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1、(10)申请公布号 CN 103667275 A (43)申请公布日 2014.03.26 CN 103667275 A (21)申请号 201310681868.8 (22)申请日 2013.12.13 C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) (71)申请人 江西省林业科学院 地址 330032 江西省南昌市经济技术开发区 枫林大道 1629 号 (72)发明人 温强 刘丽婷 徐立安 徐林初 周文才 叶金山 朱恒 黄敏仁 (74)专利代理机构 南昌市平凡知识产权代理事 务所 36122 代理人 夏材祥 (54) 发明名称 油茶 SSR 分子标记 (57)。
2、 摘要 一种油茶SSR分子标记， 包括油茶DNA序列的 获得及预处理、 DNA 序列中 SSR 位点的检索、 SSR 引物的设计与合成、 SSR 标记体系的建立、 多态性 SSR标记的筛选。 检索利用454测序得到油茶基因 组序列及 EST 序列中含有简单序列重复单元的、 符合条件的序列， 筛选得到 12 个多态性丰富的 SSR 标记 CO_gSSR11、 CO_gSSR12、 CO_gSSR14、 CO_ gSSR16、 CO_gSSR19、 CO_gSSR20、 CO_eSSR01、 CO_ eSSR04、 CO_eSSR16、 CO_eSSR40、 CO_eSSR44、 CO_ eSSR。
3、48。 本发明适用于油茶种质资源的遗传评价、 种质鉴定及分子标记辅助育种研究， 重复性好、 可 靠性高， 是一种非常有效的分子标记。 (51)Int.Cl. 权利要求书 4 页 说明书 9 页 序列表 6 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书4页 说明书9页 序列表6页 附图3页 (10)申请公布号 CN 103667275 A CN 103667275 A 1/4 页 2 1. 一种油茶 SSR 分子标记， 其特征包括 ： 微卫星分子标记编号、 微卫星分子标记所对应 的核苷酸序列、 微卫星分子标记所对应的 12 个位点的引物序列 ； 所述的。
4、微卫星标记编号为 ： CO_gSSR11、 CO_gSSR12、 CO_gSSR14、 CO_gSSR16、 CO_gSSR19、 CO_gSSR20、 CO_eSSR01、 CO_eSSR04、 CO_eSSR16、 CO_eSSR40、 CO_eSSR44、 CO_eSSR48 ； 所述微卫星分子标记所对应的核苷酸序列分别为 ： 权 利 要 求 书 CN 103667275 A 2 2/4 页 3 权 利 要 求 书 CN 103667275 A 3 3/4 页 4 所述 12 个位点为 ： CO_gSSR11、 CO_gSSR12、 CO_gSSR14、 CO_gSSR16、 CO_gS。
5、SR19、 CO_ gSSR20、 CO_eSSR01、 CO_eSSR04、 CO_eSSR16、 CO_eSSR40、 CO_eSSR44、 CO_eSSR48， 各位点所对应的引物序列分别为 ： CO_gSSR11F ： GCACAATCCTTTCACTTT CO_gSSR11R ： TGTTTGAGGTACAACCGT CO_gSSR12F ： ACAAGGAGGAGAACGAAT CO_gSSR12R ： CACGCTCCCACTACATAA CO_gSSR14F ： TGGGGTATTCTTTTGCTT CO_gSSR14R ： CAGTACACCTCACTTGGA CO_gSSR。
6、16F ： CCATCTTCGTTGCTATTA CO_gSSR16R ： CGGTGATGACGAGGTGAG CO_gSSR19F ： TTAGTTTAGCCAAACTTG CO_gSSR19R ： ACTCTTTAGTTGATCAGATG CO_gSSR20F ： TGGTGGTCTGATAGTGCC CO_gSSR20R ： ATGCGAGCTTCATTGTTA CO_eSSR01F ： ACTCCCAGTCACCTCCCT CO_eSSR01R ： CAAAGCCTCGAAATCGTC CO_eSSR04F ： GTGGGCAAGGCAACAAAT 权 利 要 求 书 CN 1036。
7、67275 A 4 4/4 页 5 CO_eSSR04R ： TGAGGGAGCAAAGGTAGA CO_eSSR16F ： AGAACCCTCCATTGAAAC CO_eSSR16R ： GTCCTCGTCCAAGAAGTA CO_eSSR40F ： CGCCAACAACCTCCGACAA CO_eSSR40R ： GCGGCAGAAAGCACAGCAA CO_eSSR44F ： ATTTGCGGGTATGGATGT CO_eSSR44R ： GTGGCTCAACTGGAAGGA CO_eSSR48F ： GAAAGCACAGCGAAGAGC CO_eSSR48R ： GCAGACACCGT。
8、GGACAAG。 2. 根据权利要求 1 所述油茶 SSR 标记体系特征包括 ： PCR 反应体系和 PCR 反应程序。 PCR 反应体系 ： 10l 中含 10PCR 缓冲液 1l， Mg2 2.5mM， dNTPs200M， 上下游引 物各 0.2M， Taq 聚合酶 1U， DNA30ng 左右 ； PCR 反应程序 ： 94预变性 5min ； 94， 30s， Ta， 30s， 72， 30s， 30 个循环 ； 最后 72延 伸 1min， 8 度保存。各引物对应的退火温度 Ta 详见下表 ： 引物特性表 ： 位点， 引物序列， 重复基序， 片段大小， 退火温度。 权 利 要 求 。
9、书 CN 103667275 A 5 1/9 页 6 油茶 SSR 分子标记 技术领域 0001 本发明涉及一种 DNA 分子标记技术， 具体涉及为油茶微卫星遗传标记的开发技 术， 适用于油茶的遗传多样性研究， 种质鉴定和亲缘关系分析。 背景技术 0002 微卫星 （Microsatellite） 是指广泛散布于基因组中的以少数几个核苷酸 （多数为 2-4 个） 为单位的多次串联重复的 DNA 序列， 人们称之为简单重复序列 （Simple sequence repeats， SSR） ， 是基因组中变异率相对较高一类 DNA 序列。近些年来， SSR 已经成为最流行 的遗传标记。作为检测效率。
10、较高的共显性标记， SSR 标记集中了其它分子标记的优点， 如典 型的共显性和多等位基因， 具备高的多态性， 能准确区分亲缘关系非常相近的个体 ； DNA 的 用量少， 扩增结果的重现性高， 可以有效地实现简单， 快速的 PCR 操作， 同时基因型可通过 琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳分析， 也可通过引物的荧光标记进行自动分析。但 是， SSR 标记的开发依赖于拥有大量的 DNA 序列基础， 而在以往， 传统的微卫星开发途径主 要通过构建基因组文库， 费时耗力并且效率不高， 局限了微卫星的运用。 随着植物基因组学 及生物信息学的发展， 大规模基因测序技术日新月异， 第二代以 454 测序为。
11、标志的测序技 术更是推动了高通量基因组测序时代的来临。 利用微卫星搜索工具从基因测序得到的大量 DNA 序列中查找微卫星， 已然成为开发微卫星标记最为便捷、 有效的方式。目前已在如松柏 类树种、 杨柳科树种、 桉树、 壳斗科树种及大部分蔷薇科树种等许多林木中开发并应用微卫 星标记， 并广泛的运用于指纹分析、 构建遗传连锁图谱、 群体遗传结构和进化分析研究。 0003 油茶 （Camellia oleifera） 称之为东方的橄榄树而闻名于世， 与油棕、 油橄榄和椰 子并称为世界四大木本食用油料树种。油茶主产品茶油是优质高级食用油， 其成分以油酸 和亚油酸为主的不饱和脂肪酸含量在 90以上， 易。
12、于人体吸收， 耐贮藏， 不易酸败， 且色美 味香， 深受人民的喜爱。目前油茶优树在全国范围内集中决选， 各主产区间存在相互引种 栽培的普遍现象， 这就导致油茶各无性系的自然地域性特征不强， 油茶良种、 无性系及地方 农家品种等相互混杂在所难免， 采用有效的分子标记在遗传学角度开展油茶品种真实性的 分子甄别在生产应用中变的尤为迫切 ； 而为了研究油茶遗传变异规律， 同时从大量的油茶 遗传资源中选育并丰富油茶良种， 开展油茶分子标记辅助育种也是其行之有效的方法。当 前油茶育种工作者广泛采用的分子标记为现有的通用型分子标记， 如 RAPD、 ISSR 等均为显 性标记， 存在重复性差的严重缺陷， 及。
13、共迁移的缺点。与其它分子标记相比， SSR 标记数量 丰富， 基因组覆盖度高， 呈现多基因特点， 信息含量高， 表现为共显性遗传， 重复性好， 且 SSR 分析对 DNA 数量及纯度要求不高。然而迄今， 油茶微卫星分子标记的开发利用研究甚少， 国内只有少量利用茶树微卫星标记引物随机扩增油茶基因组的报道 （刘冰等， 油茶 SSR-PCR 反应体系建立与优化.安徽农业大学学报,2011,38(6):858-862） ， 此外除温强等 （Wen Q et al.Development of polymorphic microsatellite markers in Camellia chekiang。
14、oleo sa(Theaceae),American Journal of Botany,2012,5(1):e203-e205.） 利用油茶类物种浙 江红花油茶的 EST 序列开发了 18 对浙江红花油茶的 SSR 标记外， 未见利用油茶 DNA 序列开 说 明 书 CN 103667275 A 6 2/9 页 7 发油茶 SSR 标记的报道。 发明内容 0004 本发明的目的是针对现有技术尚未利用油茶 DNA 序列开发油茶微卫星标记的现 状， 利用 454 测序技术获得普通油茶基因组序列与 EST 序列， 应用生物信息学方法， 开发出 油茶微卫星分子标记， 建立油茶微卫星的技术体系， 并应。
15、用于油茶优良高产无性系的遗传 多样性研究及 DNA 指纹图谱构建。 0005 为了实现上述目的， 本发明的技术方案为 ： 0006 （1） 所述油茶 SSR 分子标记特征包括 ： 微卫星分子标记编号、 微卫星分子标记所对 应的核苷酸序列、 微卫星分子标记所对应的 12 个位点的引物序列 ； 0007 所 述 的 微 卫 星 标 记 编 号 为 ： CO_gSSR11、 CO_gSSR12、 CO_gSSR14、 CO_gSSR16、 CO_gSSR19、 CO_gSSR20、 CO_eSSR01、 CO_eSSR04、 CO_eSSR16、 CO_eSSR40、 CO_eSSR44、 CO_ 。
16、eSSR48 ； 0008 所述微卫星分子标记所对应的核苷酸序列分别为 ： 0009 0010 说 明 书 CN 103667275 A 7 3/9 页 8 0011 说 明 书 CN 103667275 A 8 4/9 页 9 0012 说 明 书 CN 103667275 A 9 5/9 页 10 0013 所述 12 个位点为 ： CO_gSSR11、 CO_gSSR12、 CO_gSSR14、 CO_gSSR16、 CO_gSSR19、 CO_ gSSR20、 CO_eSSR01、 CO_eSSR04、 CO_eSSR16、 CO_eSSR40、 CO_eSSR44、 CO_eSSR4。
17、8， 0014 各位点所对应的引物序列分别为 ： 0015 CO_gSSR11F ： GCACAATCCTTTCACTTT 0016 CO_gSSR11R ： TGTTTGAGGTACAACCGT 0017 CO_gSSR12F ： ACAAGGAGGAGAACGAAT 0018 CO_gSSR12R ： CACGCTCCCACTACATAA 0019 CO_gSSR14F ： TGGGGTATTCTTTTGCTT 0020 CO_gSSR14R ： CAGTACACCTCACTTGGA 0021 CO_gSSR16F ： CCATCTTCGTTGCTATTA 0022 CO_gSSR16R 。
18、： CGGTGATGACGAGGTGAG 0023 CO_gSSR19F ： TTAGTTTAGCCAAACTTG 0024 CO_gSSR19R ： ACTCTTTAGTTGATCAGATG 0025 CO_gSSR20F ： TGGTGGTCTGATAGTGCC 0026 CO_gSSR20R ： ATGCGAGCTTCATTGTTA 0027 CO_eSSR01F ： ACTCCCAGTCACCTCCCT 0028 CO_eSSR01R ： CAAAGCCTCGAAATCGTC 0029 CO_eSSR04F ： GTGGGCAAGGCAACAAAT 0030 CO_eSSR04R ： 。
19、TGAGGGAGCAAAGGTAGA 0031 CO_eSSR16F ： AGAACCCTCCATTGAAAC 0032 CO_eSSR16R ： GTCCTCGTCCAAGAAGTA 0033 CO_eSSR40F ： CGCCAACAACCTCCGACAA 0034 CO_eSSR40R ： GCGGCAGAAAGCACAGCAA 0035 CO_eSSR44F ： ATTTGCGGGTATGGATGT 0036 CO_eSSR44R ： GTGGCTCAACTGGAAGGA 0037 CO_eSSR48F ： GAAAGCACAGCGAAGAGC 0038 CO_eSSR48R ： GC。
20、AGACACCGTGGACAAG 0039 （2） SSR 标记体系的特征包括 ： PCR 反应体系和 PCR 反应程序 ； 0040 PCR 反应体系 ： 10l 中含 10PCR 缓冲液 1ul， Mg2 2.5mM， dNTPs0.2mM， 上下游 引物各 0.2M， Taq 聚合酶 1U， DNA30ng 左右 ； 0041 PCR 反应程序 ： 94预变性 5min ； 94， 30s， Ta， 30s， 72， 30s， 30 个循环 ； 最后 72延伸 1min， 8 度保存。各引物对应的退火温度 （Ta） 详见下表 ： 说 明 书 CN 103667275 A 10 6/9 页。
21、 11 0042 引物特性表 ： 位点， 引物序列， 重复基序， 片段大小， 退火温度。 0043 0044 对经 454 测序得到的油茶基因组序列及 EST 序列进行整理， 挖掘 SSR 位点信息， 依 据SSR位点侧翼序列进行SSR-PCR引物设计、 合成与引物筛选。 从搜索到的油茶EST序列中 的1815个SSR位点及基因组序列中的3229个SSR位点所对应序列中各随机选择50条含不 同简单序列重复单元并符合条件的序列 ； 最终获得 12 个扩增条带清晰， 多态性较好的 SSR 标记， 编号分别为 CO_gSSR11、 CO_gSSR12、 CO_gSSR14、 CO_gSSR16、 C。
22、O_gSSR19、 CO_gSSR20、 CO_eSSR01、 CO_eSSR04、 CO_eSSR16、 CO_eSSR40、 CO_eSSR44、 CO_eSSR48。 0045 CO_gSSR11为325个核苷酸、 CO_gSSR12为424个核苷酸、 CO_gSSR14为432个核苷 酸、 CO_gSSR16 为 519 个核苷酸、 CO_gSSR19 为 189 个核苷酸、 CO_gSSR20 为 408 个核苷酸、 CO_eSSR01 为 333 个核苷酸、 CO_eSSR04 为 308 个核苷酸、 CO_eSSR16 为 476 个核苷酸、 CO_ eSSR40 为 407 个。
23、核苷酸、 CO_eSSR44 为 399 个核苷酸、 CO_eSSR48 为 388 个核苷酸。 0046 本发明的有益效果 ： 本发明可应用于油茶种质资源的遗传多样性评价， 适用于不 同地理种源的油茶品种、 无性系、 农家品种的遗传变异、 种质鉴定及分子标记辅助育种研 究， 重复性好、 可靠性高， 是一种非常有效的分子标记。 附图说明 0047 图 1CO_gSSR11 位点扩增 18 个赣无系列油茶高产无性系的 DNA 样本的银染 PAGE 图 ； 0048 图 2CO_gSSR12 位点扩增 18 个赣无系列油茶高产无性系的 DNA 样本的银染 PAGE 说 明 书 CN 1036672。
24、75 A 11 7/9 页 12 图 ； 0049 图 3CO_gSSR14 位点扩增 18 个赣无系列油茶高产无性系的 DNA 样本的银染 PAGE 图 ； 0050 图 4CO_gSSR16 位点扩增 18 个赣无系列油茶高产无性系的 DNA 样本的银染 PAGE 图 ； 0051 图 5CO_gSSR19 位点扩增 18 个赣无系列油茶高产无性系的 DNA 样本的银染 PAGE 图 ； 0052 图 6CO_gSSR20 位点扩增 18 个赣无系列油茶高产无性系的 DNA 样本的银染 PAGE 图 ； 0053 图 7CO_eSSR01 位点扩增 18 个赣无系列油茶高产无性系的 DNA。
25、 样本的银染 PAGE 图 ； 0054 图 8CO_eSSR04 位点扩增 18 个赣无系列油茶高产无性系的 DNA 样本的银染 PAGE 图 ； 0055 图 9CO_eSSR16 位点扩增 18 个赣无系列油茶高产无性系的 DNA 样本的银染 PAGE 图 ； 0056 图 10CO_eSSR40 位点扩增 18 个赣无系列油茶高产无性系的 DNA 样本的银染 PAGE 图 ； 0057 图 11CO_eSSR44 位点扩增 18 个赣无系列油茶高产无性系的 DNA 样本的银染 PAGE 图 ； 0058 图 12CO_eSSR48 位点扩增 18 个赣无系列油茶高产无性系的 DNA 样。
26、本的银染 PAGE 图。 具体实施方式 0059 为了详细说明本发明油茶微卫星标记的技术内容、 构造特征， 以下结合实施方式 并配合附图作进一步说明。 0060 实施例 1 ： 0061 1. 油茶 SSR 分子标记的制备方法 0062 1.1 油茶 DNA 序列的获得及预处理 0063 采用本研究组的方法 （参照 Jiang C et al.Efficient extraction of RNA from various Camellia species rich in secondary metabolites for deep transcriptome sequencing and g。
27、ene expression analysis.African Journal of Biotechnology,2011 ,10(74):16769-16773.） 提取油茶 DNA 及 RNA， 分别构建基因组及转录组文库， 经各 1/4 个 454GS FLX 高通量测序反应获得基因组及 EST 序列。EST 序列采用 SeqClean 和 Lucy 软件 去掉低质量序列后经 CAP3 拼接， 测序得到的基因组序列用 454 测序仪自带的 Newbler 软件 进行处理和拼接。 0064 1.2 油茶 DNA 序列中 SSR 位点的筛选 0065 采用 MISA 软件 （http:/pg。
28、rc.ipk-gatersleben.de/misa/） 检索各 DNA 序列中的 SSR 位点。对 454 序列中的 2-6 核苷酸重复类型 SSR 进行检索， 检索标准同时包括精确型 （perfect） 及复合型 （compound） SSR 位点， 含二、 三、 四、 五和六核苷酸类型的重复序列长度 说 明 书 CN 103667275 A 12 8/9 页 13 18bp， 最小重复数分别为 9、 6、 5、 5 和 4 次。得到一系列含 SSR 位点的序列。 0066 1.3 油茶 SSR 引物的设计与合成 0067 采用PRIMER5.0软件对串联重复长度大于18bp的Unigen。
29、e （无冗余独立基因序列） 进行 SSR 引物设计。引物设计的要求为 ： 扩增产物长度 100 500bp ； 引物长度 18 24bp， 各距重复序列不少于 20bp， GC 含量 40 60%， 退火温度 Tm 值 50 62， 且上下游引物 的 Tm 值相差不大于 5 ； 尽量避免引物二聚体 （dimer） 、 发夹结构 （hairp-in） 、 错配 （false primer） 等。其中， 利用油茶 3065 条具有微卫星的基因组及 1696 条具有微卫星的 EST 序列 随机设计 gSSR 引物与 eSSR 引物各 50 对， 分别编号 CO_gSSR1-50 及 CO_eSSR1。
30、-50。引物设 计完成后， 由上海捷瑞生物工程有限公司合成。 0068 1.4 油茶 SSR 引物的筛选 0069 试验所用所有样本的基因组总 DNA 的提取采用本研究组优化的 CTAB 法 （参照 Jiang C et al.Efficient extraction of RNA from various Camellia species rich in secondary metabolites for deep transcriptome sequencing and gene expression analysis.African Journal of Biotechnology,20。
31、11,10(74):16769-16773.） ， 选择5个赣 无系列的油茶高产无性系作为多态性引物筛选样本。 0070 ABI9700（Applied Biosystems， Carlsbad， California， USA） 执行 PCR 程序。经 优化筛选， 我们构建了一个在油茶物种中较为广谱的 SSR 标记体系。PCR 反应体系 ： 10l 中含 10PCR 缓冲液 1ul， Mg2 2.5mM， dNTPs0.2mM， 上下游引物各 0.2M， Taq 聚合酶 1U （5U/l） ， DNA30ng 左右。PCR 反应程序 ： 94预变性 5min ； 94， 30s， Ta， 3。
32、0s， 72， 30s， 30 个循环 ； 最后 72延伸 1min， 8 度保存， 各引物对应的退火温度 （Ta） 详见表 1。 0071 采用8%聚丙烯酰胺凝胶 （10mL灌胶液中含4.2g尿素， 1.25ml10TBE， 70l APS， 10l TEMED， 2.0ml40%胶 （丙烯酰胺:甲叉丙烯酰胺=39:1 （w/w） ） ， 在垂直电泳槽 （DYCZ-32 型电泳槽 ( 北京六一 )） 中进行电泳分离， 50bpMarker（天根） 作为标准分子量， 电泳产物经 银染后对各位点进行数据判读。 0072 银染检测步骤为 ： 10l PCR 产物加 6l6 上样缓冲液， 点样孔上样。
33、 1l， 120V 恒压电泳 1 2h 后， 拆玻板固定染色 ； 固定 10min（固定液 10% 乙醇， 0.5% 乙酸 （v/v） ） ， ddH2O 漂洗 2 次， 每次 2min ； 再用 0.15%AgNO3（w/v） 染色 10min， ddH2O 漂洗 2 次每次 2min， 最后显影液 （1.5%NaOH， 0.00756%NaBO4， 0.75%甲醛 （w/v） ） 显影至条带清晰， 数码照相记录。 对扩增结果进行分析后， 共得到 12 对扩增条带清晰、 多态性丰富的 SSR 引物。 0073 2.12 对油茶 SSR 引物的遗产多样性分析 0074 采用多态性性较好的 12。
34、 个 SSR 标记构建了 18 个赣无系列油茶高产无性系的 SSR 指纹图谱。这 18 个高产无性系来至于江西油茶国家良种， 编号为赣无系列， 全部为 6 倍体 物种。PCR 扩增反应体系和反应条件同步骤 1.4。 0075 对于多倍体材料， SSR 的带型将会呈现丰富的变异。数据判读以如下标准， SSR 扩 增谱带显带处记为 “1” ， 缺失或模糊不清处记为 “0” ， 建立0/1二元数据矩阵。 运用POPGEN32 软件计算观察等位基因数目 （A） 、 有效等位基因数目 （Ne） 、 Nei 基因多样度 （h） 、 Shannon 多 样性指数 （I） ， 并统计位点的多态位点百分比 （P。
35、PL） 。 以此来描述12个油茶SSR多态位点的 特征。 0076 由说明书附图 1-12 中可看出， 本发明的 12 个 SSR 位点在供试的 18 个油茶无性系 说 明 书 CN 103667275 A 13 9/9 页 14 样本表现出较好的多态性扩增， 由此可见， 本发明的这 12 个 SSR 标记可用于油茶种质资源 的遗传多样性、 分子指纹图谱构建， 具有很好的重复性， 高多态性， 是一种可靠有效的分子 标记。 0077 以上所揭露的仅为本发明的较佳实施例而已， 当然不能以此来限定本发明之权利 范围， 因此依本发明权利所作的等同变化， 仍属于本发明所涵盖的范围。 说 明 书 CN 1。
36、03667275 A 14 1/6 页 15 0001 序 列 表 CN 103667275 A 15 2/6 页 16 0002 0003 序 列 表 CN 103667275 A 16 3/6 页 17 0004 序 列 表 CN 103667275 A 17 4/6 页 18 0005 序 列 表 CN 103667275 A 18 5/6 页 19 0006 序 列 表 CN 103667275 A 19 6/6 页 20 序 列 表 CN 103667275 A 20 1/3 页 21 图 1 图 2 图 3 图 4 图 5 说 明 书 附 图 CN 103667275 A 21 2/3 页 22 图 6 图 7 图 8 图 9 图 10 说 明 书 附 图 CN 103667275 A 22 3/3 页 23 图 11 图 12 说 明 书 附 图 CN 103667275 A 23 。