.57(m,1H),1.46(d,J=7.2Hz,3H),1.39(d,J=7.1Hz,3H), 1.24-1.33(m,27H),0.87-0.96(m,1H);13C NMR(100MHz,CDCl3):δ173.4,173.3,172.8,172.9 (CCO),165.2(C1),146.2(C3),135.2(C11),131.5(C10),118.7(C2),76.7(C4),76.0(C7),71.8(C15), 71.1,71.1,71.0,70.9(OCH(CH3)2),50.0(C5),49.6(NHCHCH3),44.1(C8),39.9(C9),38.1(C14), 34.0(C6),31.7(C12),26.4(C13),23.8,23.7(OCH(CH3)2),21.5,21.4,21.2,21.1(NHCHCH3)，20.7 (C16);ESI-MS:m/z calcd for[M+H]+751.4;[M+Na]+773.4)。
实施例2
将280mg(1mmol)的(+)-Brefeldin A，82mg(1.2mmol)的咪唑溶于10mL干燥的DMF 中，冰水浴冷却。将165mg(1.1mmol)的TBSCl溶解于5mL干燥的DMF中，将此溶液用注 射器缓慢的滴加到上述体系中，室温搅拌24h，薄层层析板监测反应完全后，加入20mL 的有机溶剂(II)稀释后，用3×10mL水洗涤。有机相减压浓缩。用V(石油醚)∶V(乙酸乙酯) ＝8∶1过柱得到纯产品7号位TBS保护的(+)-BrefeldinA(编号：BFA-7TBS)，产率86％。在 25mL的圆底烧瓶中加入0.5mmol的BFA-7TBS，1mmol的磷酰化丙氨酸，0.05mmol的4- 二甲氨基吡啶在氩气保护下加入10mL的无水二氯甲烷，冰水浴下向反应体系中滴加1mmol 二环己基碳二亚胺的二氯甲烷溶液，滴加完后，室温下搅拌过夜，薄层层析板监测反应完全 后，过滤掉不溶物（DCU），滤液减压浓缩。用V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)＝1∶2过柱得到纯 产品7号位TBS保护的(+)-Brefeldin A-4-羟基磷酸氨基酸酯,产率92％。在10mL的圆底烧 瓶中加入0.5mmol的7号位TBS保护的(+)-Brefeldin A-4-羟基磷酸氨基酸酯和5mL的甲醇， 产品溶解后，向反应体系加入0.2mmol的I2，室温反应16h，反应完全后，向反应体系中滴 加1mol/L Na2S2O3，直到溶液变为澄清。加入30mL的乙酸乙酯稀释后，用3×10mL水洗涤。 有机相减压浓缩,用V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)＝1∶2过柱得到目标产物(+)-Brefeldin A-4-羟基 磷酸丙氨酸酯(S4-02)的纯产品，产率98％。(波谱数据，31P-NMR(CDCl3):δ=4.91ppm； 1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ7.24(dd,J=15.7,3.2Hz,1H)，5.65-5.74(m,2H)，5.26-5.34(m, 2H)，4.81-4.91(m,1H)，4.54-4.65(m,2H)，4.29(dq,J=4.3,4.9Hz,1H)，3.91-4.03(m,1H)， 3.24(t,J=9.5Hz,1H),2.34-2.46(m,1H)，2.11-2.31(m,3H)，1.90-2.06(m,2H)，1.79-1.89(m, 2H)，1.69-1.78(m,1H)，1.48-1.64(m,3H)，1.46(d,J=7.0Hz,3H)，1.28-1.35(m,12H)，1.24(d, J=6.4Hz,3H)，0.87-0.97(m,1H);13C NMR(100MHz,CDCl3):δ172.9，171.9(CCO)，165.4 (C1)，146.7(C3)，136.3(C11)，130.5(C10)，118.2(C2)，76.7(C4)，71.9(C7)，71.8(C15)，71.2， 71.1(OCH(CH3)2)，50.1(C5)，49.5(NHCHCH3)，44.3(C8)，43.0(C9)，40.9(C14)，31.9(C6)， 31.7(C12)，26.5(C13)，23.7，23.7，23.6(OCH(CH3)2)，21.4，21.3(NHCHCH3)，20.7(C16);ESI-MS: m/z calcd for[M+H]+516.3;[M+Na]+538.3.)
实施例3
在25mL的圆底烧瓶中加入0.5mmol的4号位TBS保护的(+)-Brefeldin A、1mmol的 DIPP-Ala、0.05mmol的4-二甲氨基吡啶在氩气保护下加入10mL的无水二氯甲烷，冰水浴 下向反应体系中滴加1mmol二环己基碳二亚胺的CH2Cl2溶液，滴加完后，室温下搅拌过夜， 薄层层析板监测反应完全后，过滤掉不溶物（DCU），滤液减压浓缩。用石油醚∶乙酸乙酯为 1∶3过柱得到纯产品产率92﹪。在10mL的圆底烧瓶中加入0.3mmol的4号位TBS保护的 (+)-Brefeldin A-7-羟基磷酸氨基酸酯，加入5mL的CH3OH,产品溶解后，向反应体系加入0.02 mg的I2，60℃反应16h，反应完全后，向反应体系中滴加1mol/L Na2S2O3,直到溶液变为澄 清。加入30mL的乙酸乙酯稀释后，用3×10mL水洗涤。有机相减压浓缩。用V(石油醚)∶ V(乙酸乙酯)＝1∶2过柱得到目标产物(+)-Brefeldin A-7-羟基磷酸丙氨酸酯(S7-02)的纯产品， 产率60﹪。(波谱数据，31P-NMR(CDCl3):δ=5.04ppm；1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ7.24(dd, J=15.7,3.2Hz,1H)，5.92(dd,J=15.7,2.0Hz,1H)，5.7(ddd,J=15.2,9.9,2.0Hz,1H)，5.15-5.2 (m,2H)，4.81-4.91(m,1H)，4.51-4.65(m,2H)，4.08-4.15(m,1H)，3.79-3.90(m,1H),3.20(t,J= 9.7Hz,1H),2.50-2.58(m,1H),2.34-2.46(m,1H)，2.26-2.35(m,1H),2.17-2.21(m,1H)，1.96-2.06 (m,1H)，1.79-1.92(m,4H)，1.69-1.78(m,1H)，1.48-1.64(m,2H)，1.37(d,J=7.0Hz,3H)， 1.28-1.35(m,15H)，0.91-0.97(m,1H);13C NMR(100MHz,CDCl3):δ173.6，173.5(CCO)，166.4 (C1)，151.5(C3)，135.7(C11)，131.1(C10)，117.8(C2)，76.7(C4)，75.7(C7)，71.7(C15)，71.1， 71.1(OCH(CH3)2)，52.1(NHCHCH3)，50.2(C5)，44.0(C8)，43.0(C9)，38.5(C14)，34.1(C6)， 31.8(C12)，26.6(C13)，23.8，23.7，23.7(OCH(CH3)2)，21.1，21.1(NHCHCH3)，20.8(C16);ESI-MS: m/z[M+H]+516.3;[M+Na]+538.3)。
实施例4
(+)-Brefeldin A磷酸氨基酸酯类化合物在不同pH值缓冲液中的化学稳定性：
为考察(+)-Brefeldin A磷酸氨基酸酯类化合物在室温下不同pH值缓冲液中的化学稳定性， 采用HPLC同步跟踪检测在不同pH值水溶液中，不同时间点前药的百分比。旨在考察和对比 前药在不同pH值下的水解速率，为血浆中代谢研究及药物设计、改进提供参考，进而为新药 开发奠定基础。具体操作方法如下：精密吸取2.5mL各前药S7-01的DMSO溶液（浓度为1.00 mg/mL），置于25mL量瓶中，分别加入不同pH值的缓冲液，稀释至刻度，摇匀。再精密吸取 10mL该液，置于离心管中，平行操作3份，放入37±0.5℃恒温水浴锅中，于不同时间取样1 mL，进样20μL，HPLC测定前药的浓度变化,平行做三份样品。以残余药物的含量百分量对时 间（t）作图。选择部分(+)-Brefeldin A磷酸氨基酸酯在不同pH值缓冲液中的实验进行举例(图 1)。
实施例5
(+)-Brefeldin A磷酸氨基酸酯类化合物的酯酶代谢：
精密吸取各前药S7-01贮备液（浓度为10.00mg/mL）10μL，加至990μL在37±0.5℃水浴 预热的含有30Unints酯酶的Tris缓冲液中（pH7.4），涡旋10s，于不同时间取样100μL，经 甲醇沉淀，1000转离心，取上清，HPLC测定前药的浓度变化，平行做三份样品。以残余前药 量以及原药(+)-Brefeldin A生成量的O.D.值对时间（t）作图。选择部分(+)-Brefeldin A磷酸氨 基酸酯在酯酶缓冲液中的实验进行举例(图2)。
实施例6
选择部分抗肿瘤的实验研究结果进行举例。选择肺癌细胞A549作为检测细胞株，用MTT 法测定(+)-Brefeldin A及其羟基磷酸氨基酸酯类衍生物的抗肿瘤活性。MTT法实验结果显示： (+)-Brefeldin A及其羟基磷酸氨基酸酯类衍生物对人肺癌A549细胞的增殖有显著抑制作用， 且呈明显的浓度依赖性。布雷菲德菌素A对人肺癌A549细胞72h的半数抑制浓度约为 0.04μM/L，而布雷菲德菌素A的羟基磷酸氨基酸酯类衍生物对人肺癌A549细胞72h的半数 抑制浓度0.05μM/L～100M/L。布雷菲德菌素A的羟基酯类衍生物部分化合物因为羟基侧链 的引入增强的活性，而部分布雷菲德菌素A羟基酯类衍生物作为布雷菲德菌素A的前药发挥 抗肿瘤活性，因为酯的种类不同，释放(+)-BrefeldinA的快慢不一样，所以抗肿瘤活性不同程 度地弱于布雷菲德菌素A。(+)-Brefeldin A羟基磷酸氨基酸酯类衍生物的对肿瘤细胞A549 的半数抑制率见图3。
实施例7
布雷菲德菌素A的羟基酯类衍生物的药动性质测定：
①.将样品S7-01用5%(v:v)DMSO溶解完全，然后加入45%(v:v)的聚乙二醇400，混 匀，最后用50%(v:v)生理盐水稀释。
②.选取250-280g的SD大鼠4只，雌雄并用。在代谢笼中饲养12h后，称重，用乙醚 麻醉，切开颈部皮肤，对大鼠实施颈动脉和静脉插管手术。待大鼠苏醒后，由动脉导管给药， 静脉取血。在给药后不同时间点取血300μL，立即转入含有肝素钠溶液的1mL离心管，并 以6000rps离心2min，定量取上清血浆100μL，保存在-20℃，直到检测。
③.测定前将血浆解冻，取100μL，加入含有内标紫杉醇（50ng/mL）的甲基叔丁基醚1mL， 于漩涡振荡器上混合均匀10min，15000r/min条件下离心10min沉淀蛋白，取出上清液，室 温下氮气吹干，置-20℃冰箱保存，直至检测。检测时，用100μL流动相溶解样品，上样20 μL进行HPLC/MS/MS检测,得到质谱响应峰面积的数据，对照标准工作曲线，计算血液中 (+)-Brefeldin A的浓度。
④.根据以上数据，绘制血药浓度-时间曲线图(图4)。分别由WinNonlin Professional Edition Version2.1(Pharsight Corporation,Mountain View,CA,USA)动力学软件（为公知的软件）计算 相关动力学参数。
表1药代动力学数据
表1给出药代动力学数据。