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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201511019785.8 (22)申请日 2015.12.29 CGMCC No.11736 2015.11.25 C12N 1/16(2006.01) C12P 17/04(2006.01) C12R 1/645(2006.01) (71)申请人 西藏天虹科技股份有限责任公司 地址 850000 西藏自治区拉萨市经济技术开 发区 B 区拉青路 (72)发明人 张春颖 (74)专利代理机构 北京远大卓悦知识产权代理 事务所 ( 普通合伙 ) 11369 代理人 史霞 (54) 发明名称 解脂亚罗酵母及利用其生产 - 癸内酯的方 法 (。
2、57) 摘要 本发明公开了一种解脂亚罗酵母 Yarrowia Lipolytica C85#， 所述解脂亚罗酵母 Yarrowia Lipolytica C85# 被保藏在中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物中心， 保藏号为 ： CGMCC No.11736， 保藏时间为 ： 2015 年 11 月 25 日。本发 明还公开了一种利用解脂亚罗酵母生产 - 癸内 酯的方法。本发明对高产菌株发酵工艺进行了优 化， 确定了发酵的工艺参数， 提高了 - 癸内酯的 产量。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书。
3、5页 附图1页 CN 105505802 A 2016.04.20 CN 105505802 A 1.一种解脂亚罗酵母YarrowiaLipolyticaC85#， 其特征在于， 所述解脂亚罗酵母 YarrowiaLipolyticaC85#被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保 藏号为： CGMCCNo.11736， 保藏时间为： 2015年11月25日。 2.一种利用如权利要求1所述的解脂亚罗酵母生产-癸内酯的方法， 其特征在于， 将 权利要求1所述的解脂亚罗酵母发酵培养， 产生-癸内酯。 3.如权利要求2所述的方法， 其特征在于， 所述发酵培养的温度为25-27， 所述。
4、发酵 培养的时间为280-288h。 4.如权利要求3所述的方法， 其特征在于， 在发酵培养中， 于培养开始后的64h、 76h、 92h 和102h分别向发酵培养基中按照质量体积分数补加3-4的葡萄糖和2-7的蓖麻甲 醇酸甲酯。 5.如权利要求2所述的方法， 其特征在于， 在所述发酵培养中， 初始搅拌速度为45- 50rpm， 当发酵培养基中的溶氧低于30后， 首先按照0.2vvm、 0.3vvm和0.4vvm的顺序每隔 一定时间调整空气流量， 然后按照0.03MPa、 0.04MPa和0.05MPa的顺序每隔一定时间调整压 力， 最后按照50rpm、 60rpm和70rpm的顺序每隔一定时。
5、间调整搅拌速度。 6.如权利要求5所述的方法， 其特征在于， 所述一定时间为510min。 7.如权利要求2所述的方法， 其特征在于， 培养过程中， 在产生-癸内酯之后还包括采 用超临界CO2方法萃取-癸内酯。 8.如权利要求7所述的方法， 其特征在于， 所述超临界CO2方法中采取的温度为30-40， 压力为10-15MPa， 时间为1.5-3.0h。 9.如权利要求2所述的方法， 其特征在于， 所述发酵培养基包含： 葡萄糖30-40g/L， 玉米 浆50-60g/L， 蓖麻甲醇酸甲酯80-100g/L， 吐温-808-10g/L， 硫酸铵10-12g/L， 硫酸镁2.4- 3.2g/L， 磷。
6、酸钠1.2-2.8g/L， 磷酸二氢钾0.5-1.8g/L， VB25-10mg/kg和硫酸铁20-30mg/L。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105505802 A 2 解脂亚罗酵母及利用其生产-癸内酯的方法 技术领域 0001 本发明属于工业生物技术领域， 涉及一种解脂亚罗酵母， 还涉及一种利用该解脂 亚罗酵母发酵制取-癸内酯的方法。 背景技术 0002 -癸内酯(-Decalactone， GDL)是一种内酯类香味物质， 它是一个含有五元内 酯环的十碳化合物， 分子式为C10H18O2， 分子量为170.25。 GDL为无色液体， 呈椰子、 桃子、 柑 橘、 椰子香气， 沸点153。
7、/2000Pa或l14-116/66.7Pa， 折射率(nD21.5)1.4610， 微溶于水， 易溶于有机溶剂。 被广泛用于配制奶油、 桃子、 柑橘和椰子等型香精中， 是香料中需求较大 的产品之一。 GDL天然存在于桃子、 草莓、 椰子、 芒果、 杏、 啤酒、 朗姆酒中， 具有醋香、 果香、 奶 油香、 桃子、 椰子香， 也存在于乳制品的风味物质中， 是调配桃子、 杏、 浆果、 奶油、 柑橘、 椰 子、 巧克力、 奶制品等食用香精的常用原料。 0003 1969年， GDL被美国食品药品管理局认为是安全的食品添加剂和药物添加剂我国 GB2760-86规定为允许使用的食用香料。 它以其诱人的桃。
8、香和低香气阈值(水中为0.088mg/ L)的特性而得以在香料工业中普遍应用。 GDL广泛用于各类花香、 果香、 东方香型、 檀香型日 化香精， 有良好定香作用； 也可用于食品、 烟用、 饲料、 酒用香精中。 0004 很多香料公司将兴趣投向了这一潜在市场并开始进行研发， 使得GDL的生产有了 快速发展， 天然GDL的售价也由20000美元/kg降至1000美元/kg(2014年)。 但目前市场上销 售的GDL仍主要是由化学合成的无旋光活性的外消旋混合物， 如日本SODA公司以及国内一 些香料公司均有化学合成的GDL出售。 化学法合成GDL主要由辛醛与丙二酸缩合， 再脱羧和 环化而成。 普通条。
9、件下利用有机合成的GDL是无旋光的外消旋混合物， 而用微生物法生产则 可以得到具有旋光活性和相对较纯的产物， 且可以一次完成由化学合成需要许多步骤的生 产过程， 具有很高的实用价值。 0005 目前， GDL主要利用化学合成法制备， 如:新醛和丙二酸合成法该法由辛醛与丙二 酸缩合， 再脱梭、 环化而得GDL。 由于原料易得， 反应路径短， 产率高， 是工业上常用方法。 还 有糠酸法， 糠酵是一种常见易得原料， 目前己幵发出将糠酵用格氏反应在支链上引入烷基， 再开环为-酮酸， 脱水内酯化而得GDL。 Reformatsky反应合成法一羟基化合物与 -卤代 酯在锌存在下缩合为 -羟基酸酯， 再山酸。
10、催化脱水得GDL。 由于庚醛可由蓖麻油裂解而得， 因此有充足的原料来源， 但有机锌试剂必须在惰性溶剂中反应， 仍不是很广。 醇类与不饱和 酸酯游离基加成反应合成法， 醇在游离基引发剂引发下形成游离基， 其与不饱和羧酸酯进 行加成可生成GDL。 常用游离基引发剂是二叔丁基过氧化物。 a-烯烃法用价廉的辛醇脱水可 以制得辛醇， 辛醇可以一步合成GDL， 合成方法简便， 是一种正在开发的工业合成方法。 由此 可知， 利用化学合成法生产GDL都涉及有机溶剂的应用， 不可避免带来有机溶剂的残留， 产 品安全性方面存在问题。 0006 国内生物发酵法制备GDL研究大都停留在发酵工艺优化及菌株筛选层面， 对。
11、GDL产 生的工业法发酵机理研究甚少， 这是制约生物发酵法生产GDL产量的关键因素。 说明书 1/5 页 3 CN 105505802 A 3 发明内容 0007 为此， 本发明的目的之一是提供一种解脂亚罗酵母YarrowiaLipolyticaC85#。 0008 本发明的又一目的是提供一种利用解脂亚罗酵母生产-癸内酯的方法。 0009 本发明提供的技术方案为： 0010 一种解脂亚罗酵母YarrowiaLipolyticaC85#， 所述解脂亚罗酵母Yarrowia LipolyticaC85#被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏地址： 北 京市朝阳区北辰西路1号院3。
12、号中国科学院微生物研究所， 保藏号为： CGMCCNo.11736， 保藏 时间为： 2015年11月25日。 0011 一种利用所述的解脂亚罗酵母生产-癸内酯的方法， 将所述的解脂亚罗酵母发 酵培养， 产生-癸内酯。 0012 优选的是， 所述的方法中， 所述发酵培养的温度为25-27， 所述发酵培养的时 间为280-288h。 0013 优选的是， 所述的方法中， 在发酵培养中， 于培养开始后的64h、 76h、 92h和102h分 别向发酵培养基中按照质量体积分数补加3-4的葡萄糖和2-7的蓖麻甲醇酸甲酯。 0014 优选的是， 所述的方法中， 在所述发酵培养中， 初始搅拌速度为45-5。
13、0rpm， 当发酵 培养基中的溶氧低于30后， 首先按照0.2vvm、 0.3vvm和0.4vvm的顺序每隔一定时间调整 空气流量， 然后按照0.03MPa、 0.04MPa和0.05MPa的顺序每隔一定时间调整压力， 最后按照 50rpm、 60rpm和70rpm的顺序每隔一定时间调整搅拌速度。 0015 优选的是， 所述的方法中， 所述一定时间为510min。 0016 优选的是， 所述的方法中， 培养过程中， 在产生-癸内酯之后还包括采用超临界 CO2方法萃取-癸内酯。 0017 优选的是， 所述的方法中， 所述超临界CO2方法中采取的温度为30-40， 压力为 10-15MPa， 时间。
14、为1.5-3.0h。 0018 优选的是， 所述的方法中， 所述发酵培养基包含： 葡萄糖30-40g/L， 玉米浆50-60g/ L， 蓖麻甲醇酸甲酯80-100g/L， 吐温-808-10g/L， 硫酸铵10-12g/L， 硫酸镁2.4-3.2g/L， 磷 酸钠1.2-2.8g/L， 磷酸二氢钾0.5-1.8g/L， VB25-10mg/kg和硫酸铁20-30mg/L。 0019 本发明制备的-癸内酯是经紫外、 NTG诱变出解脂亚罗酵母( Yarrowia Lipolytica)生物发酵得到， 以蓖麻甲醇酸甲酯作为前体， 采用间歇补料分批发酵方式进行 发酵， 选择了更适宜液体培养基配方及相应。
15、的发酵控制参数， 提取过程中采用超临界流体 萃取法， 所得-癸内酯浓度不低于84.3， 产量不低于14.38g/L。 0020 本发明提供的上述生产方法， 与现有技术相比， 具有以下优点： 0021 1.本发明为微生物发酵法制备-癸内酯， -癸内酯被呈有浓郁桃香和椰子香， 存在于多种水果和乳制品中， 是国际公认安全的食品添加剂和药品添加剂， 对它的研究开 发具有很好的经济价值和应用潜力。 0022 2.本发明对高产菌株发酵工艺进行了优化， 确定了发酵的工艺参数， 提高了-癸 内酯的产量， -癸内酯浓度不低于84.3， 产量不低于14.38g/L以上， 转化率不低于 48.4g/L， 处于国内领。
16、先水平。 0023 3.本发明采取超临界CO2萃取法， 因此本方法可作为一种绿色、 环保、 无污染、 安全 说明书 2/5 页 4 CN 105505802 A 4 且高效的提取方法有效提高了-癸内酯的得率， -癸内酯萃率不低于67.8。 附图说明 0024 图1为本发明中利用解脂亚罗酵母生产-癸内酯的方法的流程图。 具体实施方式 0025 下面结合附图对本发明做进一步的详细说明， 以令本领域技术人员参照说明书文 字能够据以实施。 0026 本发明提供一种解脂亚罗酵母YarrowiaLipolyticaC85#， 所述解脂亚罗酵母 YarrowiaLipolyticaC85#被保藏在中国微生物。
17、菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保 藏号为： CGMCCNo.11736， 保藏时间为： 2015年11月25日。 0027 如图1所示， 本发明还提供一种所述的解脂亚罗酵母生产-癸内酯的方法， 将所 述的解脂亚罗酵母发酵培养， 产生-癸内酯。 0028 在上述方法中， 作为优选， 所述发酵培养的温度为25-27， 所述发酵培养的时 间为280-288h。 0029 在上述方法中， 作为优选， 在发酵培养中， 于培养开始后的64h、 76h、 92h和102h分 别向发酵培养基中按照质量体积分数补加3-4的葡萄糖和2-7的蓖麻甲醇酸甲酯。 0030 在上述方法中， 作为优选， 在所述发酵培。
18、养中， 初始搅拌速度为45-50rpm， 当发酵 培养基中的溶氧低于30后， 首先按照0.2vvm、 0.3vvm和0.4vvm的顺序每隔一定时间调整 空气流量， 然后按照0.03MPa、 0.04MPa和0.05MPa的顺序每隔一定时间调整压力， 最后按照 50rpm、 60rpm和70rpm的顺序每隔一定时间调整搅拌速度。 0031 在上述方案中， 作为优选， 所述一定时间为510min。 0032 在本发明的其中一个实施例中， 作为优选， 培养过程中， 在产生-癸内酯之后还 包括采用超临界CO2方法萃取-癸内酯。 0033 在上述方案中， 作为优选， 所述超临界CO2方法中采取的温度为3。
19、0-40， 压力为 10-15MPa， 时间为1.5-3.0h。 0034 在上述方案中， 作为优选， 所述发酵培养基包含： 葡萄糖30-40g/L， 玉米浆50-60g/ L， 蓖麻甲醇酸甲酯80-100g/L， 吐温-808-10g/L， 硫酸铵10-12g/L， 硫酸镁2.4-3.2g/L， 磷 酸钠1.2-2.8g/L， 磷酸二氢钾0.5-1.8g/L， VB25-10mg/kg和硫酸铁20-30mg/L。 0035 实施例1 0036 本发明的方法， 包括下列步骤： 0037 1 .发酵菌株 ： 采用亚硝基胍( NTG )诱变筛选的解脂亚罗酵母( Yarrowia Lipolytic。
20、a)C85#。 0038 亚硝基胍(NTG)诱变： 将培养基对数生长期的种子培养基离心(6000r/min5min)， 以每次20mL磷酸缓冲液洗涤， 离心2次， 合并， 吸取20ml菌悬浮液到一个黑袋子包住的带玻 璃珠的小三角瓶中， 点加入0.6mlNTG(配制方法： 加入2.5mgNTG， 蒸馏水定容至10ml， 终浓 度为0.25mg/ml)。 挑选生长较好的菌落经过摇瓶发酵实验， 经用NTG处理反复筛选得到 C85#， 经发酵后内酯产量可达到8.7g/L以上。 0039 2.培养基： 说明书 3/5 页 5 CN 105505802 A 5 0040 (1)斜面培养基： 麦芽汁斜面(配。
21、方： 麦芽膏粉90-120g/L， 酵母粉5-10g/L， 琼脂 15g/L， NaCl5g/L)， pH值5.56.5， 120灭菌15min， 25-28培养48-72h。 0041 (2)种子培养基： 葡萄糖15-18g/L， 酵母膏2.5-7.5g/L， 蛋白胨3.5-7.5g/L， 硫酸镁 2.4-5g/L， 磷酸二氢钾0.1-0.5g/L， 磷酸钠1.2-4.8g/L， 蓖麻甲醇酸甲酯7.5-8.5g/L， pH5.5 6.5， 121灭菌15min。 0042 (3)发酵培养基： 葡萄糖30-40g/L， 玉米浆50-60g/L， 蓖麻甲醇酸甲酯80-100g/L， 吐温-808。
22、-10g/L， 硫酸铵10-12g/L， 硫酸镁2.4-3.2g/L， 磷酸钠1.2-2.8g/L， 磷酸二氢钾 0.5-1.8g/L， VB25-10mg/kg， 硫酸铁20-30mg/L， 100-115灭菌15-20min。 0043 3.摇瓶发酵培养： 0044 将斜面培养基上保存的菌株接种到种子培养基中， 制备得到一级种子， 取发酵液 的一级种子利用种子培养基培养得到二级培养菌株： 菌种用500mL三角瓶， 装液量100- 200mL、 接种量10-15、 摇床22-25、 170-175r/min培养45-48h、 起始pH5.5-6.5。 0045 发酵培养方法： 50L发酵罐内。
23、发酵培养： 将二级培养菌株按照2-4的接种量转接 入50L的发酵罐内(内装30L经灭菌的发酵培养基)， 采用分批补料方式， 分别在64h、 76h、 92h、 102h， 补加3-4的葡萄糖和2-7的蓖麻甲醇酸甲酯。 调整发酵温度25-27培养， 发 酵时间到280-288h； 0046 发酵罐内控制方法： 初始搅拌转速为45-50rpm， 以便打散空气， 搅均匀发酵料液。 当溶氧低于30， 每次间隔5-10min， 依次调节空气流量、 罐压和搅拌速度： 先提高空气流量 0.2vvm0.3vvm0.4vvm， 再提高罐压0.03MPa0.04MPa0.05MPa， 再提高搅拌速度 50rpm6。
24、0rpm70rpm， 可使空气充分打散， 与料液混合均匀， 又不至于空气浪费， 同时又最 大限度降低掠拌的剪切作用。 其中， vvm:airvolume/culturevolume/min(通气比)， 是每 分钟通气量与罐体实际料液体积的比值。 0047 前体蓖麻甲醇酸甲酯： 摇瓶中以0.9的质量体积比添加在基础配方中， 50L发酵 罐在发酵过程中流加， 蓖麻甲醇酸甲酯残留控制在0.2。 0048 提取： 采取超临界CO2萃取， 确定GDL提取的工艺条件范围： 温度为30-40， 压力为 10-15MPa， 时间为1.5-3.0h， -癸内酯浓度为84.32.0， 产量为14.382.0g/L。
25、， 萃取率 为86.2， 转化率为48.42.0。 0049 转化率()1-蓖麻甲醇酸甲酯起始添加量/发酵液中蓖麻甲醇酸甲酯量 0050 实施例2 0051 取一级种子用500mL三角瓶， 装种子培养基液量150-200mL、 接种量10-15、 摇 床25、 175r/min培养48h、 起始pH6.0， 获得二级种子。 0052 接种50L发酵罐内大体积发酵培养： 将二级种子按照2的接种量转接入50L的发 酵罐内(内装30L经灭菌的发酵培养基)， 采用5蓖麻甲醇酸甲酯分别在64h， 76h， 92h， 102h 分批补料， 添加与发酵培养基质量体积比为3的葡萄糖和2的蓖麻甲醇酸甲酯。 调整。
26、发 酵温度27培养， 发酵时间288h， 测得-癸内酯浓度87.53， 产量为14.52g/L， 转化率为 49.34。 0053 其中， 种子培养基包含： 葡萄糖15g/L， 酵母膏2.5g/L， 蛋白胨3.5g/L， 硫酸镁2.4g/ L， 磷酸二氢钾0.1g/L， 磷酸钠1.2g/L， 蓖麻甲醇酸甲酯7.5g/L， pH5.5， 121灭菌15min。 0054 发酵培养基： 葡萄糖30g/L， 玉米浆50-g/L， 蓖麻甲醇酸甲酯80g/L， 吐温-808g/L， 说明书 4/5 页 6 CN 105505802 A 6 硫酸铵10g/L， 硫酸镁2.4g/L， 磷酸钠1.2g/L， 。
27、磷酸二氢钾0.5g/L， VB25mg/kg， 硫酸铁20mg/ L， 100-115灭菌15-20min。 0055 实施例3 0056 取一级种子用500mL三角瓶， 装种子培养基液量150-200mL、 接种量10-15、 摇 床25、 175r/min培养48h、 起始pH6.0， 获得二级种子。 0057 接种50L发酵罐内大体积发酵培养： 将二级种子按照2的接种量转接入50L的发 酵罐内(内装30L经灭菌的发酵培养基)， 采用5蓖麻甲醇酸甲酯分别在64h， 76h， 92h， 102h 分批补料， 添加与发酵培养基质量体积比为4的葡萄糖和7的蓖麻甲醇酸甲酯。 调整发 酵温度27培养。
28、， 发酵时间288h， 测得-癸内酯浓度85.1， 产量为14.9g/L， 转化率为 49.2。 其中， 种子培养基包含： 葡萄糖18g/L， 酵母膏7.5g/L， 蛋白胨7.5g/L， 硫酸镁5g/L， 磷酸二氢钾0.5g/L， 磷酸钠4.8g/L， 蓖麻甲醇酸甲酯8.5g/L， pH6.5， 121灭菌15min。 0058 发酵培养基： 葡萄糖40g/L， 玉米浆60g/L， 蓖麻甲醇酸甲酯100g/L， 吐温-8010g/ L， 硫酸铵12g/L， 硫酸镁3.2g/L， 磷酸钠2.8g/L， 磷酸二氢钾0.5-1.8g/L， VB210mg/kg， 硫 酸铁30mg/L， 100-115灭菌15-20min。 0059 尽管本发明的实施方案已公开如上， 但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列 运用， 它完全可以被适用于各种适合本发明的领域， 对于熟悉本领域的人员而言， 可容易 地实现另外的修改， 因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下， 本发明并不 限于特定的细节和这里示出与描述的图例。 说明书 5/5 页 7 CN 105505802 A 7 图1 说明书附图 1/1 页 8 CN 105505802 A 8 。