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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610044078.2 (22)申请日 2016.01.22 C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (71)申请人 广州医科大学附属第一医院 地址 510120 广东省广州市沿江路 151 号 (72)发明人 刘文宽 周荣 许多 邱淑燕 (74)专利代理机构 北京科亿知识产权代理事务 所 ( 普通合伙 ) 11350 代理人 赵蕊红 (54) 发明名称 一种呼吸道合胞病毒 A/B 亚型多重荧光定量 PCR 检测引物组和。
2、探针组及其试剂盒和制备方法 (57) 摘要 本发明提供了一种呼吸道合胞病毒 A/B 亚型 多重荧光定量 PCR 检测引物组和探针组及其试剂 盒和制备方法。 所述引物组序列如SEQ ID NO ： 1-4 所示， 所述探针组序列如 SEQ ID NO ： 5-6 所示。 本发明还提供了一种呼吸道合胞病毒 A/B 亚型多 重荧光定量 PCR 检测试剂盒， 包括反应管、 酶混合 物、 引物组和探针组， 所述引物组的序列如SEQ ID NO ： 1-4 所示， 所述探针组的序列如 SEQ ID NO ： 5-6 所示。该引物组和探针组及其试剂盒能实现 呼吸道合胞病毒 A/B 亚型的简便分型， 具有特异。
3、 性高、 灵敏度高、 快速、 操作简单方便、 成本低廉等 多种优点。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书8页 序列表2页 附图2页 CN 105543414 A 2016.05.04 CN 105543414 A 1.一种呼吸道合胞病毒A/B亚型多重荧光定量PCR检测引物组和探针组， 其特征在于， 所述引物组序列如SEQIDNO： 1-4所示， 所述探针组序列如SEQIDNO： 5-6所示。 2.一种呼吸道合胞病毒A/B亚型多重荧光定量PCR检测试剂盒， 包括反应管、 反应混合 物、 引物组和探针组， 其特征在于， 所述引。
4、物组的序列如SEQIDNO： 1-4所示， 所述探针组的 序列如SEQIDNO： 5-6所示。 3.一种呼吸道合胞病毒A/B亚型多重荧光定量PCR检测试剂盒的制备方法， 其特征在 于， 其制备方法包括： (1)步骤一： 制备引物 制备RSV-A、 RSV-B的特异性引物及阳性对照beta-actin的特异性引物； 所述RSV-A、 RSV-B的特异性引物序列如SEQIDNO： 1-4所示； 所述阳性对照beta-actin的特异性引物序列如SEQIDNO： 7-8所示； (2)步骤二： 制备探针 制备RSV-A、 RSV-B的特异性探针及阳性对照beta-actin的特异性探针， 其中探针分别。
5、 采用FAM-BHQ1、 Texasred-BHQ2、 JOE-BHQ1标记； 所述RSV-A、 RSV-B的特异性探针序列如SEQIDNO： 5-6所示； 所述阳性对照beta-actin的特异性探针序列如SEQIDNO： 9所示； (3)步骤三： 制备RT-PCR反应体系 RT-PCR缓冲液： PrimeScript一步法RT-PCR试剂盒中的RT-PCR缓冲液； 引物使用量： 7-15pmol； 探针使用量： 0.5-5pmol； 上述引物探针缓冲液混合物的配制： 18 l/反应 酶混合物： 2 l； 模板： 5 l； 反应总体积： 25 l。 权利要求书 1/1 页 2 CN 1055。
6、43414 A 2 一种呼吸道合胞病毒A/B亚型多重荧光定量PCR检测引物组和 探针组及其试剂盒和制备方法 技术领域 0001 本发明属于分子生物学检测技术领域， 具体涉及一种呼吸道合胞病毒A/B亚型多 重荧光定量PCR检测引物组和探针组及其试剂盒和制备方法。 背景技术 0002 呼吸道感染一直是困扰人类最常见、 发生率最高的疾病， 是引起老人和儿童因病 死亡最多病因， 也是新发和突发传染病的最主要病源因素。 每年急性呼吸道感染在发展中 国家导致四至五百万的儿童死亡， 死亡的主要病因是肺炎。 其中呼吸道合胞病毒(RSV, respiratorysyncytialvirus)是最常见的致儿童肺炎。
7、的病原体之一。 0003 RSV是属于副粘病毒科的负链RNA病毒， 可表达11种蛋白。 它可以感染有纤毛的气 道上皮细胞并快速的导致细胞损伤， 是儿童中最重要的导致毛细支气管炎和肺炎的病原 体。 在北京， 48的病毒性肺炎和58的毛细支气管炎系由RSV引起(19801984)， 在美国， 2025的婴幼儿肺炎和5075的毛细支气管炎由RSV引起。 根据我们呼吸疾病国 家重点实验室对广州地区2009年7月至2012年6月三年的监测结果发现在14岁以下儿童急 性呼吸道疾病患者中RSV阳性率最高， 占病原阳性患者的32.5。 0004 RSV根据其抗原性的差异分为A(RSV-A)和B(RSV-B)两。
8、个主要的抗原亚型， 两种亚 型独立传播。 对于两种亚型RSV感染患者的临床特征的研究一直是RSV感染研究的重要的方 向， 对其的研究将为RSV感染的治疗及疫苗的开发提供路径， 具有极为重要的意义。 0005 鉴于RSV感染的严重性， 急需对其进行有效的防控与治疗。 而在进行防控和治疗的 过程中， 首先最关键瓶颈就是准确、 实用的快速检测鉴定技术。 0006 就目前情况， 对RSV-A/B亚型分型检测主要以下几种方法： 病毒分离； 抗原-抗体反 应； 普通RT-PCR/巢式PCR； 单重荧光定量PCR。 相比较几种方法， 前两种方法为经典方法， 但 存在要求条件高、 周期长、 灵敏度不高的问题；。
9、 PCR方法是近些年来所开发的针对病原体核 酸的检测方法， 克服了前面两种方法中存在的周期长、 灵敏度不高的问题， 特别是荧光定量 PCR方法的引进， 解决了PCR方法容易产生假阳性的问题， 使其得到了快速的发展， 该方法具 有高特异性、 高灵敏度、 周期短等多种优点。 但目前开发的RSV-A/B检测试剂基本都为单重 荧光定量PCR检测试剂， 操作繁琐、 费时耗力， 同时由于单重试剂无法对样品采集与样品核 酸提取成功与否进行有效监控， 具有一定的局限性。 发明内容 0007 为克服上述技术缺陷， 本发明提供了一种呼吸道合胞病毒A/B亚型多重荧光定量 PCR检测引物组和探针组及其试剂盒和制备方法。
10、。 该引物组和探针组及其试剂盒能实现呼 吸道合胞病毒A/B亚型的简便分型， 具有特异性高、 灵敏度高、 快速、 操作简单方便、 成本低 廉等多种优点。 0008 本发明所述引物组序列如SEQIDNO： 1-4所示， 所述探针组序列如SEQIDNO： 5-6 说明书 1/8 页 3 CN 105543414 A 3 所示。 0009 本发明还提供了一种呼吸道合胞病毒A/B亚型多重荧光定量PCR检测试剂盒， 包括 反应管、 酶混合物、 引物组和探针组， 所述引物组的序列如SEQIDNO： 1-4所示， 所述探针组 的序列如SEQIDNO： 5-6所示。 0010 本发明还提供了一种呼吸道合胞病毒A。
11、/B亚型多重荧光定量PCR检测试剂盒的制 备方法， 其制备方法包括： 0011 (1)步骤一： 制备引物 0012 制备RSV-A、 RSV-B的特异性引物及阳性对照beta-actin的特异性引物； 0013 RSV-A、 RSV-B的特异性引物序列如SEQIDNO： 1-4所示； 0014 阳性对照beta-actin的特异性引物序列如SEQIDNO： 7-8所示； 0015 (2)步骤二： 制备探针 0016 制备RSV-A、 RSV-B的特异性探针及阳性对照beta-actin的特异性探针， 其中探针 分别采用FAM-BHQ1、 Texasred-BHQ2、 JOE-BHQ1标记； 0。
12、017 RSV-A、 RSV-B的特异性探针序列如SEQIDNO： 5-6所示； 0018 阳性对照beta-actin的特异性探针序列如SEQIDNO： 9所示； 0019 (3)步骤三： 制备RT-PCR反应体系 0020 RT-PCR缓冲液： PrimeScript一步法RT-PCR试剂盒中的RT-PCR缓冲液； 0021 引物使用量： 7-15pmol； 0022 探针使用量： 0.5-5pmol； 0023 上述引物探针缓冲液混合物的配制： 18 l/反应 0024 酶混合物： 2 l； 0025 模板： 5 l； 0026 反应总体积： 25 l。 0027 与现有技术相比， 本方。
13、法采用多重荧光PCR的方法对RSV-A/B亚型进行同时检测， 通过加入beta-actin内对照检测监测样品采集及提取情况， 具有特异性高、 灵敏度高、 快 速、 操作简单方便、 成本低廉等多种优点， 可作为RSV-A/B亚型病毒检测的试剂， 用于科研及 临床应用。 附图说明 0028 图1 RSV-A/B多重检测试剂中RSV-A灵敏度图谱； 0029 图2 RSV-A/B多重检测试剂中RSV-B灵敏度图谱； 0030 图3 RSV-A/B多重检测试剂中Beta-actin灵敏度图谱； 0031 图4 RSV-A/B多重检测试剂标准曲线。 具体实施方式 0032 为使本发明更加容易理解， 下面。
14、结合具体实施例， 进一步阐述本发明。 应理解， 这 些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围， 下列实施例中未提及的具体实验 方法， 通常按照常规实验方法进行。 0033 实施例1： RSV-A、 RSV-B及内参beta-actin引物探针设计及特异性实验 说明书 2/8 页 4 CN 105543414 A 4 0034 1、 引物探针 0035 本方法采用taqman探针技术。 通过Genebank中RSV-A、 RSV-B的基因序列及beta- actin基因序列资料， 分别对RSV-A、 RSV-B及beta-actin进行引物探针设计， 其中探针分别 采用FAM-BHQ1、。
15、 Texasred-BHQ2、 JOE-BHQ1标记。 表1为RSV-A、 RSV-B及beta-actin引物及探 针序列表。 0036 表1 0037 0038 2、 对照样品 0039 实验采用培养分离的阳性株或临床株进行， 阳性株来源于广州呼吸疾病研究所、 呼吸疾病国家重点实验。 RSV-A、 RSV-B作为阳性对照， 同时使用流感A、 流感B、 副流感1、 副流 感2、 副流感3、 腺病毒ADV、 鼻病毒HRV、 偏肺病毒HMP、 冠状病毒229E、 OC43、 肺炎支原体MP、 肺 炎衣原体CP作为阴性对照， 使用E.coli作为beta-actin阴性对照。 0040 3、 制备。
16、模板 0041 实验分别取100 l培养物标本， 通过常规RNA/DNA提取方法提取， 得到50 l核酸产 物， 使用DEPC水对核酸提取产物100倍稀释后作为模板(其中冠状病毒及偏肺病毒产物稀释 10倍)。 0042 4、 反应体系 0043 使用 PrimeScript一步法RT-PCR试剂盒(Ver.2) (TAKARA PrimeScriptOne StepRT-PCRKitVer.2 )中的RT-PCR缓冲液进行试剂配制， 其中 0044 引物使用量为7-15pmol 0045 探针使用量为0.5-5pmol 0046 反应总体积为25 l； 0047 配制试剂体积18 l/反应(预。
17、留2 l用于添加酶混合物； 预留5 l用于添加模板)。 0048 5、 RSV-A、 RSV-B和beta-actin单重荧光PCR反应 0049 为验证所设计的引物和探针的特异性， 首先设计单重荧光PCR反应， 对引物和探针 进行评估， 即分别检测RSV-A、 RSV-B和beta-actin三组引物及相应探针单独反应的特异性。 在八排管中分别加入18 LRSV-A、 RSV-B和beta-actin的单重反应液， 最后放置于荧光定量 PCR仪中反应。 0050 反应条件如下： 5030分钟， 942分钟， 热循环为9410秒， 5535秒， 共40个循 环。 0051 表2为RSV-A、 。
18、RSV-B及beta-actin单重试剂特异性实验结果。 可见单重RSV-A、 RSV- 说明书 3/8 页 5 CN 105543414 A 5 B和beta-actin试剂检测70株阳性病毒样品的情况， 其中RSV-A15株、 RSV-B15株、 流感A8 株(H3N24株、 H1N14株)、 流感B8株， 另外有副流感1、 副流感2、 副流感3、 腺病毒ADV、 鼻病毒 HRV、 偏肺病毒HMP、 冠状病毒229E、 OC43、 肺炎支原体MP、 肺炎衣原体CP各2株、 同时有E.coli TOP102株、 E.coliDH5 2株作为阴性对照。 实验结果见表2所示： 0052 表2 0。
19、053 单重试剂检测结果RSV-ARSV-Bbeta-actin 阳性151566 阴性55554 总计707070 0054 实验结果中， 阳性结果与预期完全符合， 与其他常见呼吸道病原体流感A、 流感B、 副流感1、 副流感2、 副流感3、 腺病毒ADV、 鼻病毒HRV、 偏肺病毒HMP、 冠状病毒229E、 OC43、 肺 炎支原体MP、 肺炎衣原体CP等无交叉反应， RSV-A、 RSV-B之间亦无交叉反应， 特异性高。 0055 实施例二： RSV-A/B多重试剂的特异性实验 0056 为检验所设计的引物探针是否特异， 配制RSV-A、 RSV-B、 beta-actin三重检测试剂。
20、 并使用实验室中的多种阳性病毒株进行验证， 具体实施如下： 使用PrimeScriptOneStep RT-PCRKitVer.2试剂盒(TAKARA)的一步法RT-PCR试剂作为三重试剂反应试剂进行配制。 0057 反应总体积为25 l； 其中： 0058 引物使用7-15pmol， 0059 探针使用0.5-5pmol， 0060 配制试剂体积18 l/反应(预留2 l用于添加酶混合物； 5 l模板)。 0061 反应条件如下： 5030分钟， 942分钟， 热循环为9410秒， 5535秒， 共40个循 环。 荧光收集分别为FAM/Texasred/JOE。 仪器为ABI7500荧光定量。
21、PCR仪(Applied Biosystems)。 0062 分别使用单阳性模板(RSV-A或RSV-B各两例分别标记为A1/A2)； 双阳性模板(RSV- A和RSV-B混合模板标记为A1/B1和A2/B2)对多重检测试剂进行实验， 同时使用单重荧光PCR 试剂进行对比。 实验结果见表3， 表3是RSV-A/B多重检测试剂特异性实验结果， 可见各种模 板情况下多重检测试剂与单重检测的对比结果。 0063 表3 0064 0065 从表3的实验数据可看出， 多重检测试剂的特异性与单重相比基本没有什么差异， 同时从CT值的表现来看， 多重检测试剂与单重检测基本一致。 说明书 4/8 页 6 CN。
22、 105543414 A 6 0066 实施例三： RSV-A/B多重检测试剂的灵敏性实验 0067 为进一步检验试剂的灵敏性， 使用体外转录含有目标片段的RNA作为灵敏度检测 的模板， 具体操作如下： 0068 1.使用带有T7启动子序列的引物进行PCR， 扩增含有目标区域的核酸片段， 见表4， 表4为RSV-A、 RSV-B及beta-actin体外转录目标片段扩增用引物列表。 0069 表4 0070 0071 2.使用TranscriptAidT7HighYieldTranscriptionKit(Thermo)并以上一步 中得到的还有T7启动子序列的PCR产物为模板， 体外转录获得目。
23、标片段RNA， 根据试剂盒说 明书方法去除DNA， 并使用Trizol纯化获得目标RNA片段； 0072 3.使用高灵敏度的nanodrop分光光度计(NanodropTechnologies)检测所获得 RNA的浓度， 并根据片段长度-分子量计算得出其单位体积中的拷贝数； 0073 4.10倍梯度稀释RNA模板， 使用12个梯度(510115拷贝)进行多重试剂的灵敏度 测试。 0074 实验图图谱见图1、 2、 3、 4所示。 图1RSV-A/B多重检测试剂中RSV-A灵敏度图谱， 图 2RSV-A/B多重检测试剂中RSV-B灵敏度图谱， 图3RSV-A/B多重检测试剂中Beta-actin。
24、灵敏 度图谱， 图4RSV-A/B多重检测试剂标准曲线。 从实验结果中得出， RSV-A/B多重检测试剂具 有很好的灵敏度， 扩增模板浓度跨度大， 其中RSV-A在5051010拷贝模板具有良好的线性 (R20.9973)； RSV-B在50051011拷贝模板具有良好的线性(R20.9984)； beta-actin 在50051010拷贝模板具有良好的线性(R20.9989)， 同时从三者标准曲线中看出， 扩增 效率基本一致， 有利于结果的判读。 0075 实施例四： RSV-A/B多重检测试剂临床标本检测实验 0076 使用单重和RSV-A/B多重检测试剂对2014年3月-5月785份咽。
25、拭子临床标本(标本 来源于广州医科大学附属第一医院、 广州呼吸疾病研究所、 呼吸疾病国家重点实验室)， 同 时进行病毒培养分离鉴定。 结果见表5， 表5为785份临床咽拭子使用RSV-A/B单重、 多重和病 毒分离检测的结果。 0077 表5 0078 说明书 5/8 页 7 CN 105543414 A 7 0079 从上面的实验表明， 本实验所研发的RSV-A/B多重检测试剂， 灵敏度高于病毒培养 鉴定， 可以用于科研及临床工作， 用一管反应检测RSV-A/B， 达到灵敏、 快速、 准确、 节约的目 的。 0080 最后所应当说明的是， 以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保 。
26、护范围的限制， 尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明， 本领域的普通技术人员应当 理解， 可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换， 而不脱离本发明技术方案的实质 和范围。 0081 说明书 6/8 页 8 CN 105543414 A 8 说明书 7/8 页 9 CN 105543414 A 9 0082 说明书 8/8 页 10 CN 105543414 A 10 0001 序列表 1/2 页 11 CN 105543414 A 11 0002 序列表 2/2 页 12 CN 105543414 A 12 图1 图2 说明书附图 1/2 页 13 CN 105543414 A 13 图3 图4 说明书附图 2/2 页 14 CN 105543414 A 14 。