本申请是申请日为2006年10月11日，申请号为200680037929.5、 发明名称为“抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体”的发明专利申请的 分案申请。
技术领域
本发明涉及一种抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体。特别地，本发 明涉及一种在Fc区的氨基酸序列中具有修饰并且表现出增强的 ADCC活性的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体。
背景技术
磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(glypican-3，GPC3)是一种存在于细胞表面 的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖家族，并且提示GPC3可能参与癌细胞发展 和生长中的细胞分化，但是它的功能仍然没有被很好地阐明。
已经发现某种结合GPC3的抗体通过其ADCC(抗体依赖的细胞 毒性)活性和CDC(补体依赖的细胞毒性)具有细胞生长抑制效果 (WO2003/000883，在此全文引入作为参考)。
在发展利用抗体的细胞毒性活性的抗癌症剂时，期望利用的抗体 具有增强的ADCC活性。因此，对于GPC3-识别抗体而言，具有增强 的细胞毒性的抗-GPC3抗体是所期望的。
本发明的一个目的是提供一种与普通抗体相比具有增强的细胞 毒性的抗-GPC3抗体。
发明概述
发现了一种具有增强的ADCC活性的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖 -3抗体可通过修饰抗体的Fc区的氨基酸序列而获得。
在一个方面，本发明提供了一种包含在Fc区引入的一个或多个 氨基酸取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体。
在另一方面，本发明提供了一种抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗 体，其中Fc区的位点239、298、326、330和332处的一个或多个氨 基酸残基被其他氨基酸残基取代。
在另一方面，本发明提供了一种抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗 体，其选自：
(a)Fc区的位点332处的氨基酸残基被另一氨基酸残基取代的 抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体；
(b)Fc区的位点239、330和332处的氨基酸残基被其他氨基酸 残基取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体；
(c)Fc区的位点239、298和332处的氨基酸残基被其他氨基酸 残基取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体；
(d)Fc区的位点239、326和332处的氨基酸残基被其他氨基酸 残基取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体；
(e)Fc区的位点239、298、326和332处的氨基酸残基被其他 氨基酸残基取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体。
在另一方面，本发明提供了一种抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗 体，其选自：
(a)在Fc区的位点332处具有谷氨酸的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚 糖-3抗体；
(b)在Fc区的位点239处具有天冬氨酸，在位点330处具有亮 氨酸，在位点332处具有谷氨酸的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体；
(c)在Fc区的位点239处具有天冬氨酸，在位点298处具有丙 氨酸，在位点332处具有谷氨酸的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体；
(d)在Fc区的位点239处具有天冬氨酸，在位点326处具有苏 氨酸，在位点332处具有谷氨酸的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体；
(e)在Fc区的位点239处具有天冬氨酸，在位点298处具有丙 氨酸，在位点326处具有谷氨酸，在位点332处具有谷氨酸的抗-磷 脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体。
在另一方面，本发明提供了一种抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗 体，其选自：
(a)Fc区的位点332处的氨基酸残基被谷氨酸取代的抗-磷脂 酰肌醇蛋白聚糖-3抗体；
(b)Fc区的位点239、330和332处的氨基酸残基分别被天冬氨 酸、亮氨酸、谷氨酸取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体；
(c)Fc区的位点239、298和332处的氨基酸残基分别被天冬氨 酸、丙氨酸、谷氨酸取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体；
(d)Fc区的位点239、326和332处的氨基酸残基分别被天冬氨 酸、苏氨酸、谷氨酸取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体；
(e)Fc区的位点239、298、326和332处的氨基酸残基分别被 天冬氨酸、丙氨酸、谷氨酸和谷氨酸取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖 -3抗体。
在另一方面，本发明提供了一种包含本发明的抗-磷脂酰肌醇蛋 白聚糖-3抗体和药学上可接受的载体的抗癌剂，以及一种治疗癌症 患者的方法，包括给患者施用本发明的抗癌剂。
在另一方面，本发明提供了一种制备具有增强的细胞毒性的抗- 磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体的方法，包括：
(i)培养一种工程化宿主细胞，该宿主细胞表达编码抗-磷脂 酰肌醇蛋白聚糖-3抗体的多核苷酸，其中所述抗体的Fc区的位点 239、298、326、330和332处的一个或多个氨基酸残基被其他氨基酸 残基取代；和
(ii)从培养物中分离抗体。
在另一方面，本发明提供了一种制备具有增强的细胞毒性的抗- 磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体的方法，包括：
(i)培养一种工程化宿主细胞，该宿主细胞表达编码抗-磷脂 酰肌醇蛋白聚糖-3抗体的多核苷酸，其中所述抗体选自：
(a)Fc区的位点332处的氨基酸残基被另一氨基酸残基取代的 抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体；
(b)Fc区的位点239、330和332处的氨基酸残基被其他氨基酸 残基取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体；
(c)Fc区的位点239、298和332处的氨基酸残基被其他氨基酸 残基取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体；
(d)Fc区的位点239、326和332处的氨基酸残基被其他氨基酸 残基取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体；
(e)Fc区的位点239、298、326和332处的氨基酸残基被其他 氨基酸残基取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体；和
(ii)从培养物中分离抗体。
在另一方面，本发明提供了一种制备具有增强的细胞毒性的抗- 磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体的方法，包括：
(i)培养一种工程化宿主细胞，该宿主细胞表达编码抗-磷脂酰 肌醇蛋白聚糖-3抗体的多核苷酸，其中所述抗体选自：
(a)在Fc区的位点332处具有谷氨酸的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚 糖-3抗体；
(b)在Fc区的位点239处具有天冬氨酸，在位点330处具有亮 氨酸，在位点332处具有谷氨酸的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体；
(c)在Fc区的位点239处具有天冬氨酸，在位点298处具有丙 氨酸，在位点332处具有谷氨酸的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体；
(d)在Fc区的位点239处具有天冬氨酸，在位点326处具有苏 氨酸，在位点332处具有谷氨酸的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体；
(e)在Fc区的位点239处具有天冬氨酸，在位点298处具有丙 氨酸，在位点326处具有谷氨酸，在位点332处具有谷氨酸的抗-磷 脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体；和
(ii)从培养物中分离抗体。
在另一方面，本发明提供了一种抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗 体，其选自：
(a)具有包含SEQ ID NO：34所示氨基酸序列的CH2-CH3结构 域的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体；
(b)具有包含SEQ ID NO：35所示氨基酸序列的CH2-CH3结构 域的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体；
(c)具有包含SEQ ID NO：36所示氨基酸序列的CH2-CH3结构 域的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体；
(d)具有包含SEQ ID NO：37所示氨基酸序列的CH2-CH3结构 域的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体；和
(e)具有包含SEQ ID NO：38所示氨基酸序列的CH2-CH3结构 域的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体。
本发明提供了：
第1项.一种包含在Fc区导入的一个或多个氨基酸取代的抗-磷 脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体。
第2项.一种抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体，其中Fc区的位 点239、298、326、330和332处的一个或多个氨基酸残基被其他氨 基酸残基取代。
第3项.一种抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体，其选自：
(a)Fc区的位点332的氨基酸残基被另一氨基酸残基取代的抗 -磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体；
(b)Fc区的位点239、330和332处的氨基酸残基被其他氨基酸 残基取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体；
(c)Fc区的位点239、298和332处的氨基酸残基被其他氨基酸 残基取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体；
(d)Fc区的位点239、326和332处的氨基酸残基被其他氨基酸 残基取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体；
(e)Fc区的位点239、298、326和332处的氨基酸残基被其他 氨基酸残基取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体。
第4项.一种抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体，其选自：
(a)在Fc区的位点332处具有谷氨酸的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚 糖-3抗体；
(b)在Fc区的位点239处具有天冬氨酸，在位点330处具有亮 氨酸，在位点332处具有谷氨酸的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体；
(c)在Fc区的位点239处具有天冬氨酸，在位点298处具有丙 氨酸，在位点332处具有谷氨酸的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体；
(d)在Fc区的位点239处具有天冬氨酸，在位点326处具有苏 氨酸，在位点332处具有谷氨酸的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体；
(e)在Fc区的位点239处具有天冬氨酸，在位点298处具有丙 氨酸，在位点326处具有谷氨酸，在位点332处具有谷氨酸的抗-磷 脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体。
第5项.一种抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体，其选自：
(a)Fc区的位点332处的氨基酸残基被谷氨酸取代的抗-磷脂 酰肌醇蛋白聚糖-3抗体；
(b)Fc区的位点239、330和332处的氨基酸残基分别被天冬氨 酸、亮氨酸、谷氨酸取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体；
(c)Fc区的位点239、298和332处的氨基酸残基分别被天冬氨 酸、丙氨酸、谷氨酸取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体；
(d)Fc区的位点239、326和332处的氨基酸残基分别被天冬氨 酸、苏氨酸、谷氨酸取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体；
(e)Fc区的位点239、298、326和332处的氨基酸残基分别被 天冬氨酸、丙氨酸、谷氨酸和谷氨酸取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖 -3抗体。
第6项.一种包含第1-5项任一项所述的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚 糖-3抗体和药学上可接受的载体的抗癌剂。
第7项.一种治疗癌症患者的方法，包括给患者施用如第6项所述 的抗癌剂。
第8项.一种制备具有增强的细胞毒性的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚 糖-3抗体的方法，包括：
(i)培养一种工程化宿主细胞，该宿主细胞表达编码抗-磷脂 酰肌醇蛋白聚糖-3抗体的多核苷酸，其中所述抗体的Fc区的位点 239、298、326、330和332处的一个或多个氨基酸残基被其他氨基酸 残基取代；和
(ii)从培养物中分离所述抗体。
第9项.一种制备具有增强的细胞毒性的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚 糖-3抗体的方法，包括：
(i)培养一种工程化宿主细胞，该宿主细胞表达编码抗-磷脂 酰肌醇蛋白聚糖-3抗体的多核苷酸，其中所述抗体选自：
(a)Fc区的位点332处的氨基酸残基被另一氨基酸残基取代的 抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体；
(b)Fc区的位点239、330和332处的氨基酸残基被其他氨基酸 残基取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体；
(c)Fc区的位点239、298和332处的氨基酸残基被其他氨基酸 残基取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体；
(d)Fc区的位点239、326和332处的氨基酸残基被其他氨基酸 残基取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体；
(e)Fc区的位点239、298、326和332处的氨基酸残基被其他 氨基酸残基取代的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体；和
(ii)从培养物中分离所述抗体。
第10项.一种制备具有增强的细胞毒性的抗-磷脂酰肌醇蛋白 聚糖-3抗体的方法，包括：
(i)培养一种工程化宿主细胞，该宿主细胞表达编码抗-磷脂酰 肌醇蛋白聚糖-3抗体的多核苷酸，其中所述抗体选自：
(a)在Fc区的位点332处具有谷氨酸的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚 糖-3抗体；
(b)在Fc区的位点239处具有天冬氨酸，在位点330处具有亮 氨酸，在位点332处具有谷氨酸的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体；
(c)在Fc区的位点239处具有天冬氨酸，在位点298处具有丙 氨酸，在位点332处具有谷氨酸的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体；
(d)在Fc区的位点239处具有天冬氨酸，在位点326处具有苏 氨酸，在位点332处具有谷氨酸的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体；
(e)在Fc区的位点239处具有天冬氨酸，在位点298处具有丙 氨酸，在位点326处具有谷氨酸，在位点332处具有谷氨酸的抗-磷 脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体；和
(ii)从培养物中分离所述抗体。
第11项.一种抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体，其选自：
(a)具有包含SEQ ID NO：34所示氨基酸序列的CH2-CH3结构 域的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体；
(b)具有包含SEQ ID NO：35所示氨基酸序列的CH2-CH3结构 域的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体；
(c)具有包含SEQ ID NO：36所示氨基酸序列的CH2-CH3结构 域的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体；
(d)具有包含SEQ ID NO：37所示氨基酸序列的CH2-CH3结构 域的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体；
(e)具有包含SEQ ID NO：38所示氨基酸序列的CH2-CH3结构 域的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体。
附图说明
图1显示了制备本发明的Fc-修饰的人源化抗-磷脂酰肌醇蛋白 聚糖-3抗体的方案。
图2显示了纯化的本发明的Fc-修饰的人源化抗-磷脂酰肌醇蛋 白聚糖-3抗体的SDS-PAGE分析结果。
图3显示了通过凝胶渗透柱分析的纯化的Fc-修饰的人源化抗- 磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体的色谱图。
图4显示了利用来源于人外周血的PBMC，Fc-修饰的和野生型 人源化抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体对SK-03细胞的ADCC活 性。
图5显示了利用来源于小鼠骨髓的效应细胞，Fc-修饰的和野生 型人源化抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体对HepG2细胞的ADCC 活性。
发明详述
本发明提供了一种在Fc区具有修饰的抗体。图1显示了本发明 的Fc-修饰的人源化抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体的结构和制备方 案。
通常，抗体是大约150,000道尔顿的异四聚体，包含两条相同的 轻链(L)和两条相同的重链(H)。每条轻链通过一个共价二硫键与重链 结合，并且重链之间的二硫键数目根据抗体的同种型而改变。重链和 轻链均具有相隔一定间距的链内二硫键。每条重链在其一个末端具有 可变区(VH)，并且具有与其连接的多个恒定区。每条轻链在其一个末 端具有可变区(VL)，并且在另一端具有恒定区。轻链的恒定区与重链 的第一恒定区平行，轻链的可变区与重链的可变区平行。确信特定氨 基酸残基组成了轻链和重链可变区的界面(Clothia等人，J.Mol.Biol.， 186：651-666(1985)；Novotny和Haber，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：4592-4596(1985)，在此全文引入作为参考)。
来源于脊椎动物的抗体的轻链基于其恒定区氨基酸序列可分为 两种不同的类型，称为kappa(κ)和lambda(λ)。另外，抗体基于其重 链恒定区的氨基酸序列可分为不同的类别。抗体包括至少五种主要类 别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中的一些可分为亚类(同种型)， 例如，IgG-1、IgG-2、IgG-3和IgG-4；IgA-1和IgA-2。不同类别的重 链恒定区称为α、δ、ε、γ和μ。每一类别的免疫球蛋白的亚单元结构 和三维结构是本领域已知的。也已知在IgG-1的Fc区的序列中存在 同种异型，例如，G1m(1)、nG1m(1)、G1m(2)、G1m(3)、nG1m(17) 等(M.S.Schanfield和E.van Loghem，“Human Immunoglobulin Allotypes”Handbook of Experimental Immunology，Vol.3，ch94，pp1-18， Blackwell Scientific Publishers.Oxford，U.K.1986，4th Edition，在此全 文引入作为参考)。
Fc区表示抗体分子的Fc片段区域，包含铰链区、CH2和CH3 结构域的一部分，并且具有大约50,000的分子量。在分子用木瓜蛋白 酶消化时，人IgG重链Fc区是从第225位的苏氨酸到C末端(Burton， D.R.1985.Immunoglobulin G：functional sites.Mol.Immunol. 22：161-206，在此全文引入作为参考)。
此处使用的氨基酸位点的编号参照Kabat等人的“EU指数”方法 (Kabat EA等人，1991，Sequence of Proteins of Immunological Interest. 5th Ed.NIH，在此全文引入作为参考)。
Fc区与效应细胞例如巨噬细胞和NK细胞的细胞表面上存在的 Fc受体(FcR)结合。Fc受体参与抗体依赖的细胞毒性(ADCC)、 过敏反应、id反应，等等。Fc受体的类型根据免疫球蛋白的亚型而改 变。例如，IgG的Fc受体是Fcγ受体；IgE的Fc受体是Fcε受体；IgA 的Fc受体是Fcα受体。
CH2-CH3域由CH2域和CH3域组成。人IgG重链的CH2-CH3 域从第233位的丙氨酸到C-末端。
Fc-修饰的抗体
本发明的抗体是Fc-修饰的抗体，其中Fc区的氨基酸序列被修 饰。本发明中使用的“修饰”或“位点特异性诱变(诱变)”包括用任何 其他的氨基酸残基取代原始(未修饰的)氨基酸残基，删除原始氨基 酸残基，和添加其他氨基酸残基，但是优选地指用任何其他的氨基酸 残基取代原始的氨基酸残基。在此所指的原始(未修饰的)氨基酸序 列通常是天然Fc区序列。在上下文中，氨基酸残基的“修饰”和“诱变” 以相同意义使用。
在本发明中，氨基酸残基的修饰可通过使编码抗体的DNA突变 而完成。
在本发明中，“DNA突变”表示DNA以可能相应于待修饰的氨基 酸残基的方式被突变。更特别地，其表示编码原始氨基酸残基的DNA 突变为编码待修饰的氨基酸残基的DNA。通常，它表示插入、缺失 或取代原始DNA中的至少一个核苷酸以产生编码目的氨基酸残基的 密码子的基因工程或诱变处理。特别地，编码原始氨基酸残基的密码 子用编码待修饰的氨基酸残基的密码子取代。本领域技术人员按照已 知技术可以容易地进行所述DNA突变，例如，按照位点特异性诱变 方法例如PCR诱变方法(Hashimoto-Gogoh，T.等人，(1995)Gene 152， 271-275；Zoller，MJ和Smith，M.，(1983)Methods Enzymol.，100， 468-500；Kramer，W.等人，(1984)Nucleic Acids，Res.，12，9441-9456； Kramer W.和Fritz HJ，(1987)Methods Enzymol.，154，350-367；Kunkel， TA，(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，488-492；Kunkel，(1988) Methods Enzymol.，85，2763-2766，均在此全文引入作为参考)。
本发明中待修饰的Fc区的氨基酸残基的数目没有特别限制，可 以修饰一个或多个(例如，从1到30个，或2、3、4或5个)氨基 酸残基。
优选地，Fc区的位点239、298、326、330和332处的一个或多 个氨基酸残基用其他氨基酸残基取代。另外，Fc区的任意氨基酸残基 可用IgG1的任意同种异型的氨基酸残基取代，例如，用G1m(1)和 nG1m(1)的氨基酸残基取代。
本发明的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体没有特别限制，只要它 与磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3结合，但是优选地，该抗体特异性地与磷 脂酰肌醇蛋白聚糖-3结合。磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3的基因序列和 氨基酸序列是已知的(Lage，H.等人，Gene 188(1997)，151-156，在此全 文引入作为参考)。本发明的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体优选地是 IgG，更优选IgG1。
细胞毒性
本发明的包含修饰的Fc区的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体与具 有天然或野生型Fc区的抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体相比显示出增 强的细胞毒性。
细胞毒性活性包括，例如，抗体依赖的细胞介导的细胞毒性 (ADCC)活性，和补体依赖的细胞毒性(CDC)活性。在本发明中， CDC活性表示由补体系统引起的细胞毒性活性；ADCC活性表示，当 特异性抗体粘附到靶细胞的细胞表面抗原上，具有Fcγ受体的细胞(例 如，免疫细胞)通过Fcγ受体与Fc区结合，以此损伤靶细胞。
确定抗体是否具有ADCC活性或CDC活性可根据已知方法进行 (例如，见Current Protocols in Immunology，Chapter 7，Immunologic Studies in Humans，Editor，John E.Coligan等人，John Wiley&Sons，Inc. (1993)，在此全文引入作为参考)。
例如，ADCC活性可以如下确定：混合效应细胞、靶细胞和抗- 磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体，然后分析其ADCC活性的程度。效应 细胞可包括，例如，小鼠脾细胞，或分离自骨髓或人外周血的单核细 胞。靶细胞可包括建立的人细胞系，例如人肝细胞系HuH-7。将抗- 磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体加入到预先用51Cr标记并孵育的靶细胞 中，然后以适当的比例将效应细胞加入到靶细胞中。孵育之后，收集 上清液并分析放射活性，以确定抗体的ADCC活性。
CDC活性可如下确定：混合上述标记的靶细胞和抗-磷脂酰肌醇 蛋白聚糖-3抗体，添加补体到混合物中并孵育，然后分析上清液的放 射性。
抗体
此处所述的术语“抗体”以其最广泛的含意使用，表示任何和每种 抗体，包括单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、抗体 突变体、抗体片段、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、嵌合抗 体、人源化抗体等，只要其显示出期望的生物学活性。
抗体和免疫球蛋白是具有相同结构特征的蛋白质，并且本发明的 抗体包括免疫球蛋白。
此处所述的术语“单克隆抗体”表示从实质上均质的抗体组中获 得的抗体，或者说，除了可能自然发生的少数突变体之外，该抗体组 中的所有特定抗体是一致的。单克隆抗体是高度特异性的，通常作用 于单个抗原位点。而且，与一般包括针对不同表位的不同抗体的普通 多克隆抗体制剂相比，每种单克隆抗体针对一种抗原上的单个表位。 除了其特异性之外，单克隆抗体还具有另外一个优点，即，它通过培 养杂交瘤而合成，不会污染任何其他抗体。修饰语“单克隆”表示从实 质上一致的抗体组中获得的抗体的性质，不需要通过特定方法生产抗 体。例如，本发明使用的单克隆抗体可根据(例如)杂交瘤方法(Kohler 和Milstein，Nature 256：495(1975)，在此全文引入作为参考)或重组方 法(USP 4，816,567，在此全文引入作为参考)生产。本发明使用的单克 隆抗体也可从噬菌体抗体文库中分离(Clackson等人，Nature 352：624-628(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)，均 在此全文引入作为参考)。
术语“抗体片段”表示全长抗体的一部分。本发明中使用的抗体片 段优选地是保持抗体结合活性并且保持全长抗体的细胞毒性的抗体 片段。
多特异性抗体是对至少两种不同抗原具有特异性的抗体。通常， 这种类型的分子可与两种抗原结合(即，双特异性抗体)，但是在本 说明书中，“多特异性抗体”包括对两种以上的(例如，三种)抗原具 有特异性的抗体。多特异性抗体可以是全长抗体或所述抗体的片段。 例如，双特异性抗体可识别两种不同的抗原或可识别一个抗原的不同 表位。另外，其可识别细胞毒性物质。
本发明的抗体也可以是嵌合抗体或人源化抗体。通常，嵌合抗体 包含源于非人哺乳动物抗体的可变区，和源于人抗体的恒定区。另一 方面，人源化抗体包含源于非人哺乳动物的互补决定区，和源于人抗 体的框架区和恒定区。
嵌合抗体中的可变区的来源和人源化抗体中的CDR的来源没有 特别限制，可来源于任何动物。例如，可以利用源于小鼠抗体、大鼠 抗体、兔抗体或骆驼抗体的任何序列(Cook WJ等人，Protein Eng.1996 Jul 9(7)：623-8；Tsurushita N等人，J Immunol Methods.2004 Dec 295(1-2)：9-19；Sato K等人，Mol Immunol.1994 Apr 31(5)：371-81； Preparation of genetically engineered monoclonal antibodies for human immunotherapy.Hum Antibodies Hybridomas.1992 Jul 3(3)：137-45； Genetically engineered antibodies：progress and prospects.Crit Rev Immunol.1992；12(3-4)：125-68，均在此全文引入作为参考)。
对于嵌合抗体和人源化抗体的恒定区，可利用源于人抗体的恒定 区。例如，H-链可利用Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4，L-链可利用Cκ和 Cλ。
嵌合抗体是通过组合源于不同动物的序列而构建的抗体，例如， 它是包含小鼠抗体的重链和轻链可变区以及人抗体的重链和轻链恒 定区的抗体。所述嵌合抗体可用任何已知的方法构建。例如，连接编 码小鼠抗体可变区的DNA和编码人抗体恒定区的DNA，然后将其插 入到一种表达载体中，并且导入到宿主中，以产生目标抗体。
人源化抗体，也被称为重构人抗体，通过将非人哺乳动物的抗体 例如小鼠抗体的互补决定区(CDR)移植到人抗体的互补决定区之中 而构建。制备人源化抗体的常用遗传重组方法是本领域已知的(见 EP 125023；WO96/02576，在此全文引入作为参考)。
特别地，为了将小鼠抗体的CDR与人抗体的框架区(FR)连接 而设计的DNA序列可通过PCR方法合成，该PCR方法使用构建为 具有与CDR和FR末端区域重叠部分的几种寡核苷酸作为引物(见 WO98/13388中描述的方法，在此全文引入作为参考)。
选择将要与CDR连接的人抗体的框架区，以使互补决定区可形 成良好的抗原结合位点。如果期望，抗体可变区的框架区的氨基酸可 被取代，以使重构人抗体的互补决定区可形成适合的抗原结合位点 (Sato，K.等人，Cancer Res.(1993)53，851-856，在此全文引入作为参 考)。
另外，本发明的抗体也包括在上述Fc区特定位点之外的区域或 CDR区中具有一个或多个氨基酸突变的抗体，和与本发明抗体功能等 价的抗体。
为了制备包含与某种多肽不同的氨基酸序列但功能等价的多肽， 本领域技术人员公知向多肽中导入突变的方法。例如，本领域技术人 员可按照位点特异性诱变或类似方法向本发明的抗体中导入突变，以 制备与该抗体功能等价的抗体。氨基酸突变也可自发发生。
优选地，一种氨基酸残基被突变为具有与原始残基接近的侧链性 质的另一氨基酸残基。例如，关于其性质，氨基酸侧链包括疏水性氨 基酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)、亲水性氨基酸(R、D、N、C、 E、Q、G、H、K、S、T)、具有脂肪族侧链的氨基酸(G、A、V、L、 I、P)、侧链含羟基的氨基酸(S、T、Y)、侧链含硫原子的氨基酸(C、 M)，侧链含羧酸和氨基的氨基酸(D、N、E、Q)、侧链含碱基的氨基 酸(R、K、H)，具有芳香族侧链的氨基酸(H、F、Y、W)(括号中的 字母是氨基酸的单字母代码)。已知具有通过一个或多个氨基酸残基 的缺失、添加和/用任何其他氨基酸取代而从原始氨基酸序列修饰的氨 基酸序列的多肽仍然实质上保持了原始多肽的生物学活性(Mark，D.F. 等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1984)81，5662-5666；Zoller，M.J.和 Smith，M.，Nucleic Acids Research(1982)10，6487-6500；Wang，A.等人， Science 224，1431-1433；Dalbadie-McFarland，G.，等人，Proc.Natl.Acad. Sci.USA(1982)79，6409-6413，全部在此全文引入作为参考)。
用于本发明的抗体可以是与不同类型的分子例如非肽聚合物如 聚乙二醇(PEG)、放射性物质和毒素结合的偶联抗体。所述偶联抗 体可通过抗体的化学修饰而获得。化学修饰方法在本领域中已经建 立。本发明的抗体可包括这些偶联抗体(D.J.King.，Applications and Engineering of Monoclonal antibodies.，1998 T.J.International Ltd， Monoclonal Antibody-Based Therapy of Cancer.，1998 Marcel Dekker Inc；Chari等人，Cancer Res.，1992 Vol152：127；Liu等人，Proc Natl Acad Sci USA.，1996 Vol 93：8681，均全文在此引入作为参考)。
抗体制备
本发明的抗体可根据本领域技术人员已知的方法制备。具体而 言，将编码目标抗体的DNA插入到一种表达载体中。在此步骤中， DNA以可在表达控制区例如增强子和启动子的控制之下表达的方式 插入到表达载体中。接下来，用表达载体转染宿主细胞，并且在宿主 细胞中表达抗体。在这一过程中，可利用适合的宿主和适合的表达载 体的组合。
载体的例子包括M13载体、pUC载体、pBR322、pBluescript、 pCR-Script。对于cDNA的亚克隆和分离，例如，也可利用pGEM-T、 pDIRECT和pT7。
表达载体对于抗体生产是特别有用的。当大肠杆菌例如JM109、 DH5α、HB101或XL1-Blue用作宿主时，表达载体必须不可缺少地具 有驱动载体在大肠杆菌中有效表达的启动子，例如，lacZ启动子(Ward 等人，Nature(1989)341，544-546；FASEB J.(1992)6，2422-2427，在此 全文引入作为参考)、araB启动子(Better等人，Science(1988)240， 1041-1043，在此全文引入作为参考)或T7启动子。这种类型的载体也 包括pGEX-5X-1(Pharmacia)、QIA表达系统(QIAGEN)、pEGFP和 pET(在此情况中，宿主优选为表达T7RNA聚合酶的BL21)。
载体可包括用于多肽分泌的信号序列。对于用于多肽分泌的信号 序列，例如，pelB信号序列(Lei，S.P.等人，Bacteriol.(1987)169，4397， 在此引入作为参考)可用于在大肠杆菌周质中生产。载体向宿主细胞 中的导入可(例如)按照氯化钙方法或电穿孔方法来实现。
除了大肠杆菌表达载体，本发明中用于多肽生产的载体包括，例 如，来源于哺乳动物的表达载体(例如，pcDNA3(Invitrogen)、 pEGF-BOS(Nucleic acids，Res.，1990，18(17)，p.5322，在此引入作为参 考)、pEF、pCDM8)；来源于昆虫细胞的表达载体(例如，Bac-toBAC 杆状病毒表达系统(GIBCO BRL)、pBacPAK8)；来源于植物的表达载 体(例如，pMH1、pMH2)；来源于动物病毒的表达载体(例如，pHSV、 pMV、pAdexLcw)，来源于逆转录病毒的表达载体(例如，pZIPneo)， 来源于酵母的表达载体(例如，毕赤酵母表达试剂盒(Invitrogen)、 pNV11、SP-Q01)；来源于枯草杆菌的表达载体(例如，pPL608、 pKTH50)。
对于在动物细胞例如CHO细胞、COS细胞或NIH3T3细胞中的 表达，载体必须不可缺少地具有细胞内表达所需的启动子，例如，SV40 启动子(Mulligan等人，Nature(1979)277，108，在此全文引入作为参 考)、MMTV-LTR启动子、EF1α启动子(Mizushima等人，Nucleic Acids Res.(1990)18，5322，在此全文引入作为参考)、CAG启动子(Gene (1991)108，193，在此全文引入作为参考)、CMV启动子。优选地， 载体具有用于筛选被转化细胞的基因(例如，能够用药物(例如，新 霉素，G418)区别的抗药性基因)。具有所述特性的载体包括，例如， pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV、pOP13。
进一步，为了在细胞中稳定基因表达和提高基因拷贝数，将具有 互补的DHFR基因的载体(例如，pCHOI)导入核酸合成途径缺陷的 CHO细胞中以补救该缺陷，并应用氨甲喋呤(MTX)扩增。为了基 因瞬时表达的目的，用具有SV40复制起点的载体(例如，pcd)转化 在染色体上具有表达SV40T抗原的基因的COS细胞。复制起点也可 来源于多瘤病毒、腺病毒、牛多瘤病毒(BPV)，等等。进一步，为 了在宿主细胞系统中增加基因拷贝数，表达载体可包含选择性标记 物，例如氨基糖苷转移酶(APH)基因、胸苷激酶(TK)基因、大 肠杆菌黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(Ecogpt)基因、二氢叶酸 还原酶(dhfr)基因。
药物组合物
本发明也涉及一种包含本发明抗体的药物组合物。由于本发明的 抗体表现出增强的细胞毒性活性，因此它适合用于药物组合物中，并 且特别地，它作为抗癌剂是有用的。由于已经表明抗-磷脂酰肌醇蛋 白聚糖-3抗体对来源于肝癌的细胞系具有细胞毒性(例如， WO03/00883，在此全文引入作为参考)，本发明的抗体作为治疗肝癌 的药物是特别有用的。当本发明的抗体在药物组合物中使用时，考虑 到对人的抗原性，优选人源化抗体。
本发明的药物组合物可包含药学上可接受的载体。药学上可接受 的载体包括，例如，无菌水、生理盐水、稳定剂、赋形剂、抗氧化剂 (例如，抗坏血酸)、缓冲液(例如，磷酸、柠檬酸、其他有机酸)、 防腐剂、表面活性剂(例如，PEG、Tween)、螯合剂(例如，EDTA) 或粘合剂。另外，本发明的药物组合物可进一步包含任何其他低分子 多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；氨基酸，例如 甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸、赖氨酸；糖，例如多糖、单 糖；碳水化合物；糖醇，例如甘露醇、山梨糖醇。当组合物制备为注 射用水溶液时，它可与等渗溶液组合，该等渗溶液包含，例如，生理 盐水、葡萄糖或其他任何辅剂，例如，D-山梨糖醇、D-甘露糖、D- 甘露醇、氯化钠，并且与适当的溶解助剂组合，例如醇(例如，乙醇)、 多元醇(例如，丙二醇、PEG)、非离子表面活性剂(例如，聚山梨 酯80、HCO-50)。
如果期望，可将组合物包封到微胶囊中(羟甲基纤维素、明胶、 聚(甲基丙烯酸甲酯)等的微胶囊)，或可形成为胶体给药系统(例 如，脂质体、白蛋白微球、微乳剂、纳米颗粒、纳米胶囊)(见Remington′s Pharmaceutical Science，16th edition，Oslo Ed.，1980，在此全文引入作 为参考)。而且，配制缓释药物的方法是已知的并可应用于本发明 (Langer等人，J.Biomed.Mater.Res.，1981，15：167-277；Langer，Chem. Tech.，1982，12：98-105；USP 3,773,919；EP 58,481；Sidman等人， Biopolymers 1983，22：547-556；EP 133,988)。
组合物可通过口服或肠胃外施用于患者，但优选肠胃外途径。本 发明药物组合物的形状(制剂剂型)没有特别限制，包括，例如，注 射剂、经鼻制剂、经肺制剂、经皮制剂、冻干制剂、溶液。优选的是 冻干制剂。
冻干可以采用本领域技术人员公知的任何方法实现(Pharm. Biotechnol.，2002，13，109-133；Int.J.Pharm.，2000，203(1-2)，1-60； Pharm.Res.，1997，14(8)，969-975，均在此全文引入作为参考)。例如， 将组合物溶液适当地等分到冻干小瓶或类似容器中，并置于冰箱或冻 干机中，或浸入冷冻剂例如丙酮/干冰和液氮中。当抗体制剂形成为高 浓度溶液制剂时，它可根据本领域技术人员公知的方法制备。例如， 可采用J.Pharm.Sci.，2004，93(6)，1390-1402(在此全文引入作为参考) 描述的利用TFF膜的膜浓缩法。
注射制剂可以全身或局部给药，例如，以静脉内注射、肌肉内注 射、腹膜内注射或皮下注射的方式。根据施用组合物的患者的年龄和 状况，可适当地选择给药方法。剂量可选自，例如，单元剂量为从0.0001 mg/kg体重到1000mg/kg体重的范围。可选地，剂量可选自0.001到 100000mg/体重的范围。然而，本发明不应局限于上述剂量和给药方 法。
本发明将参考下面的实施例进行更详细的描述，但本发明不应局 限于这些实施例。
实施例
实施例1：Fc-修饰的抗-GPC3抗体的产生：
实施例1-1：用于诱变的Fc盒的制备：
Fc修饰的人源化抗-GPC3抗体在SEQ ID NO：19所示的H-链氨基 酸序列中具有下表所示的氨基酸取代。图1显示了本发明的Fc-修饰 的抗体的结构和制备策略。
V22 I332E V209 S239D/A330L/I332E V212 S239D/S298A/I332E V922 S239D/K326T/I332E V1608 S239D/S298A/K326T/I332E V209nG1m(1) S239D/A330L/I332E/D356E/L358M
利用SEQ ID NO：1到NO：9所示的引物，根据PCR步移法产生了 用于构建五种名为V22、V209、V212、V922和V1608的Fc-修饰 抗体的Fc-突变盒。具体地，通用引物F1和通用R1用于V22、V209 和V922；引物212-F1和212-F1用于V212和V1608。在下述的 PCR反应溶液中进行第一阶段PCR：
混合5μl的×10KOD缓冲液、分别5μl和2μl的dNTPs和MgCl2(附带于KOD聚合酶中，Toyobo)。加入上述引物组合(20μmol/l， 各1μl)、dH2O 35.5μl和5单位/μl KOD聚合酶0.5μl，以产生50μl 的总量。PCR在下述条件下进行。
96℃1分钟；(98℃15秒；65℃2秒；74℃15秒)×2循环；74℃30 秒；4℃。
取出一微升的第一阶段扩增产物，用于接下来的第二阶段PCR 反应。具体地，通用引物F2和212-R2用于V22和V212；通用引 物F2和209-R2用于V209；通用引物F2和922-R2用于V922； 通用引物F2和1608-R2用于V1608。第二阶段PCR在下述PCR反 应溶液中进行：混合×10KOD缓冲液5μl、dNTPs和MgCl2分别5μl 和2μl(附带于KOD聚合酶中，Toyobo)。加入上述引物组合(20 μmol/l，各1μl)、1μl的第一阶段扩增产物作为模板、dH2O 35.5μl 和5单位/μl KOD聚合酶0.5μl，以产生51μl的总量。PCR在下述条 件下进行。
96℃1分钟；(98℃15秒；65℃2秒；74℃15秒)×5循环；74℃ 30秒；4℃。
取出一微升的第二阶段扩增产物，用于接下来的第三阶段PCR 反应。具体地，通用引物F3和通用R3用于V22、V209、V212、V922 和V1608，第三阶段PCR在下述PCR反应溶液中进行。
混合×10KOD缓冲液5μl、dNTPs和MgCl2分别5μl和2μl(附 带于KOD聚合酶中，Toyobo)。加入上述引物组合(20μmol/l，各1 μl)、1μl的第二阶段扩增产物作为模板、dH2O 35.5μl和5单位/μl KOD聚合酶0.5μl，以产生51μl的总量。利用这些，在下述条件下 进行PCR。
96℃1分钟；(98℃15秒；65℃2秒；74℃20秒)×35循环；74℃1 分钟；4℃。
将获得的每个片段亚克隆入pBluescriptSK+中并确认其序列。
正向引物：212-F1(SEQ ID NO：1)
agttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggag cagtacaacgccacgtaccgtgtggtcagcgtcc
正向引物：通用F2(SEQ ID NO：2)
tctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtca agttcaactggtacgtggacggcgtggagg
正向引物：通用F3(SEQ ID NO：3)
gcacctgagctcctggggggaccggacgtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctca tgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtgg
反向引物：212-R1(SEQ ID NO：4)
ggagaccttgcacttgtactccttgccattcagccagtcctggtgcaggacggtgaggacgctga ccacacggtacgtggcgttgtactgctcc
反向引物：209-R2(SEQ ID NO：5)
ggctgccctttggctttggagatggttttctcctcgggcagtgggagggctttgttggagaccttgc acttgtactccttgccattcagcc
反向引物：212-R2(SEQ ID NO：6)
ggctgccctttggctttggagatggttttctcctcgggggctgggagggctttgttggagaccttgc acttgtactccttgccattcagcc
反向引物：922-R2(SEQ ID NO：7)
ggctgccctttggctttggagatggttttctcctcgggggctgggagggcggtgttggagaccttg cacttgtactccttgccattcagcc
反向引物：1608-R2(SEQ ID NO：8)
ggctgccctttggctttggagatggttttctcctcgggggctgggagggcctcgttggagaccttg cacttgtactccttgccattcagcc
反向引物：通用R3(SEQ ID NO：9)
gagctccccgggatgggggcagggtgtacacctgtggttctcggggctgccctttggctttgga gatggttttctcctcgg
实施例1-2：表达Fc-修饰的抗-GPC3抗体的载体的制备
根据发明人先前制备的编码人源化抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗 体的基因(H-链，SEQ ID NO：10；L-链，SEQ ID NO：11)，构建一 种用于表达本发明的Fc-修饰的抗-GPC3抗体的载体，其在下面的 实施例中被称为“野生型”。
野生型人源化抗-GPC3抗体的H-链可变区和L-链可变区的氨 基酸序列分别显示于SEQ ID NO：21(ver.k)和SEQ ID NO：22(ver.a)中。 野生型人源化抗-GPC3抗体的CDR序列显示如下。
H-链
CDR1 DYEMH(SEQ ID NO：23)
CDR2 ALDPKTGDTAYSQKFKG(SEQ ID NO：24)
CDR3 FYSYTY(SEQ ID NO：25)
L-链
CDR1 RSSQSLVHSNGNTYLH(SEQ ID NO：26)
CDR2 KVSNRFS(SEQ ID NO：27)
CDR3 SQNTHVPPT(SEQ ID NO：28)
利用SEQ ID NO：10所示的抗-人GPC3抗体H-链基因作为模板， 利用预先引入作为沉默突变的一个SacI位点的SEQ ID NO：11的引物 和SEQ ID NO：12的引物，在下述条件下进行PCR。
混合×10KOD缓冲液5μl、dNTPs和MgCl2分别5μl和2μl(附 带于KOD聚合酶中，Toyobo)。加入如上所述的引物组合(20μmol/l， 各1μl)、1μl的GPC3抗体H-链基因作为模板、dH2O 34.5μl和5单 位/μl KOD聚合酶0.5μl，以得到50μl的总量。在下述条件下进行 PCR。
96℃1分钟；(98℃15秒；65℃2秒；74℃30秒)×35循环；74℃ 30秒；4℃。
将获得的片段导入到pBluescriptSK+(pB-Sacless)的SmaI位点内， 其中SacI位点已经事先用DNA平端化试剂盒(Takara Bio)补平，并且 确认其序列(pB-GPCSacmt)。接下来，从包含SEQ ID NO：10所示抗- GPC3抗体H-链基因的载体上切下大约290bp的SmaI-BamHI片段， 该片段对应于抗-人GPC3抗体H-链的C-末端序列，将该片段导入 到pB-GPCSacmt(pB-GPCSacmtC)的相应位点中。接下来，将实施例 1-1中产生的V22、V209、V212、V922或V1608的Fc-突变盒导入 到pB-GPCSacmtC的SacI-SmaI位点中，并且确认pB-GPCSacmtC的 序列。进一步，为了完成突变的H-链的构建，将SEQ ID NO：10所示 GPC3抗体H-链基因的大约415bp的EcoRI-NheI片段与其连接，以 获得编码Fc-突变的H-链的基因。
获得的编码突变H-链的基因用EcoRI-NotI酶切，并导入到动物 细胞表达载体pCXND3(pC-aGPCh)的相应位点中。接下来，用HindIII 酶切包含SEQ ID NO：13所示的抗-GPC3抗体L-链基因和启动子区 的大约3.1kb的片段，并且与pC-aGPCh的相应位点连接，以获得抗 -GPC3抗体表达载体(pC-aGPChl)。V22、V209、V212、V922和V1608 的载体pC-aGPChl被分别命名为pC-aGPChl(22)、pC-aGPChl(209)、 pC-aGPChl(212)、pC-aGPChl(922)和pC-aGPChl(1608)。
V22、V209、V212、V922和V1608的H链的氨基酸序列分别显 示于V22(SEQ ID NO：29)、V209(SEQ ID NO：30)、V212(SEQ ID NO： 31)、V922(SEQ ID NO：32)和V1608(SEQ ID NO：33)中。V22、V209、 V212、V922和V1608的CH2-CH3结构域的氨基酸序列分别显示于 V22CH2-CH3结构域(SEQ ID NO：34)、V209CH2-CH3结构域(SEQ ID NO：35)、V212CH2-CH3结构域(SEQ ID NO：36)、V922CH2-CH3 结构域(SEQ ID NO：37)和V1608CH2-CH3结构域(SEQ ID NO：38) 中。
抗-人GPC3抗体H-链(SEQ ID NO：10)
GAATTCCACCATGGACTGGACCTGGAGGTTCCTCTTTGTGG
TGGCAGCAGCTACAGGTGTCCAGTCCCAGGTGCAGCTGGTGCA
GTCTGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTC
TCCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACCGACTATGAAATGCAC
TGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAG
CTCTTGATCCTAAAACTGGTGATACTGCCTACAGTCAGAAGTTCA
AGGGCAGAGTCACGCTGACCGCGGACAAATCCACGAGCACAGC
CTACATGGAGCTGAGCAGCCTGACATCTGAGGACACGGCCGTGT
ATTACTGTACAAGATTCTACTCCTATACTTACTGGGGCCAGGGAA
CCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTC
TTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGC
GGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGA
CGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACAC
CTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAG
CGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACA
TCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAA
GAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCAC
CGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTC
TTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCC
TGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCT
GAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAA
TGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTAC
CGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAA
TGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCA
GCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCC
GAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTG
ACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTA
TCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCG
GAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACG
GCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGG
TGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGC
TCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGG
GTAAATGATAAGCGGCCGCGGATCC
正向引物：NS-F(SEQ ID NO：11)
gctagcaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctcc
反向引物：NS-R(SEQ ID NO：12)
gagctcaggtgctgggcacggtgggcatgtgtgagttttgtcac
抗-人GPC3抗体L-链(SEQ ID NO：13)
AAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCGTCGA
CATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATT
AGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTA
AATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGAC
GTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTT
CCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTT
GGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGA
CGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACAT
GACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTC
ATCGCTATTACCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACT
CTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTA
TTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGG
GGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGC
GGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGC
GCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCG
GCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCG
CGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCG
CCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCG
GGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTT
AATGACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGAG
GGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGGGAGCGGCTCGGGGG
GTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCTCC
GCGCTGCCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGC
TTTGTGCGCTCCGCAGTGTGCGCGAGGGGAGCGCGGCCGGGGG
CGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAGGC
TGCGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGG
GCGCGTCGGTCGGGCTGCAACCCCCCCTGCACCCCCCTCCCCGA
GTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTACGGG
GCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAG
GTGGGGGTGCCGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGG
GCTCGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCCCCGGAGCGCCGGCGGCTG
TCGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGT
GCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTGTGCGGAG
CCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCG
GGGCGAAGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGG
AGGGCCTTCGTGCGTCGCCGCGCCGCCGTCCCCTTCTCCCTCTC
CAGCCTCGGGGCTGTCCGCGGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGG
GACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGG
CTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTA
CAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGCTGTCTCATCATTTT
GGCAAAGAATTCCTCGAGCCACCATGAGGCTCCCTGCTCAGCTC
CTGGGGCTGCTAATGCTCTGGGTCTCTGGATCCAGTGGGGATGTT
GTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTGGAGA
GCCGGCCTCCATCTCCTGCAGATCTAGTCAGAGCCTTGTACACA
GTAATAGGAACACCTATTTACATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGG
CAGTCTCCACAGCTCCTGATCTATAAAGTTTCCAACCGATTTTCT
GGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACAGATTT
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CTACTCCCAGTCATAGCTGTCCCTCTTCTCTTATGGAGATCCCTCG
ACCTGCAGCCCAAGCTT
实施例1-3：V209nG1m(1)同种异型的产生：
为获得V209的同种异型nG1m(1)、其G1m(1)同种异型，形成了 用于nG1m(1)同种异型的盒。具体地，利用SEQ ID NO：14和NO：15 所示的正向引物HerSmaF和反向引物HerNotR，并且利用SEQ ID NO：10所示的并且在实施例1-2中产生的抗-GPC3抗体H-链基因 作为模板，在下述条件下进行PCR。
混合×10KOD缓冲液5μl、dNTPs和MgCl2分别5μl和2μl(附 带于KOD聚合酶中，Toyobo)。加入上述引物组合(20μmol/l，各1μl)、 GPC3抗体H-链基因1μl、dH2O 34.5μl和5单位/μl KOD聚合酶0.5 μl，以获得50μl的总量。在下述条件下进行PCR。
96℃1分钟；(98℃15秒；65℃2秒；74℃30秒)×35循环；74℃ 30秒；4℃。
将获得的片段亚克隆入pBluescriptSK+(pBher)中，确认其序列。 接下来，从实施例1-2描述的pC-aGPChl(209)中切下大约290bp的 SmaI-NotI片段。另一方面，以同样的方式从pBher中切下SmaI-NotI 片段，将大约290bp的片段导入到pC-aGPChl(209)的相应位点中进 行替换，以获得nG1m(1)同种异型表达载体(pC-aGPChl(209Her))。
正向引物：HerSmaF(SEQ ID NO：14)
gggaggagatgaccaagaaccaggtcaccctgacctgcc
反向引物：HerNotR(SEQ ID NO：15)
tttgcggccgcttatcatttacccggagacagggagaggctc
实施例2：Fc-修饰的抗-GPC3抗体的制备：
实施例2-1：Fc-修饰的抗-GPC3抗体在CHO细胞中的表达：
用PvuI酶切十微升的Fc-修饰的抗-GPC3抗体表达载体 pC-aGPChl(22)、pC-aGPChl(209)、pC-aGPChl(212)、pC-aGPChl(922)、 pC-aGPChl(1608)或pC-aGPChl(209Her)以产生线性DNA。将其通过 电穿孔法在1.5kV和25μF的条件下导入到2×106/0.6ml PBS(-)的 CHO细胞(DXB11S株)中。细胞在37℃、8％CO2的培养箱中培养。 在包含400μg/ml遗传霉素的CHO-S-SFMII培养基(Invitrogen)中筛选 细胞。选择的细胞以0.4细胞/100μl/孔的密度接种到96孔板中包含 400μg/ml遗传霉素的CHO-S-SFMII培养基中，通过限制稀释法克隆 细胞。用BIACORE 3000分析培养上清液。抗原利用其上固定有融合 蛋白GST-GPC3(SEQ ID NO：16所示的抗原GST和人磷脂酰肌醇蛋 白聚糖-3)的芯片定量，选择高表达的细胞。
GPC3肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：16)
AELAYDLDVDDAPGNSQQATPKDNEISTFHNLGNVHSPLK
实施例2-2：Fc-修饰的抗-GPC3抗体的纯化：
将表达Fc-修饰的人源化磷脂酰肌醇蛋白聚糖抗体的CHO细胞 的培养上清液加样到用包含150mM NaCl的10mM柠檬酸盐-磷 酸盐缓冲液(PH7.5)平衡的rProtein A Sepharose Fast Flow柱上。该 柱用相同的缓冲液、用包含1M NaCl的10mM柠檬酸盐-磷酸盐缓 冲液(PH7.5)、然后用10mM的柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液(PH7.5) 洗涤，吸附到柱子上的蛋白质用20mM的乙酸洗脱。向包含Fc-修饰 的人源化抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖抗体的20mM乙酸级分中加入1M tris-HCl缓冲液(pH 8.5)以将pH从5调节到6，并且通过0.22μm的 滤器过滤。向过滤的级分中加入相当量的MilliQ水，加样到用20mM 乙酸缓冲液(PH6.0)平衡的SP Sepharose Fast Flow柱上。该柱用相 同的缓冲液洗涤，然后用包含20mM NaCl的20mM乙酸缓冲液(PH6.0) 洗脱吸附于柱子上的蛋白质，以获得纯化的Fc-修饰的人源化抗-磷 脂酰肌醇蛋白聚糖抗体。
图2显示了利用已知方法(Nature，227，680，1970，在此全文引入 作为参考)进行的，纯化的本发明Fc-修饰的人源化抗-磷脂酰肌醇 蛋白聚糖抗体的SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)结果，以分析抗 体的分子量和纯度。每种纯化的Fc-修饰的人源化抗-磷脂酰肌醇蛋 白聚糖抗体在非还原条件下显示大约150KDa分子量的单一条带，在 还原条件下显示大约50kDa和大约25kDa的两条条带。这些分子量 与根据抗体H-链和L-链cDNAs的核苷酸序列预测的基本一致，并且 进一步与以下报道一致：IgG型抗体在非还原条件下具有大约150kDa 的分子量，在还原条件下H-链具有大约50kDa的分子量，L-链具 有大约25kDa分子量，其中其分子内二硫键被切开(Antibodies， Chapter 14，Monoclonal Antibodies，在此全文引入作为参考)。已经证 实，每种Fc-修饰的人源化抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖抗体表达为具有 正确结构的抗体分子，并且同样地纯化。
图3显示了通过凝胶渗透柱(Superdex 200PC3.2/30，GE Amersham Biosciences)分析，纯化的Fc-修饰的人源化抗-磷脂酰肌 醇蛋白聚糖-3抗体的色谱图。
实施例3：Fc-修饰的抗-GPC3抗体的ADCC活性的测定
实施例3-1：人磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)的cDNA克隆：
以按照通常方法从结肠癌细胞系Caco2中制备的第一链cDNA作 为模板，利用Advantage2试剂盒(CLONETECH)通过PCR扩增了编码 人GPC3的全长cDNA。具体地，50μl包含2μl Caco2衍生的cDNA 的反应溶液，1μl的正义引物 (GATATC-ATGGCCGGGACCGTGCGCACCGCGT，SEQ ID NO：17)，1 μl反义引物(GCTAGC-TCAGTGCACCAGGAAGAAGAAGCAC，SEQ ID NO：18)，5μl的Advantage2 10×PCR缓冲液，8μl的dNTX混合 物(1.25mM)和1.0μl的Advantage聚合酶混合物，进行94℃1分 钟；63℃30秒；68℃3分钟的35个循环。利用pGEM-T Easy载体系 统I(Promega)将PCR扩增产物插入到TA载体pGEM-Teasy中。产物 的序列利用ABI3100 DNA测序仪进行确认。以这种方式，分离编码 全长人GPC3的cDNA。人GPC3基因的核苷酸序列显示于SEQ ID NO：19中，人GPC3蛋白的氨基酸序列显示于SEQ ID NO：20中。
实施例3-2：表达全长GPC3的人肝癌细胞系(SK-03)的制备：
为了获得评价抗-GPC3抗体的生物学活性的细胞系，建立了一 种能够表达全长GPC3的人肝癌细胞系。
用PvuI处理的1μg全长人GPC3基因表达载体与2μl FuGENE (Roche)混合，形成一种复合物，然后将其加入到SK-HEP-1细胞(购 自ATCC)中进行基因导入。细胞在CO2培养箱中培养24小时，然 后，利用含有终浓度1mg/ml的遗传霉素(Invitrogen)和10％FBS的 Dulbecco MEM(D-MEM，SIGMA)选择GPC3-表达细胞。收集获得的 遗传霉素抗性菌落，按照有限稀释法克隆细胞。通过利用嵌合GC33 抗体和FITC-标记的山羊抗-人IgG抗体(ICN)的流式细胞术确定 每个细胞克隆中人GPC3的表达，以获得稳定表达细胞系SK-03。
实施例3-3：用来源于人外周血的PBMC测定ADCC活性：
实施例3-3-1：人PBMC溶液的制备：
从一名健康人中采集添加了肝素的外周血，用PBS(-)稀释2倍， 并且覆盖于Ficoll-PaqueTM PLUS(Amersham)之上。离心(500×g，30 分钟，20℃)之后，收集单核细胞部分的间层。将单核细胞洗涤三次， 并且在10％FBS/RPMI中悬浮，以制备人PBMC溶液。
实施例3-3-2：靶细胞的制备：
SK-03细胞保存在含有1mg/ml遗传霉素和10％FBS (ThermoTrace)的D-MEM培养基(SIGMA)中。利用细胞分离缓冲液 (Invitrogen)使细胞从培养皿上脱落，并且以1×104细胞/孔转移到96 孔U形底板(Falcon)的每个孔中，培养1天。培养之后，加入5.55MBq 铬-51，细胞在37℃、5％CO2培养箱中进一步培养4小时。细胞用 培养液洗涤一次，悬浮于50μl的10％FBS/RPMI1640培养基中，以 制备靶细胞。
实施例3-3-3：铬释放实验(ADCC活性)：
将50μl制备为预定浓度的抗体溶液倍加入到靶细胞中，并且在 室温下反应15分钟。接下来，加入100μl人PBMC溶液(5×105细胞 /孔)，并且离心，然后在37℃、5％CO2培养箱中培养4小时。培养 之后，离心培养板，用γ计数器计数100μl培养上清液的放射性。样 品的比铬释放率根据下式获得：
比铬释放率(％)＝(A-C)×100/(B-C)，其中A表示每孔中放射性 (cpm)的平均值；B表示每孔中放射性(cpm)平均值，其中100μl 2％NP-40水溶液(Nonidet P-40，编号252-23，Nacalai Tesque)和50μl 的10％FBS/RPMI培养液加入到靶细胞中；C表示每孔中的放射性 (cpm)平均值，其中150μl的10％FBS/RPMI培养液加入到靶细胞 中。
实验重复进行三次，计算样品的ADCC活性(％)平均值。
结果显示于图4中。Fc-修饰的人源化抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖 抗体V22、V209、V922、V1608和V209(nG1m(1))相对于野生型抗体 (WT)都具有增强的ADCC活性。其中，V22的活性比其他的低， 但是在V209、V922、V1608和V209(nG1m(1))之间只发现很小的活性 差别。
实施例3-4：利用来源于小鼠骨髓的效应细胞测定ADCC活性：
实施例3-4-1：来源于小鼠骨髓的效应细胞悬浮液的制备：
从SCID小鼠(来自Nippon Clea，雄性，10周龄)的股骨中收集骨 髓细胞，以5×105细胞/ml的密度悬浮于10％FBS/RPMI1640培养液 中。小鼠GM-CSF(Pepro Tech)和人IL-2(Pepro Tech)分别以终浓度10 ng/ml和50ng/ml加入。细胞在37℃、5％CO2培养箱器中培养5天。 培养之后，用刮刀使细胞脱落，用培养液洗涤一次，以5×106细胞/ml 的密度悬浮于10％FBS/RPMI1640培养液中，以制备来源于小鼠骨 髓的效应细胞悬浮液。
实施例3-4-2：靶细胞的制备：
人肝癌细胞HepG2(购自ATCC)保持在含有10％FBS(Thermo Trace)的RPMI1640培养液(SIGMA)中。利用细胞分离缓冲液 (Invitrogen)使细胞从培养皿上脱落，并以1×104细胞/孔的密度转移 到96孔U形底培养板(Falcon)的每个孔中，培养1天。培养之后，加 入5.55MBq的铬-51，细胞在37℃、5％CO2培养箱中继续培养4 小时。细胞用培养液洗涤一次，并且悬浮于50μl的10％ FBS/RPMI1640培养液中，以制备靶细胞。
实施例3-4-3：铬释放实验(ADCC活性)：
向靶细胞中加入50μl的制备为预定浓度的抗体溶液，在室温下 反应15分钟。接下来，加入100μl来源于小鼠骨髓的效应细胞悬浮 液(5×105细胞/孔)，离心，然后在37℃、5％CO2培养箱中培养4 小时。培养之后，离心培养板，利用γ计数器计数100μl的培养上清 液的放射性。根据下式获得样品的比铬释放率：
比铬释放率(％)＝(A-C)×100/(B-C)，其中A表示每孔中放射性 (cpm)的平均值；B表示每孔中放射性(cpm)平均值，其中100μl 2％NP-40水溶液(Nonidet P-40，编号252-23，Nacalai Tesque)和50μl 的10％FBS/RPMI培养液加入到靶细胞；C表示每孔中的放射性 (cpm)平均值，其中150μl的10％FBS/RPMI培养液加入到靶细胞。
实验重复进行三次，计算样品的ADCC活性(％)平均值。
结果显示于图5中。Fc-修饰的人源化抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖 抗体V22、V209和V1608相对于野生型抗体(WT)都具有增强的 ADCC活性。
工业实用性
Fc-修饰的人源化抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体在治疗癌症 例如肝癌中是有用的。