一种高产谷胱甘肽的酿酒酵母及其用途.pdf

《一种高产谷胱甘肽的酿酒酵母及其用途.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种高产谷胱甘肽的酿酒酵母及其用途.pdf（13页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。

1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201511003961.9 (22)申请日 2015.12.25 CCTCC NO: M 2015724 2015.12.04 C12N 1/16(2006.01) C12P 21/02(2006.01) A23K 20/147(2016.01) A23L 33/195(2016.01) A61K 38/06(2006.01) A61K 8/64(2006.01) C12R 1/865(2006.01) (71)申请人 湖北泱盛生物科技有限公司 地址 432400 湖北省孝感市应城市城南经济 开发区横一路 (72)发明人 张卫元 蔡俊 。

2、戴军 高经纬 郝康 代兵 李硕 张靖 杨永荣 (74)专利代理机构 武汉宇晨专利事务所 42001 代理人 余晓雪 (54) 发明名称 一种高产谷胱甘肽的酿酒酵母及其用途 (57) 摘要 本发明公开了一种高产谷胱甘肽的酿酒 酵母及其用途， 其中酿酒酵母 （Saccharomyces cerevisiae） GSH-HS-001， 保藏日期 ： 2015年12月 4 日， 保藏编号为 CCTCC NO: M 2015724。该酵母 经发酵培养后谷胱甘肽的产量高， 且发酵周期短。 本发明采用流加补料的方式， 分别流加碳氮源、 维 生素、 前体氨基酸促进谷胱甘肽的合成， 使酵母胞 内谷胱甘肽的含量提。

3、升， 有效解决了酵母合成谷 胱甘肽能力低及干酵母中谷胱甘肽含量低的问 题。本发明扩展了富含谷胱甘肽干酵母的应用范 围， 可有效提高产品的附加值。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书8页 序列表2页 附图1页 CN 105505801 A 2016.04.20 CN 105505801 A 1.一种酿酒酵母， 其特征在于： 所述酿酒酵母分类命名为酿酒酵母 （Saccharomyces cerevisiae） GSH-HS-001， 保藏编号为CCTCCNO:M2015724。 2.根据权利要求1所述的酿。

4、酒酵母， 其特征在于： 所述酿酒酵母是用于发酵培养富含谷 胱甘肽的酿酒酵母。 3.权利要求1或2所述的酿酒酵母在制备富含谷胱甘肽的饲料添加剂、 食品、 药品或化 妆品中的应用。 4.权利要求1或2所述的酿酒酵母在制备富含谷胱甘肽的干酵母中的应用。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105505801 A 2 一种高产谷胱甘肽的酿酒酵母及其用途 技术领域 0001 本发明属于微生物技术领域， 涉及一种酿酒酵母及其用途， 具体涉及一株能高效 合成谷胱甘肽的酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)GSH-HS-001及其用途。 背景技术 0002 谷胱甘肽(Glutathione，。

5、 GSH)由谷氨酸、 L-半胱氨酸和甘氨酸经肽键缩合而成， 是 生物体中最丰富的非蛋白类巯基化合物， 广泛存在于动植物组织及微生物细胞中。 生物体 内谷胱甘肽以两种形式存在： 还原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)， 而在机体中 大量存在并起作用的是GSH。 GSH分子中由于半胱氨酸上巯基(-SH)的存在， 使GSH在生物体 内有着多种重要的生理功能， 主要为三个方面， 如抗氧化、 解毒和免疫调节。 第一， GSH起着 维持生物体内适宜氧化还原环境的作用， 作为一种重要的抗氧化剂， GSH可以清除体内氧自 由基(reactiveoxygenspecies， ROS)， 保护DNA。

6、、 蛋白质和其它生物分子不被氧化； 第二， 作为解毒剂， 半胱氨酸上的活性基团巯基易与某些药物、 毒素、 重金属等结合， 而具有整合 解毒作用； 第三， 可增强机体免疫能力， 在高等真核细胞中， GSH可以迅速增强机体的免疫能 力。 因此， 谷胱甘肽在食品、 医药、 化妆品、 发酵、 饲料添加剂等领域具有广泛的市场前景。 0003 GSH的生产方法主要有化学合成法、 溶剂萃取法、 酶转化法和发酵法。 其中， 发酵法 是利用廉价的糖类、 蛋白质类原料， 通过微生物细胞内物质的代谢途径来进行GSH合成的方 法。 该法具有菌种易于培养、 原料来源方便廉价、 成本低、 转化效率高、 生产速率快等优点，。

7、 已成为当前生产GSH的主要方法。 国外早在20世纪80年代就已实现了GSH的工业化生产， 我 国由于起步较晚目前GSH的工业化生产仍未取得实质性突破。 0004 在所有合成GSH的动植物细胞及微生物中， 酵母是合成GSH最具潜力的微生物。 与 此同时， 酵母含有丰富的蛋白质及维生素， 在食品、 医药、 化妆品、 发酵、 饲料工业中早已广 泛使用。 利用发酵法生产富含谷胱甘肽的酵母均可作为上述工业的原料， 同时提供丰富的 功能性有效成分GSH， 对改善人体健康、 提高动物机能等方面发挥重要作用。 发明内容 0005 本发明所要解决的技术问题是筛选一株能高效合成谷胱甘肽的酵母并利用该酵 母发酵制。

8、备富含谷胱甘肽的干酵母， 有效解决酵母合成谷胱甘肽能力低及干酵母中谷胱甘 肽含量低的问题。 本发明将扩展富含谷胱甘肽干酵母的应用范围， 有效提高产品的附加值。 0006 为了实现上述目的， 本发明采用如下技术方案： 0007 一种酿酒酵母， 其分类命名为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)GSH-HS- 001， 已于2015年12月4日保藏于中国典型培养物保藏中心， 保藏编号为CCTCCNO:M 2015724， 地址： 中国.武汉.武汉大学。 0008 作为优选， 本发明所采用的酿酒酵母是用于发酵培养富含谷胱甘肽的酿酒酵母。 0009 本发明所采用的酿酒酵母在制备富含。

9、谷胱甘肽的饲料添加剂、 食品、 药品或化妆 品中的应用。 说明书 1/8 页 3 CN 105505801 A 3 0010 本发明所采用的酿酒酵母在制备富含谷胱甘肽的干酵母中的应用。 0011 本发明涉及的保藏编号为CCTCCNO:M2015724的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)GSH-HS-001具有如下优点和显著的进步： 0012 (1)筛选到的酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)GSH-HS-001合成谷胱甘肽的 能力强， 发酵周期短， 经过鉴定遗传背景清晰， 无生物安全性隐患。 0013 (2)经过分批补料发酵及喷雾干燥所得的干酵母。

10、胞内还原型谷胱甘肽含量高达 200220mg/g， 显著高于已报道的酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)CCCG。 有效解决 了酵母合成谷胱甘肽能力低及干酵母中谷胱甘肽含量低的问题。 这将扩展富含谷胱甘肽干 酵母的应用范围， 有效提高产品附加值。 0014 (3)通过摇瓶发酵所得酵母胞内还原型谷胱甘肽含量为6080mg/g， 通过10L发酵 罐采用变速流加发酵所得酵母胞内还原型谷胱甘肽含量为200220mg/g， 通过20立方发酵 罐采用变速流加发酵所得酵母胞内还原型谷胱甘肽含量为200220mg/g。 0015 (4)酵母细胞膜和细胞壁起天然屏障作用减少谷胱甘肽的氧化，。

11、 因而无需对谷胱 甘肽进行提纯， 可与酵母细胞一起使用， 这将极大的减少谷胱甘肽的损失与产品的成本。 附图说明 0016 图1是GSH-HS-001显微镜(400X)观察照片； 0017 图2是GSH-HS-001平板菌落观察照片。 具体实施方式 0018 本发明通过大量试验从全国不同地区采集的不同样本中反复进行菌种筛选， 最终 获得了一株能高效合成谷胱甘肽的酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)GSH-HS-001， 已 于2015年12月4日保藏于中国典型培养物保藏中心， 专利保藏编号为CCTCCNO:M2015724。 0019 菌株形态学特征： 菌落呈乳白色， 无光。

12、泽， 扁平， 大而厚， 不透明， 表面光滑， 边缘整 齐， 湿润粘腻， 容易挑起， 正反面、 边缘与中央部位颜色一致。 0020 菌株生理特性： 可利用葡萄糖、 蔗糖、 麦芽糖等常见碳源。 0021 菌株代谢特性： 代谢过程利用前体物质高效合成谷胱甘肽。 0022 实施例一： 高产谷胱甘肽菌种的筛选 0023 (1)筛选样本 0024 土壤、 淡水、 果实、 植物、 动物粪便等。 0025 (2)培养基 0026 富集培养基(g/L)： 葡萄糖50， (NH4)2SO42， KH2PO42.5， MgSO4 7H2O1， 酵母膏0.5， pH4.5， 115灭菌30min； 0027 初筛平板。

13、培养基(g/L)： 葡萄糖50， 尿素1， (NH4)2SO41， KH2PO42.5， Na2HPO40.5， MgSO4 7H2O1， FeSO4 7H2O0.1， 酵母膏0.5， 孟加拉红0.03， pH4.5， 琼脂20， 115灭菌 30min； 0028 斜面培养基(g/L)： 葡萄糖20， 蛋白胨20， 酵母膏10， pH4.5， 琼脂20， 115灭菌 30min； 0029 种子培养基(g/L)： 葡萄糖20， 蛋白胨20， 酵母膏10， NaCl5， pH4.56.0， 115灭 说明书 2/8 页 4 CN 105505801 A 4 菌30min； 0030 发酵培养基。

14、(g/L)： 葡萄糖50， 酵母膏10， 尿素4， (NH4)2SO44， (NH4)2HPO410， KH2PO4 2.5， Na2HPO40.5， MgSO4 7H2O1， CaCl21， pH4.56.0， 115灭菌30min； 0031 混合维生素溶液(g/L)： 维生素B11， 维生素B21， 维生素B31， 维生素B41， 维生素 B63， 泛酸钙1； 0032 前体氨基酸溶液(g/L)： 谷氨酸钠40， L-半胱氨酸盐酸盐40， 甘氨酸10。 0033 (3)富集培养 0034 取10g筛选样本于100ml灭菌生理盐水中， 2832下200220rpm摇床振荡12h 后取10m。

15、l菌液接种于富集培养基中， 2832、 200220rpm摇床振荡培养3642h。 富集培 养3次。 0035 (4)稀释涂布 0036 取富集培养液0.5mL于灭菌后的小试管内， 加入4.5ml无菌水， 依次稀释， 分别得到 10-1到10-7等7个稀释梯度。 分别取10-5到10-7等3个梯度的稀释菌液100 l于初筛平板培养基 上， 涂布均匀， 每个梯度分别做3个平行。 2832恒温培养3648h。 0037 (5)平板划线分纯 0038 取稀释涂布平板上菌落直径较大， 长势较好的菌落分别编号并在琼脂平板上划线 分纯， 于2832恒温培养3648h。 划线分纯后挑选菌落直径较大， 生长较。

16、快的菌株转接 于斜面培养基2832恒温培养3648h后4冰箱保藏。 初筛共计筛选到904个菌株。 0039 (6)初筛菌株活化 0040 斜面培养基灭菌备用， 将初筛菌株转接于试管斜面活化， 2832培养3648h。 0041 (7)种子液制备 0042 种子培养基分装(100ml/500ml摇瓶)灭菌备用， 取活化后的菌种转接于种子培养 基中。 2832、 200220rpm摇床培养1820h。 0043 (8)接种发酵培养基发酵 0044 发酵培养基分装(100ml/500ml摇瓶)灭菌备用， 取5mL混合维生素溶液及10ml种子 液(接种量810)加入发酵培养基中， 2832、 2002。

17、20rpm摇床培养。 在摇床培养12h， 24h时分别补加30葡萄糖溶液15mL， 在摇床培养24h时补加15mL前体氨基酸溶液， 摇床培 养3642h后结束发酵。 0045 (9)酵母细胞破壁释放谷胱甘肽 0046 取一定体积的菌液于离心管中， 50008000rpm离心510min收集菌体， 生理盐水 洗涤菌体细胞23次后， 用蒸馏水悬浮， 摇匀后放入-80冰箱迅速冰冻， 将冰冻的菌体在 沸水浴条件下迅速融化， 反复冻融2次后50008000rpm离心510min， 取上清液作为测试 样品。 0047 (10)细胞干重的测定 0048 取一定体积的菌液于离心管中， 50008000rpm离。

18、心510min收集菌体， 生理盐水 洗涤菌体细胞23次后， 得到的湿菌体在105条件下烘干至恒重。 0049 (11)胞内谷胱甘肽含量的测定 0050 采用碘量法测定上清液中谷胱甘肽含量， 再结合破壁率及细胞干重计算出胞内谷 胱甘肽的含量。 说明书 3/8 页 5 CN 105505801 A 5 0051 参见图1以及图2， 经过初筛和复筛， 编号为GSH-HS-001的菌株合成谷胱甘肽的能 力最强， 其通过摇瓶发酵所得酵母胞内还原型谷胱甘肽含量为6080mg/g， 通过18SrRNA、 ITS以及26SrRNA鉴定， 最终确定该菌株为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae。

19、)， 已于 2015年12月4日保藏于中国典型培养物保藏中心， 保藏编号为CCTCCNO:M2015724。 将该菌 株作为后续实施例的试验菌株。 其中， 18SrRNA的序列是序列表中的SEQIDNO.1， ITS序列 是序列表中的SEQIDNO.2， 26SrRNA序列是序列表中的SEQIDNO.3。 0052 实施例二： 在摇瓶水平上发酵培养 0053 (1)菌种 0054 酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)GSH-HS-001， 保藏编号CCTCCNO:M 2015724。 0055 (2)培养基 0056 斜面培养基(g/L)： 葡萄糖20， 蛋白胨20， 酵。

20、母膏10， pH4.5， 琼脂20， 115灭菌 30min； 0057 种子培养基(g/L)： 葡萄糖20， 蛋白胨20， 酵母膏10， NaCl5， pH4.56.0， 115灭 菌30min； 0058 发酵培养基(g/L)： 葡萄糖50， 酵母膏10， 尿素4， (NH4)2SO44， (NH4)2HPO410， KH2PO4 2.5， Na2HPO40.5， MgSO4 7H2O1， CaCl21， pH4.56.0， 115灭菌30min； 0059 混合维生素溶液(g/L)： 维生素B11， 维生素B21， 维生素B31， 维生素B41， 维生素 B63， 泛酸钙1； 0060 。

21、前体氨基酸溶液(g/L)： 谷氨酸钠40， L-半胱氨酸盐酸盐40， 甘氨酸10。 0061 (3)菌种活化 0062 斜面培养基灭菌备用， 将菌种转接于试管斜面活化， 2832培养3648h。 0063 (4)种子液制备 0064 种子培养基分装(100ml/500ml摇瓶)灭菌备用， 取活化后的菌种转接于种子培养 基中。 2832、 200220rpm摇床培养1820h。 0065 (5)接种发酵培养基发酵 0066 发酵培养基分装(100ml/500ml摇瓶)灭菌备用， 取5mL混合维生素溶液及10ml种子 液(接种量810)加入发酵培养基中， 2832、 200220rpm摇床培养。 。

22、在摇床培养12h， 24h时分别补加30葡萄糖溶液15mL， 在摇床培养24h时补加15mL前体氨基酸溶液， 摇床培 养3642h后结束发酵。 0067 (6)酵母细胞破壁释放谷胱甘肽 0068 取一定体积的菌液于离心管中， 50008000rpm离心510min收集菌体， 生理盐水 洗涤菌体细胞23次后， 用蒸馏水悬浮， 摇匀后放入-80冰箱迅速冰冻， 将冰冻的菌体在 沸水浴条件下迅速融化， 反复冻融2次后50008000rpm离心510min， 取上清液作为测试 样品。 0069 (7)细胞干重的测定 0070 取一定体积的菌液于离心管中， 50008000rpm离心510min收集菌体，。

23、 生理盐水 洗涤菌体细胞23次后， 得到的湿菌体在105条件下烘干至恒重。 0071 (8)胞内谷胱甘肽含量的测定 说明书 4/8 页 6 CN 105505801 A 6 0072 采用碘量法测定上清液中谷胱甘肽含量， 再结合破壁率及细胞干重计算出胞内谷 胱甘肽的含量。 0073 (9)结果 0074 发酵时间： 36-42小时； 细胞干重： 10-15g/L； 胞内谷胱甘肽含量： 60-80mg/g。 0075 实施例三： 在10L发酵罐水平上发酵培养 0076 (1)菌种 0077 酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)GSH-HS-001， 保藏编号CCTCCNO:。

24、M 2015724。 0078 (2)培养基 0079 斜面培养基(g/L)： 葡萄糖20， 蛋白胨20， 酵母膏10， pH4.5， 琼脂20， 115灭菌 30min； 0080 种子培养基(g/L)： 葡萄糖20， 蛋白胨20， 酵母膏10， NaCl5， pH4.56.0， 115灭 菌30min； 0081 10L发酵罐水平上(底水2L)发酵培养基(g/L)： 酵母膏30， CaCl22.5， MgSO4 5H2O 7.5， ZnSO40.008， KCl5， pH4.56.0， 消泡剂4mL； 0082 流加发酵培养基： 300g/L葡糖糖(4L)， 80g/L尿素、 35g/L硫。

25、酸铵(600mL)， 57g/L磷 酸二氢铵(300mL)， 混合维生素溶液100mL(含维生素B10.1， 维生素B20.1， 维生素B3 0.1， 维生素B40.1， 维生素B60.3， 泛酸钙0.1)， 前体氨基酸溶液600ml(含谷氨酸 钠4.33， L-半胱氨酸盐酸盐4.67， 甘氨酸1.17)。 0083 (3)菌种活化 0084 斜面培养基灭菌备用， 将菌种转接于试管斜面活化， 2832培养3648h。 0085 (4)发酵种子液制备 0086 取活化好的斜面种子一到两环接入装液量为50mL/250mL的种子培养基中， 2832 、 200220rpm摇床培养1820h即得一级种。

26、子， 按照接种量810的比例将一级种子 接入相同的种子培养基中2832、 200220rpm摇床培养1418h即得二级种子。 0087 (5)接种发酵罐发酵 0088 取上述制备的二级种子按照810的接种量接种到发酵罐中， 利用葡萄糖为 碳源， 尿素、 硫酸铵、 磷酸氢二铵为氮磷源分阶段控制流加策略， 控制发酵温度2832， 搅 拌转速200600rmp， 通气量515L/min， 罐压0.03MPa0.04MPa， pH4.56.0。 接种时一 次性补加混合维生素溶液100mL， 在氮、 磷流加完12h后一次性补加前体氨基酸溶液 600ml。 发酵过程调节转速和通气量， 分阶段控制溶解氧水平。

27、。 葡萄糖持续流加并控制葡萄 糖含量在1， 3642h结束发酵。 0089 (6)酵母细胞破壁释放谷胱甘肽 0090 取一定体积的菌液于离心管中， 50008000rpm离心510min收集菌体， 生理盐水 洗涤菌体细胞23次后， 用蒸馏水悬浮， 摇匀后放入-80冰箱迅速冰冻， 将冰冻的菌体在 沸水浴条件下迅速融化， 反复冻融2次后50008000rpm离心510min， 取上清液作为测试 样品。 0091 (7)细胞干重的测定 0092 取一定体积的菌液于离心管中， 50008000rpm离心510min收集菌体， 生理盐水 说明书 5/8 页 7 CN 105505801 A 7 洗涤菌体。

28、细胞23次后， 得到的湿菌体在105条件下烘干至恒重。 0093 (8)胞内谷胱甘肽含量的测定 0094 采用碘量法测定上清液中谷胱甘肽含量， 再结合破壁率及细胞干重计算出胞内谷 胱甘肽的含量。 0095 (9)结果 0096 发酵时间： 36-42小时； 细胞干重： 45-50g/L； 胞内谷胱甘肽含量： 200-220mg/g。 0097 实施例四： 在20立方发酵罐水平上发酵培养 0098 (1)菌种 0099 酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)GSH-HS-001， 保藏编号CCTCCNO:M 2015724。 0100 (2)培养基 0101 斜面培养基(g/。

29、L)： 葡萄糖20， 蛋白胨20， 酵母膏10， pH4.5， 琼脂20， 115灭菌 30min； 0102 一级种子培养基(g/L)： 葡萄糖20， 蛋白胨20， 酵母膏10， NaCl5， pH4.56.0， 115 灭菌30min； 0103 二级种子培养基(g/L)： 葡萄糖20， 蛋白胨20， 酵母膏10， NaCl5， pH4.56.0， 115 灭菌30min； 0104 三级种子培养基(g/L)： 葡萄糖20， 蛋白胨20， 酵母膏10， NaCl5， pH4.56.0， 115 灭菌30min； 0105 20m3发酵罐水平上(底水4000L)发酵培养基(g/L)： 酵母膏。

30、30， CaCl22.5， MgSO4 5H2O7.5， ZnSO40.008， KCl5， pH4.56.0； 0106 流加发酵培养基： 300g/L葡糖糖(8000L)， 80g/L尿素、 35g/L硫酸铵(1300L)， 57g/L 磷酸二氢铵(600L)， 混合维生素溶液200L(含维生素B10.1， 维生素B20.1， 维生素B3 0.1， 维生素B40.1， 维生素B60.3， 泛酸钙0.1)， 前体氨基酸溶液1200L(含谷氨酸 钠4.33， L-半胱氨酸盐酸盐4.67， 甘氨酸1.17)。 0107 (3)菌种活化 0108 斜面培养基灭菌备用， 将菌种转接于试管斜面活化， 。

31、2832培养3648h。 0109 (4)发酵种子液制备 0110 取活化好的斜面种子一到两环接入装液量为1000mL/5000mL的种子培养基中， 28 32、 200220rpm摇床培养1820h即得一级种子， 按照接种量， 13(V/V)的比例 将一级种子接入相同种子培养基的800L发酵罐中培养2024h即得二级种子， 之后再按8 10(V/V)的接种量将二级种子接入相同种子培养基的2m3发酵罐中培养12-16小时制备 三级种子。 0111 (5)接种发酵罐发酵 0112 取上述制备的三级种子按照1015的接种量接种到发酵罐中， 利用葡萄糖为 碳源， 尿素、 硫酸铵、 磷酸氢二铵为氮磷源。

32、分阶段控制流加策略， 控制发酵温度2832， 通 气量300700m3/h， 罐压0.03MPa0.04MPa， pH4.56.0。 接种时一次性补加混合维生素 溶液200L， 在氮、 磷流加完12h后一次性补加前体氨基酸溶液1200L。 发酵过程调节转速和 通气量， 分阶段控制溶解氧水平， 同时控制发酵液中酒精的含量在0.1-0.5(W/V)。 葡萄 说明书 6/8 页 8 CN 105505801 A 8 糖持续流加并控制葡萄糖含量在1， 3642h结束发酵。 0113 (6)酵母细胞破壁释放谷胱甘肽 0114 取一定体积的菌液于离心管中， 50008000rpm离心510min收集菌体，。

33、 生理盐水 洗涤菌体细胞23次后， 用蒸馏水悬浮， 摇匀后放入-80冰箱迅速冰冻， 将冰冻的菌体在 沸水浴条件下迅速融化， 反复冻融2次后50008000rpm离心510min， 取上清液作为测试 样品。 0115 (7)细胞干重的测定 0116 取一定体积的菌液于离心管中， 50008000rpm离心510min收集菌体， 生理盐水 洗涤菌体细胞23次后， 得到的湿菌体在105条件下烘干至恒重。 0117 (8)胞内谷胱甘肽含量的测定 0118 采用碘量法测定上清液中谷胱甘肽含量， 再结合破壁率及细胞干重计算出胞内谷 胱甘肽的含量。 0119 (9)结果 0120 发酵时间： 36-42小时。

34、； 细胞干重： 45-50g/L； 胞内谷胱甘肽含量： 200-220mg/g。 0121 实施例五： 富含谷胱甘肽干酵母的制备 0122 (1)菌种 0123 酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)GSH-HS-001， 保藏编号CCTCCNO:M 2015724。 0124 (2)培养基 0125 斜面培养基(g/L)： 葡萄糖20， 蛋白胨20， 酵母膏10， pH4.5， 琼脂20， 115灭菌 30min； 0126 一级种子培养基(g/L)： 葡萄糖20， 蛋白胨20， 酵母膏10， NaCl5， pH4.56.0， 115 灭菌30min； 0127 二级种子。

35、培养基(g/L)： 葡萄糖20， 蛋白胨20， 酵母膏10， NaCl5， pH4.56.0， 115 灭菌30min； 0128 三级种子培养基(g/L)： 葡萄糖20， 蛋白胨20， 酵母膏10， NaCl5， pH4.56.0， 115 灭菌30min； 0129 20m3发酵罐水平上(底水4000L)发酵培养基(g/L)： 酵母膏30， CaCl22.5， MgSO4 5H2O7.5， ZnSO40.008， KCl5， pH4.56.0； 0130 流加发酵培养基： 300g/L葡糖糖(8000L)， 80g/L尿素、 35g/L硫酸铵(1300L)， 57g/L 磷酸二氢铵(600。

36、L)， 混合维生素溶液200L(含维生素B10.1， 维生素B20.1， 维生素B3 0.1， 维生素B40.1， 维生素B60.3， 泛酸钙0.1)， 前体氨基酸溶液1200L(含谷氨酸 钠4.33， L-半胱氨酸盐酸盐4.67， 甘氨酸1.17)。 0131 (3)菌种活化 0132 斜面培养基灭菌备用， 将菌种转接于试管斜面活化， 2832培养3648h。 0133 (4)发酵种子液制备 0134 取活化好的斜面种子一到两环接入装液量为1000mL/5000mL的种子培养基中， 28 32、 200220rpm摇床培养1820h即得一级种子， 按照接种量， 13(V/V)的比例 将一级种。

37、子接入相同种子培养基的800L发酵罐中培养2024h即得二级种子， 之后再按8 说明书 7/8 页 9 CN 105505801 A 9 10(V/V)的接种量将二级种子接入相同种子培养基的2m3发酵罐中培养12-16小时制备 三级种子。 0135 (5)接种发酵罐发酵 0136 取上述制备的三级种子按照1015的接种量接种到发酵罐中， 利用葡萄糖为 碳源， 尿素、 硫酸铵、 磷酸氢二铵为氮磷源分阶段控制流加策略， 控制发酵温度2832， 通 气量300700m3/h， 罐压0.03MPa0.04MPa， pH4.56.0。 接种时一次性补加混合维生素 溶液200L， 在氮、 磷流加完12h后。

38、一次性补加前体氨基酸溶液1200L。 发酵过程调节转速和 通气量， 分阶段控制溶解氧水平， 同时控制发酵液中酒精的含量在0.1-0.5(W/V)。 葡萄 糖持续流加并控制葡萄糖含量在1， 3642h结束发酵。 0137 (6)富含谷胱甘肽干酵母的制备 0138 将(5)中得到的发酵液在50008000rpm条件下离心510min收集菌体， 用生理盐 水洗涤菌体细胞23次后得干净菌体， 再用溶解了0.10.3阿拉伯胶的生理盐水将干 净菌体配置成1015的酵母液， 利用离心喷雾干燥机控制进风温度140160， 出风 温度8090， 最终得到干物质含量在9296的干酵母。 0139 (7)酵母细胞破。

39、壁释放谷胱甘肽 0140 取1g干酵母用99g蒸馏水悬浮， 摇匀后放入-80冰箱迅速冰冻， 将冰冻的菌体在 沸水浴条件下迅速融化， 反复冻融2次后50008000rpm离心510min， 取上清液作为测试 样品。 0141 (8)干酵母水分含量的测定 0142 取一定质量的干酵母在105条件下烘干至恒重， 测定水分含量。 0143 (9)胞内谷胱甘肽含量的测定 0144 采用碘量法测定上清液中谷胱甘肽含量， 再结合破壁率及细胞干重计算出胞内谷 胱甘肽的含量。 0145 (10)结果 0146 干酵母干物质含量： 9296； 胞内谷胱甘肽含量： 200-220mg/g。 说明书 8/8 页 10 CN 105505801 A 10 0001 序列表 1/2 页 11 CN 105505801 A 11 0002 序列表 2/2 页 12 CN 105505801 A 12 图1 图2 说明书附图 1/1 页 13 CN 105505801 A 13 。