《一种-甘露聚糖酶活性的测定方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种-甘露聚糖酶活性的测定方法.pdf（7页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610031762.7 (22)申请日 2016.01.18 C12Q 1/34(2006.01) (71)申请人 黑龙江大学 地址 150080 黑龙江省哈尔滨市南岗区学府 路 74 号黑龙江大学 (72)发明人 葛菁萍 平文祥 赵丹 杜仁鹏 金曼 (74)专利代理机构 北京市诚辉律师事务所 11430 代理人 朗坚 (54) 发明名称 一种 - 甘露聚糖酶活性的测定方法 (57) 摘要 本发明涉及一种 - 甘露聚糖酶活性的测定 方法， 其包括如下步骤 ： (1) 以缓冲液 A 和魔芋粉 制备底物溶液 ； (2) 将粗酶液加入底物。
2、溶液中， 在 适宜温度下反应 ； (3) 将粗酶液以与步骤 (2) 相 同的比例加入缓冲液 A 中， 在与步骤 (2) 相同的 适宜温度下反应相同时间 ； (4) 在比色管中分别 加入步骤 (2) 和步骤 (3) 的所得溶液以及 DNS 试 剂， 沸水浴显色后定容 ； 步骤 (2) 所得溶液以底物 溶液作为空白， 步骤 (3) 所得溶液以缓冲液 A 作 为空白， 以检测 OD550nm值 ； (5) 步骤 (2) 所得溶液 OD550nm值减去步骤 (3) 所得溶液 OD550nm值在标准 曲线中查找对应生成甘露糖的量， 并通过公式计 算 - 甘露聚糖酶活力。 (51)Int.Cl. (19)。
3、中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 附图1页 CN 105506059 A 2016.04.20 CN 105506059 A 1.一种 -甘露聚糖酶活性的测定方法， 其包括如下步骤： (1)以缓冲液A和魔芋粉制备底物溶液； (2)将 -甘露聚糖酶粗酶液加入底物溶液中， 并进行反应； (3)将 -甘露聚糖酶粗酶液以与步骤(2)相同的比例加入缓冲液A中， 在与步骤(2)相同 的温度下反应相同时间； (4)在比色管中分别加入步骤(2)和步骤(3)的所得溶液以及DNS试剂， 沸水浴显色后定 容； 步骤(2)所得溶液以底物溶液作为空白， 步骤(3)所得溶液以。
4、缓冲液A作为空白， 以检测 OD550nm值； (5)步骤(2)所得溶液OD550nm值减去步骤(3)所得溶液OD550nm值在标准曲线中查找对应生 成甘露糖的量， 并通过下式计算 -甘露聚糖酶活力： 2.根据权利要求1所述的 -甘露聚糖酶活性的测定方法， 其特征在于， 所述缓冲盐A为 pH值4.0的Na2HPO4-柠檬酸缓冲液或CH3COOH-CH3COONa溶液。 3.根据权利要求1-2任一项所述的 -甘露聚糖酶活性的测定方法， 其特征在于， 步骤 (1)中所述底物溶液的魔芋粉浓度为0.1-1.0(w/v)， 优选为0.3-0.7(w/v)， 更优选 为0.5(w/v)。 4.根据权利要求。
5、1-3任一项所述的 -甘露聚糖酶活性的测定方法， 其特征在于， 步骤 (2)中 -甘露聚糖酶粗酶液与底物溶液的配比以及步骤(3)中 -甘露聚糖酶粗酶液与缓冲 液A的配比为1:5-10(v/v)， 优选为1:9(v/v)。 5.根据权利要求1-4任一项所述的 -甘露聚糖酶活性的测定方法， 其特征在于， 步骤 (2)和步骤(3)的反应温度为50-60， 优选为55； 反应时间为20-40min， 优选为30min。 6.根据权利要求1-5任一项所述的 -甘露聚糖酶活性的测定方法， 其特征在于， 还包括 绘制甘露糖标准曲线的步骤。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105506059 A 2 一种 。
6、-甘露聚糖酶活性的测定方法 技术领域 0001 本发明涉及一种酶活检测方法， 具体涉及一种 -甘露聚糖酶活性的测定方法。 背景技术 0002 -1,4-D-甘露聚糖酶( -1,4-D-mannan,mannanohydrolase,EC.3.2.1.78)， 简称 -D-甘露聚糖酶或 -甘露聚糖酶( -D-mannanase, -mannanase)， 是一类能够水解含有 - 1,4-D-甘露糖苷键的甘露糖(其中包括甘露聚糖、 半乳甘露聚糖、 葡甘露聚糖等)的水解内 切酶， 属于半纤维素酶类， 可广泛地用于工业、 农牧业生产的多个领域， 关于该酶的研究与 开发近年来一直受到许多科研工作者的普遍。
7、重视。 -甘露聚糖酶可以将多糖降解为低聚 糖， 因生产原料和 -甘露聚糖酶来源的不同， 甘露聚糖的水解产物、 功能、 性质及应用环境 也不尽相同。 因此有效测定 -甘露聚糖酶活性是生产高活性酶的有效途径， 而传统方法对 -甘露聚糖酶的测定易受到发酵液中残留培养基的影响， 其结果严重偏离真实值。 本发明 以Akino方法为基础， 研制出一种有效的测定地衣芽胞杆菌(Bacilluslicheniformis)发 酵过程中 -甘露聚糖酶的活性大小。 该方法的建立可以大大的减小发酵液中底物对酶活性 测定的干扰， 使得测定准确性高， 结果真实可靠， 为研究发酵过程中有效的测定 -甘露聚糖 酶活性提供实践。
8、指导。 发明内容 0003 本发明涉及一种 -甘露聚糖酶活性的测定方法， 其包括如下步骤： 0004 (1)以缓冲液A和魔芋粉制备底物溶液； 0005 (2)将粗酶液加入底物溶液中， 在适宜温度下反应； 0006 (3)将粗酶液以与步骤(2)相同的比例加入缓冲液A中， 在与步骤(2)相同的适宜温 度下反应相同时间； 0007 (4)在比色管中分别加入步骤(2)和步骤(3)的所得溶液以及DNS试剂， 沸水浴显色 后定容； 步骤(2)所得溶液以底物溶液作为空白， 步骤(3)所得溶液以缓冲液A作为空白， 以 检测OD550nm值； 0008 (5)步骤(2)所得溶液OD550nm值减去步骤(3)所得。
9、溶液OD550nm值在标准曲线中查 找对应生成甘露糖的量， 并通过下式计算 -甘露聚糖酶活力： 0009 0010 进一步地， 所述缓冲盐A为pH值4 .0的Na2HPO4-柠檬酸缓冲液或CH3COOH- CH3COONa溶液。 0011 进一步地， 步骤(1)中所述底物溶液的魔芋粉浓度为0.1-1.0(w/v)， 优选为 0.3-0.7(w/v)， 更优选为0.5(w/v)。 0012 进一步地， 步骤(2)中粗酶液与底物溶液的配比以及步骤(3)中粗酶液与缓冲液A 的配比为1:5-10(v/v)， 优选为1:9(v/v)。 说明书 1/4 页 3 CN 105506059 A 3 0013 。
10、进一步地， 步骤(2)和步骤(3)的反应温度为50-60， 优选为55； 反应时间为20- 40min， 优选为30min。 0014 进一步地， 还包括绘制甘露糖标准曲线的步骤。 0015 本发明在原有酶活测定方法的基础上研制出针对B.licheniformisHDGLJT-01利 用魔芋粉产 -甘露聚糖酶的酶活检测方法， 解决由于发酵液中残留的魔芋粉和底物溶液中 未被消耗的魔芋粉使得酶活力结果较真实值偏高的问题， 真实客观的测定 -甘露聚糖酶成 为可能。 该方法的建立为不同底物所导致酶活性测定不准确性的研究提供理论参考， 为工 业化生产高活性的 -甘露聚糖酶提供实践指导。 0016 本发明。
11、以Akino方法为基础， 加入两个对照组， 以此消除试验过程中发酵液中残留 的魔芋粉造成的影响和底物溶液未被消耗的魔芋粉造成的影响。 当以空白缓冲液做对照 时， 所得的酶活力变化趋势与实验组基本相同， 均呈现了先缓慢上升， 而后下降的趋势。 而 以水为对照时， 波动较大， 酶活变化趋势有时与实验组变化趋势并不完全吻合， 此时此方法 并不能排除发酵液中魔芋粉的影响。 可见， 以空白缓冲液作为对照时， 可以更准确的描述酶 活力变化趋势。 附图说明 0017 图1为当以水和缓冲液做对照时酶活力变化趋势。 具体实施方式 0018 实施例1、 地衣芽孢杆菌种子液的制备 0019 在无菌条件下挑取适量斜面。
12、保藏菌株B.licheniformisHDGLJT-01于HDGLJT-01 (该菌株已在之前专利CN102191235A中公开,保藏于中国典型培养物保藏中心， 保藏编号 CCTCCM209288)20mL/50mLLB液体培养基中， 37、 160r/min振荡10h； 再以1(v/v)接种 量转接入100mL/500mL发酵种子培养基中(魔芋粉10g， 蛋白胨30g， K2HPO43H2O5g， MgSO47H2O0.2g， 蒸馏水溶解并补足至1L， 调pH值至8.0， 121高压湿热灭菌15min)， 37 、 160r/min振荡12h获得种子液。 0020 实施例2、 地衣芽孢杆菌扩。
13、大发酵培养方式 0021 本实施例分别在摇瓶水平及5L发酵罐两种方式下进行培养， 所以在进行摇瓶发酵 培养时， 是将种子液以6.7(v/v)的接种量， 接入100mL/250mL的三角瓶， 培养温度37、 160r/min， 发酵48h结束； 在发酵罐扩大培养时， 是以6.7(v/v)的接种量， 在火焰的保护下 接入5L发酵罐中进行发酵培养， 培养温度37、 搅拌速率300r/min、 通气量3L/min， 发酵48h 结束。 产酶培养基为： 魔芋粉60g(灭菌完毕后加入发酵罐)， 蛋白胨30g， K2HPO43H2O5g， MgSO47H2O0.2g， 蒸馏水溶解并补足至3L， 调pH值至8。
14、.0， 121高压湿热灭菌20min。 0022 实施例3、 粗酶液样品的制备 0023 取适量发酵液样品(包括摇瓶水平及发酵罐水平)， 4500r/min、 4冷冻离心 20min， 取上清即为粗酶液。 0024 实施例4、 绘制甘露糖标准曲线 0025 a.依照表1所示设计配制甘露糖梯度溶液， 每25mL比色管中加入3.0mLDNS试剂， 煮沸显色5min后， 加蒸馏水定容至25mL， 充分混匀。 以0号比色管为空白测定OD550nm。 说明书 2/4 页 4 CN 105506059 A 4 0026 表1甘露糖梯度溶液设计 0027 0028 b.以甘露糖含量(mg)为横坐标X， 以O。
15、D550nm为纵坐标Y， 绘制标准曲线。 0029 实施例5、 测定 -甘露聚糖酶活力 0030 以Akino方法为基础， 略作修改测定酶活力。 以pH值4.0的Na2HPO4-柠檬酸缓冲液 配制魔芋粉底物溶液， 浓度0.5(w/v)。 将0.1mL粗酶液加入0.9mL底物溶液中， 置于55水 浴锅精确计时反应30min。 之后于每支比色管中加入DNS试剂3mL， 沸水浴显色5min， 冷却后 定容至25mL， 以底物溶液作为空白对照， 测定OD550nm。 一个酶活力单位(U)定义为： 在上述反 应条件下， 每分钟产生相当于1 molD-甘露糖的酶量。 0031 上述方法测定的酶活力结果较真。
16、实值偏高， 这是由发酵液中残留的魔芋粉和底物 溶液中未被消耗的魔芋粉造成的， 因此在上述试验基础上， 加入两个对照组1和2。 对照组1 是将0.1mL粗酶液加入0.9mL水中， 同温度同时间水浴、 沸水浴处理样品， 并以水为空白对 照， 以此消除实验过程中发酵液中残留的魔芋粉造成的影响； 对照组2是将0.1mL粗酶液加 入0.9mL缓冲液中， 同温度同时间水浴、 沸水浴处理样品， 并以缓冲液为空白对照， 以此消除 实验过程中底物溶液未被消耗的魔芋粉造成的影响。 0032 根据实验组减去对照组OD550nm值在标准曲线中查找对应生成的甘露糖量， 并通过 下式计算 -甘露聚糖酶活力： 0033 0。
17、034 公式中30min代表水浴30min， 0.18代表甘露聚糖相对分子质量的180， 为了使计 算结果的单位保持一致， 所以把180缩小了1000倍。 0035 Akino法测定酶活力较酶活力真实值偏高， 根据大量文献查阅和反复试验、 分析， 这可能是由于发酵液中残留的魔芋粉和底物溶液中未被消耗的魔芋粉造成的， 因此加入水 对照组和缓冲液对照组， 以此消除实验过程中底物溶液未被消耗的魔芋粉造成的影响。 0036 由图1可以看出， 实验组酶活力值随着发酵时间增长而上升， 到24h左右达到最大 1342.8957.24U/mL， 然后逐渐降低至48h最低， 最低酶活力为221.79U/mL。 。
18、实验同时设定 两个对照， 水对照组和空白缓冲液液对照组， 当以空白缓冲液做对照时， 所得的酶活力变化 趋势与实验组基本相同， 均呈现了前期缓慢上升， 24h达最高酶活， 而后下降的趋势； 而以水 为对照时， 波动较大， 酶活变化趋势有时与实验组变化趋势并不完全吻合， 如图1中8h水对 照组酶活力为289.687.31U/mL， 与实验组8h酶活力297.459.24U/mL几乎无差异； 16h实 验组酶活力为858.7512.97U/mL较12h的酶活力786.1511.23U/mL上升幅度不是很大， 缓冲液对照组16h酶活力为335.509.12U/mL较12h酶活力312.056.24U/mL上升幅度不 大， 这与实验组酶活力变化趋势相似， 而水对照组16h酶活力445.938.32U/mL和302.83 说明书 3/4 页 5 CN 105506059 A 5 7.94U/mL呈现了大幅度的升高， 此时此方法并不能排除发酵液中魔芋粉的影响。 可见， 以空 白缓冲液作为对照时， 可以更准确的描述酶活力变化趋势。 说明书 4/4 页 6 CN 105506059 A 6 图1 说明书附图 1/1 页 7 CN 105506059 A 7 。