技术领域
本发明涉及一种检测猪2型圆环病毒的试剂盒及其用途，特别涉及一种基于RPA反 应的用于快速检测猪2型圆环病毒的实时荧光RPA试剂盒以及试纸条RPA试剂盒，还涉及二 者在快速检测猪2型圆环病毒中的用途，本发明属于预防兽医学检验领域。
背景技术
自PCR技术诞生以来已经有三十年了。从经典PCR、实时定量PCR再到现在的数字 PCR，这一技术在不断蜕变却从未淡出我们的视野。但是该技术需要特殊昂贵的热循环仪器 以及熟练的操作人员，费时费力，难以用在现场诊断以及实验条件差的地方。在发展中国家 实验室中，由于PCR实施所需要的基础设备和技术所限，大多数发展中国家仍然集中在使用 传统的试验方法，比如血清学方法、显微镜技术，或者培养以及鉴定传染性以及非传染性疾 病。为了填补传统方法和PCR之间的空缺，新的等温分子诊断技术正在开发，该方法尤其适 用于基础设施、实验设备以及试验技术难于支持使用PCR进行诊断的地方。
与常规方法相比较，等温扩增实验具有很高的敏感性和特异性，这些原因促使不 同的公司商业化不同的等温扩增技术，比如，环介导的扩增(LAMP；Eiken,日本)，RPA(RPA； Alere,USAandTwistDx,UK)，链置换扩增(stranddisplacementamplification,Becton Dickson,USA)。在这些技术中，LAMP是使用最为广泛，且最成熟的试验方法。与RPA方法相比 较，LAMP技术具有试验设计比较麻烦(3对引物)，特异性相对较弱(能扩增很多条带)，时间 仍然相对较长，以及易于污染等不足的地方。
英国TwistDxInc公司开发的重组酶聚合酶扩增(RecombinasePolymeraseAmplification，RPA)被称为是可以替代PCR的核酸检测技术。以此为基础的核酸扩增产品能够在15分钟内，37℃-42℃之间进行核酸检测。现在使用最多的、最为成熟的为进行实时监控的体系(如exo试剂盒，real-timeRPA)以及基于试纸条的终点检测(nfo试剂盒，RecombinasePolymeraseAmplificationAssaycombinedwithlateralflowtest，LFSRPA)。
实时荧光RPA(real-timeRPA)试验需要能激发并检测荧光基团的恒温仪器，比如 酶标仪或实时检测的热循环仪。自开发以来，该技术已经被广泛的应用到人类疾病、兽医药 物、食品工业以及农业中，比如用于土拉弗朗西斯菌、细螺旋体、HIV-1DNA、鼠疫杆菌、炭疽 杆菌、天花病毒、B型链球菌、大肠杆菌产生的志贺毒素、中东呼吸综合征冠状病毒、裂谷热 病毒、口蹄疫病毒、牛冠状病毒、埃博拉病毒、苏丹病毒、马尔堡病毒、施马伦贝格病毒、牛病 毒性腹泻病毒、黄热病毒以及戈登病毒等病原的检测。
对于试纸条RPA(LFSRPA)试验而言，只要温度能控制在37-42℃之间就行，比如可 以在水浴锅等设置中进行反应，或者直接用人的体温进行加热，随后可以通过侧流层析试 纸条LFS(Hybridetect2T，MileniaBiotecGmbH,Germany)读取试验结果。自开发以来，该 技术已经被广泛的应用到人类疾病、兽医药物、食品工业以及农业中，比如用于感染性皮下 及造血组织坏死病毒(IHHNV)、恶性疟原虫、洋李痘疱病毒、羌虫、力克次体、隐孢子虫以及 黄热病毒等的检测。与常规方法相比较，该实验具有很高的敏感性和特异性。
猪圆环病毒(Porcinecircovirus，PCV)属于圆环病毒科，圆环病毒属的成员，PCV 是小的、无囊膜的DNA病毒，直径大约为17纳米。根据DNA序列、抗原性以及致病性可将其分 为两个不同的基因型—PCV1和PCV2。PCV1被认为不具有致病性，并且在猪肾细胞系(PK-15) 中持续感染。可是，PCV2断奶仔猪多系统衰竭综合症(PMWS)的主要病原，表现为免疫系统损 失，淋巴细胞减少、淋巴结肿大等病变，同时引发其他病原的继发感染，目前已成为严重阻 碍养猪业发展的主要病原之一。进一步来说，PCV2是一种免疫抑制病毒，感染该病毒的猪更 容易被其他病毒或者细菌感染。调查显示，PCV2在猪体内广泛存在。因此，建立一种快速、简 单、特异、敏感的检测方法来检测PCV2对于该病的防控起着关键的作用。
Zhou等(Zhou,S.,etal.,Loop-mediatedisothermalamplificationfor detectionofporcinecircovirustype2.VirolJ,2011.8:p.497.)公开了一种检测猪 2型圆环病毒的环介导等温扩增法。通过LAMP的扩增结果表明，该方法能够出现很多扩增条 带，因此该方法存在非特异性扩增，而且该方法需要设计三对引物来进行扩增，因此增加了 实验设计的难度，并且增加了其与其他检测平台相结合的难度。并且检测温度较高(63℃)， 检测时间较长(60min)。并且需要核酸电泳对扩增产物进行检测，增加了污染的可能性。
Yang等(Yang,Z.Z.,etal.,DetectionofPCV2DNAbySYBRGreenI-based quantitativePCR.JZhejiangUnivSciB,2007.8(3):p.162-9.)公开了一种基于SYBR greenI的用于检测PCV2DNA的实时荧光定量PCR法。该方法需要复杂的试验设备以及熟练 的操作人员，该方法需要较长的试验时间(大约1.5h)。由于SYBRGreenI非特异性结合所 有的双链DNA，因此，该方法的特异性相对较差。
本发明针对猪2型圆环病毒的ORF2基因，建立并评估了基于荧光探针的RPA(real- timeRPA)检测试剂盒以及基于试纸条的LFSRPA检测试剂盒以实现快速检测猪2型圆环病 毒的目的，据我们所知，国内外尚无建立这样的试剂盒用于检测猪2型圆环病毒。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种能快速、简单、特异的鉴定猪2型圆环病毒 的检测方法及试剂盒。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
本发明发明人针对猪2型圆环病毒的ORF2基因设计引物和探针。同时通过对来自 于GenBank中的KR559725.1、KR559695.1、KM455975.1、KP768481.1、JN181905.1、 JN181902.1、KF850461.1、KC620515.1、KF035059.1、KF951567.1、KF951570.1、KM624031.1 和JQ002672.1的ORF2基因同源序列进行比对分析，进一步确定了猪2型圆环病毒ORF2基因 的保守区域，针对该区域设计引物和探针，以期能够检测到尽可能多的猪2型圆环病毒。所 有的引物和探针都由生工生物(上海，中国)合成。本发明分别设计合成了三对上游引物和 三对下游引物，通过对引物与探针组合进行扩增效果评价，最终将其中一对能够产生最强 的扩增信号的引物对与探针组合应用到本发明中。针对实时荧光RPA(real-timeRPA)与试 纸条RPA(LFSRPA，RecombinasePolymeraseAmplificationAssaycombinedwith lateralflowtest)的不同检测特点，本发明分别设计了用于猪2型圆环病毒检测的实时 荧光RPA以及试纸条RPA检测的引物和探针序列，该两种试剂盒针对同一靶标序列，但引物 和探针的修饰碱基和检测平台不同。
本发明一种用于快速检测猪2型圆环病毒的实时荧光RPA(real-timeRPA)检测试 剂盒，包括有一对引物和一条探针，
其中，所述的一对引物和一条探针的序列如下所示：
上游引物：5’-AAACCTGTCCTAGATTCCACTATTGATTACTTCCA-3’(SEQIDNO.1所示)
下游引物：5’-TTGTATTCCTGGTCGTATATACTGTTTTCGAACGC-3’(SEQIDNO.2所示)
探针：5’-ATTACTTCCAACCAAACAACAAAAGAAATCAGCTG
-FAM-dT-G-THF-C-BHQ1-dT-GAGACTACAAACTGC-P-3’(SEQIDNO.3所示)
其中，FAM-dT表示携带有荧光素基团的胸腺嘧啶核苷酸，THF表示四氢呋喃连接 子，BHQ1-dT表示携带有荧光淬灭基团BHQ1的胸腺嘧啶核苷酸，P表示磷酸，用于阻止链的延 伸。
在本发明所述的实时荧光RPA检测试剂盒中，优选的，所述试剂盒中还包括水解缓 冲液，醋酸镁以及ddH2O。
使用本发明所述的实时荧光RPA检测试剂盒检测猪2型圆环病毒，优选的，反应体 系如下：14.75μL的水解缓冲液，1.05μL的10μM上游引物，1.05μL的10μM下游引物，0.075μL 的10μM探针，2μL的病毒DNA模板，4.825μL的ddH2O以及1.25μL的280mM醋酸镁；
扩增反应在温度设定为37-39℃的实时荧光定量PCR仪中进行，反应时间为20min- 1h，结束后通过Mx3005P软件对结果进行分析。
更优选的，扩增反应在温度设定为37℃的实时荧光定量PCR仪中进行，反应时间为 20min，结束后通过Mx3005P软件对结果进行分析。
对本发明的实时荧光RPA(real-timeRPA)试剂盒的检测灵敏度及特异性进行了 实验，灵敏度试验结果表明使用该试剂盒检测猪2型圆环病毒的敏感性为102拷贝/反应，并 且具有较广的检测范围，至少在106-102拷贝/反应范围内的样品均能被检测出来。特异性检 测结果表明，使用该试剂盒分别检测猪2型圆环病毒、猪繁殖与呼吸综合症病毒、猪瘟病毒、 猪伪狂犬病毒、猪细小病毒以及口蹄疫病毒，结果只有猪2型圆环病毒能够很好的进行扩 增，其他病毒均不能扩增，因此，说明该试剂盒具有很好的特异性。我们用建立的real-time RPA方法来检测采集自山东省的临床样品(n＝45)、甘肃省的临床样品(n＝17)、健康猪的血 清样品(n＝12)以及PCV1阳性的样品(n＝8)，并将检测结果与qPCR的检测结果相比较，结果 表明real-timeRPA的检测结果与qPCR完全一致，即具有100％的符合度。
因此，进一步的，本发明还提出了以上所述的实时荧光RPA检测试剂盒在制备检测 猪2型圆环病毒试剂中的用途。
本发明还提出了一种用于快速检测猪2型圆环病毒的试纸条RPA(LFSRPA)检测 试剂盒，含有侧流层析试纸条(Hybridetect2T，MileniaBiotecGmbH,Germany)，以及有 一对引物和一条探针，
其中，所述的一对引物和一条探针的序列如下所示：
上游引物：5’-AAACCTGTCCTAGATTCCACTATTGATTACTTCCA-3’(SEQIDNO.1所示)
下游引物：5’-biotin-TTGTATTCCTGGTCGTATATACTGTTTTCGAACGC-3’(SEQIDNO.2 所示)
探针：5’-FAM-TACTTCCAACCAAACAACAAAAGAAATCAGCTGTG
-THF-CTGAGACTACAAACT-P-3’(SEQIDNO.4所示)。
其中，biotin表示生物素，FAM表示羧基荧光素，THF表示四氢呋喃连接子，P表示磷 酸，用于阻止链的延伸。
在本发明所述的试纸条RPA检测试剂盒中，优选的，所述试剂盒中还包括水解缓冲 液，醋酸镁以及ddH2O。
使用本发明所述的试纸条RPA检测试剂盒检测猪2型圆环病毒，优选的，反应体系 如下：14.75μL的水解缓冲液，1.05μL的10μM上游引物，1.05μL的10μM下游引物，0.075μL的 10μM探针，2μL的病毒DNA模板，4.825μL的ddH2O以及1.25μL的280mM醋酸镁；
扩增反应在温度设定为35-45℃的水浴锅中进行，反应时间为15min-30min，结束 后使用侧流层析试纸条(Hybridetect2T，MileniaBiotecGmbH,Germany)对结果进行检 测。
更优选的，扩增反应在温度设定为37℃的水浴锅中进行，反应时间为20min，结束 后使用侧流层析试纸条对结果进行检测。
对本发明的试纸条RPA(LFSRPA)试剂盒的检测灵敏度及特异性进行了实验，灵敏 度试验结果表明使用该试剂盒检测猪2型圆环病毒的敏感性为102拷贝/反应，并且具有较 广的检测范围，至少在106-102拷贝/反应范围内的样品均能被检测出来。特异性检测结果表 明，使用该试剂盒分别检测猪2型圆环病毒、猪繁殖与呼吸综合症病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬 病毒、猪细小病毒以及口蹄疫病毒，结果只有猪2型圆环病毒能够很好的进行扩增，其他病 毒均不能扩增，因此，说明该试剂盒具有很好的特异性。我们用建立的LFSRPA方法来检测 采集自山东省的临床样品(n＝45)、甘肃省的临床样品(n＝17)、健康猪的血清样品(n＝12) 以及PCV1阳性的样品(n＝8)，并将检测结果与qPCR的检测结果相比较，结果表明real-time RPA的检测结果与qPCR完全一致，即具有100％的符合度。
因此，进一步的，本发明还提出了所述的试纸条RPA检测试剂盒在制备检测猪2型 圆环病毒试剂中的用途。
相较于现有技术，本发明的方法具有以下优点：
(1)能够节约试验时间：RPA整个试验过程只需要25min，该时间远远低于qPCR方法 的1.5小时以及LAMP的60min。加上样品处理以及准备试验的时间，RPA整个检测过程能够在 一个小时之内完成。
(2)能够降低反应温度：RPA只需要恒温37℃即可完成试验，该温度远远低于qPCR 方法的60℃-95℃以及LAMP的63℃。
(3)方法更加简单、便于携带：扩增所需的酶和一些其他必要的东西已经冻干保 存，能够在常温下长时间放置，扩增时只需要加入水解缓冲液、引物、探针和模板，并加入镁 离子起始反应即可，LFSRPA方法只需要一个水浴锅即可完成试验，不需要熟练的试验人 员。
(4)特异性强：本发明试剂盒中添加了探针，增加了检测的特异性，基于荧光试剂 的LAMP方法因为没有探针，特异性相对较差。
(5)更加不易于污染：本发明试剂盒中添加了核酸外切酶III，对扩增产物进行切 割，因此降低了产物污染的可能性，qPCR方法没有添加切割产物的酶，LAMP需要跑核酸电泳 胶，因此，均有污染的可能性。
(6)检测结果真实可靠：与现有的qPCR方法的符合度为100％。
附图说明
图1A为将合成的针对PCV2引物和探针的标准品质粒进行十倍倍比稀释，稀释范围 为106-101拷贝/反应，随后用Real-timeRPA方法进行敏感性检测，如图所示为扩增20min后 实时荧光定量PCR仪的结果。此图可看出本发明所设计的引物和探针可以在37℃条件下，很 好的检测106-102拷贝/反应的模板。其中NC代表阴性对照。
图1B为利用PRISM5.0软件(GraphPadSoftware,USA)对Real-timeRPA方法的可 重复性进行验证。阈值为平均值±标准方差(SD)。该试验进行过4次重复性试验。
图1C为对Real-timeRPA方法的4次重复性结果进行退行性分析。我们用三角符号 标出95％可能性的检测限制。
图2(A)为检测LFSRPA方法的敏感性，我们将合成的标准品质粒进行定量，并以十 倍倍比稀释的方式稀释出浓度为106-101拷贝/反应的质粒DNA作为模板进行试验，试验条件 为上述的最佳试验条件(37℃,20min)，试验结果如图所示，NC代表阴性对照；(B)为检测LFS RPA方法的特异性，我们分别用猪繁殖与呼吸综合症病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪细小 病毒、口蹄疫病毒提取的DNA/RNA作为模板进行试验，试验结果如图所示，NC代表阴性对照。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人 员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进 行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1快速检测猪2型圆环病毒的实时荧光RPA(Real-timeRPA)检测试剂盒及 检测方法的建立
1、引物及探针序列的设计及制备
本发明发明人通过对来自于GenBank中的KR559725.1、KR559695.1、KM455975.1、 KP768481.1、JN181905.1、JN181902.1、KF850461.1、KC620515.1、KF035059.1、KF951567.1、 KF951570.1、KM624031.1和JQ002672.1的ORF2基因同源序列进行比对分析，确定了猪2型圆 环病毒ORF2基因的保守区域，针对该区域设计了引物和探针，以期能够检测到尽可能多的 猪2型圆环病毒。所有的引物和探针都由生工生物(上海，中国)合成。本发明分别设计合成 了三对上游引物、三对下游引物以及一条探针序列，如下表1所示。
表1、本发明设计的猪2型圆环病毒Real-timeRPA引物和探针
2.毒株、细胞以及临床样品
本研究中使用的所有的毒株均由本实验室保存：PCV2NX毒株,HP-PRRSV(SD0907) 毒株,C-PRRSV(CH-1R)毒株,CSF(C-strain)毒株,PRV(Fa)毒株,PPV(AV30)毒株；(FMDV)/O/ CHA毒株。我们分别收集来自山东省的45份临床样品、来自于甘肃省的17份临床样品、8份 PCV1阳性样品以及12份健康猪的血清进行试验。PK-15细胞由本实验室保存，用含有10％血 清的MEM在37℃,5％CO2的条件下培养。
3.病毒基因组提取
使用高纯度的病毒核酸提取方法(Roche)按照说明书来来提取病毒DNA/RNA，并最 终用50μL的无RNase水洗脱。提取的DNA/RNA存放到-80℃冰箱中以待随后的使用。
4.产生质粒DNA标准品
金维智合成猪2型圆环病毒ORF2基因片段(320bp)，并克隆到pUC57载体，命名为 pPCV2/RPA。用质粒提取方法(Promega,USA)来提取pPCV2/RPA质粒。用Nanovue(GE lifescience)来定量纯化的DNA，并随后进行十倍倍比稀释，并随后储存于-80℃备用。
5、real-timeRPA试验扩增条件优化
以提取纯化的病毒DNA/RNA或者标准DNA质粒为模板进行扩增，实验体系如下： 14.75μL水解缓冲液(rehydrationbuffer，TwistDxexoKit,Cambridge,United Kingdom)，1.05μL上游引物(10μM)，1.05μL下游引物(10μM)，0.075μL的RPAexo探针(10μ M)，2μL的RNA模板，4.825μL的ddH2O以及1.25μL的醋酸镁(magnesiumacetate，280mM)。
其中，所述的一对引物和一条探针的序列如下所示：
上游引物：5’-AAACCTGTCCTAGATTCCACTATTGATTACTTCCA-3’(SEQIDNO.1所示)
下游引物：5’-TTGTATTCCTGGTCGTATATACTGTTTTCGAACGC-3’(SEQIDNO.2所示)
探针：5’-ATTACTTCCAACCAAACAACAAAAGAAATCAGCTG
-FAM-dT-G-THF-C-BHQ1-dT-GAGACTACAAACTGC-P-3’(SEQIDNO.3所示)。
在进行RPA引物的反应温度的确定时，按照上述体系加入反应物。我们分别试验了 37℃、38℃、39℃不同的反应温度，反应时间为20min，结束后通过Mx3005P软件对结果进行 分析。通过对结果分析表明，37℃扩增结果最佳。所以本发明所设计的猪2型圆环病毒real- timeRPA扩增温度设定为37℃。在进行real-timeRPA引物的反应时间的确定时，按照上述 体系加入反应物。并将温度设定为37℃时，试验反应不同时间扩增差异。我们将时间分别设 定为20min、30min和1h，结果表明，扩增20min之后的阴性在一个小时之后仍然为阴性， 20min之后的阳性在一个小时之后仍然为阳性，因此，我们选择20min为本发明的扩增设定 时间。
同时本发明分别用该体系对合成的三对上游引物和三对下游引物与探针的组合 进行评价，评价结果表明其中一对引物(Fe3/Re1)与探针的组合能够产生最强的扩增信号， 因此，该引物对与探针进行组合应用到本发明中。
real-timeRPA试验检测结果判定：一个样品所有的重复试验，在特定的时间内 (20min)扩增结果均大于背景值3.5个标准方差(3.5SD)的为阳性，反之，该样品为阴性。
6、real-timeRPA试验灵敏度和特异性检测
在进行real-timeRPA方法反应灵敏度检测时，按照上述体系加入反应物。使用模 板为上述合成的标准质粒，通过核酸测定仪测定浓度计算出拷贝数，分别稀释出浓度梯度 为106-101个拷贝/反应的共计6个梯度作为模板。扩增反应在温度设定为37℃的qPCR仪中进 行，时间设定为20min，通过实时荧光实时监控扩增结果。结果如图1A所示，从该结果可以看 出该方法的敏感性为102拷贝/反应，并且具有较广的检测范围，至少在106-102拷贝/反应范 围内的样品均能被检测出来。
在real-timeRPA敏感性试验中，我们对于同一个试验进行了4次重复，结果表明4 次试验的检测结果一致，均能够很好的检测最低102个拷贝/反应的标准DNA，本发明利用 PRISM5.0软件(GraphPadSoftware,USA)对试验的可重复性进行统计分析，结果如图1B所 示，表明该发明具有很好的可重复性。阈值为平均值±标准方差(SD)。同时，本发明利用 Excel软件对real-timeRPA试验的四次重复性结果进行退行性分析，结果如图1C所示，说 明该方法能够很好的检测猪2型圆环病毒。
在进行real-timeRPA方法的反应特异性的检测时，按照上述体系加入反应物。其 中使用模板分别为猪2型圆环病毒(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合症病毒(HP-PRRSV)、猪瘟病 毒(CSFV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)、
口蹄疫病毒(FMDV)。扩增反应在温度设定为37℃的qPCR仪中进行，反应时间设定 为20min。结果表明，只有PCV2能够很好的进行扩增，其他病毒均不能扩增，因此，该方法具 有很好的特异性，结果如表2所示。
qPCR方法参照文献(Yang,Z.Z.,etal.,DetectionofPCV2DNAbySYBRGreen I-basedquantitativePCR.JZhejiangUnivSciB,2007.8(3):p.162-9.)方法进行。
表2评估PCV2real-timePRA方法的特异性
neg:代表阴性
7、real-timeRPA试验检测临床样品
我们用建立的real-timeRPA方法来检测采集自山东省的临床样品(n＝45)、甘肃 省的临床样品(n＝17)以及健康猪的血清样品(n＝12)，并将检测结果与qPCR的检测结果相 比较。结果表明12份健康猪的血清样品real-timeRPA检测结果和qPCR检测结果一致，均都 为阴性。在62份临床样品中，real-timeRPA检测结果为31份阳性样品(时间为：6.6min- 8.6min)，这与qPCR检测结果完全一致(CT值为18-30)。我们同样用real-timeRPA检测了 PCV1阳性的样品(n＝8)，结果表明，PCV2real-timeRPA检测结果均为阴性，因此，该方法具 有很好的特异性。基于检测的82份样品，与qPCR检测结果相比较，real-timeRPA的敏感性 和特异性均为100％，结果如表3所示。
qPCR方法参照文献(Yang,Z.Z.,etal.,DetectionofPCV2DNAbySYBRGreen I-basedquantitativePCR.JZhejiangUnivSciB,2007.8(3):p.162-9.)方法进行。
表3比较real-timePRA方法和qPCR方法的临床样品检测结果
综上可见，本发明设计合成的一对引物和一条探针基因序列以及其形成的实时荧 光PRA(real-timeRPA)方法可以快速诊断猪2型圆环病毒，而且该检测方法简单、快速、检 测结果真实可靠。
实施例2快速检测猪2型圆环病毒的试纸条RPA(LFSRPA)检测试剂盒及检测方法 的建立
1、引物及探针序列的设计及制备
本发明发明人通过对来自于GenBank中的KR559725.1、KR559695.1、KM455975.1、 KP768481.1、JN181905.1、JN181902.1、KF850461.1、KC620515.1、KF035059.1、KF951567.1、 KF951570.1、KM624031.1和JQ002672.1的ORF2基因同源序列进行比对分析，确定了猪2型圆 环病毒ORF2基因的保守区域，针对该区域设计了引物和探针，以期能够检测到尽可能多的 猪2型圆环病毒。所有的引物和探针都由生工生物(上海，中国)合成。本发明分别设计合成 了三对上游引物、三对下游引物以及一条探针序列，如下表4所示。
表4、本发明设计的LFSRPA引物和探针
2.毒株、细胞以及临床样品
本研究中使用的所有的毒株均由本实验室保存：PCV2NX毒株,HP-PRRSV(SD0907) 毒株,C-PRRSV(CH-1R)毒株,CSF(C-strain)毒株,PRV(Fa)毒株,PPV(AV30)毒株；(FMDV)/O/ CHA毒株。我们分别收集来自山东省的45份临床样品、来自于甘肃省的17份临床样品、8份 PCV1阳性样品以及12份健康猪的血清进行试验。PK-15细胞由本实验室保存，用含有10％血 清的MEM在37℃,5％CO2的条件下培养。
3.病毒基因组提取
使用高纯度的病毒核酸提取方法(Roche)按照说明书来来提取病毒DNA/RNA，并最 终用50μL的无RNase水洗脱。提取的DNA/RNA存放到-80℃冰箱中以待随后的使用。
4.产生质粒DNA标准品
金维智合成猪2型圆环病毒ORF2基因片段(320bp)，并克隆到pUC57载体，命名为 pPCV2/RPA。用质粒提取方法(Promega,USA)来提取pPCV2/RPA质粒。用Nanovue(GE lifescience)来定量纯化的DNA，并随后进行十倍倍比稀释，并随后储存于-80℃备用。
5.LFSRPA方法扩增条件优化
我们以提取纯化的病毒DNA/RNA或者标准DNA质粒为模板进行扩增，实验体系如 下：14.75μL水解缓冲液(rehydrationbuffer，TwistDxexoKit,Cambridge,United Kingdom)，1.05μL上游引物(10μM)，1.05μL下游引物(10μM)，0.075μL的RPAexo探针(10μ M)，2μL的DNA/RNA模板，4.825μL的ddH2O以及1.25μL的醋酸镁(magnesiumacetate， 280mM)。
其中，所述的一对引物和一条探针的序列如下所示：
上游引物：5’-AAACCTGTCCTAGATTCCACTATTGATTACTTCCA-3’(SEQIDNO.1所示)
下游引物：5’-biotin-TTGTATTCCTGGTCGTATATACTGTTTTCGAACGC-3’(SEQIDNO.2 所示)
探针：5’-FAM-TACTTCCAACCAAACAACAAAAGAAATCAGCTGTG
-THF-CTGAGACTACAAACT-P-3’(SEQIDNO.4所示)。
首先，我们确定LFSRPA方法的最佳反应温度，我们分别试验了15℃、20℃、25℃、 30℃、35℃、37℃、40℃、45℃、50℃不同反应温度，并且将孵育时间设定为30min。结果表明 反应温度低于30℃时，在试纸条上没有出现试验条带，在30℃时出现较弱的试验条带，在 35℃-45℃之间试验条带没有可观察的差异，当温度大于50℃时没有出现试验条带，结果表 明该试验的最佳反应温度为35℃-45℃，我们选择37℃作为该方法的反应温度。
随后，我们测试了37℃条件下，不同孵育时间对于扩增结果的影响，我们试验了 0min、1min、5min、10min、15min、20min、25min、30min的试验结果，结果表明在扩增10min的 时候，试验条带上出现微弱的条带，当反应时间在15min-30min之间时试验条带没有出现可 观测的差异，因此，我们选择20min作为该试验的孵育时间。
我们用该体系对设计合成的三对上游引物、三对下游引物与探针组合进行评价， 评价结果表明其中一对(Fn3/Rn1)引物与探针组合能够产生最强的扩增信号，因此，该引物 对与探针进行组合应用到本发明中。
检测结果判定：一个样品在特定的条件下(37℃，20min)试纸条上控制线为阳性， 并且试验线为阳性的样品为阳性样品；试纸条上控制线为阳性，而试验线为阴性的样品为 阴性样品。
6、反应灵敏度检测
在进行LFSRPA方法的灵敏度检测时，按照上述体系加入反应物。使用模板为上述 合成的标准质粒，通过核酸测定仪测定浓度计算出拷贝数，分别稀释出浓度梯度为106-101拷贝/反应的共计6个梯度作为模板。扩增反应在温度设定为37℃的水浴锅中进行，时间设 定为20min，通过试纸条终点检测扩增结果。如图2A所示，从该结果可以看出，该方法的敏感 性为102拷贝/反应。并且具有较广的检测范围，至少在106-102拷贝/反应范围内的样品均能 被检测出来。
在进行LFSRPA方法的特异性的检测时，按照上述体系加入反应物。其中使用模板 分别为猪2型圆环病毒(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合症病毒(HP-PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪 伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)、口蹄疫病毒(FMDV)。反应温度设为37℃的水浴锅中进 行，反应时间设定为20min，结束后使用侧流层析试纸条对结果进行检测。结果表明，只有 PCV2能够很好的进行扩增，其他病毒均不能扩增，因此，该方法具有很好的特异性，结果如 表5所示。
qPCR方法参照文献(Yang,Z.Z.,etal.,DetectionofPCV2DNAbySYBRGreen I-basedquantitativePCR.JZhejiangUnivSciB,2007.8(3):p.162-9.)方法进行。
表5评估LFSRPA方法的特异性
neg:代表阴性；pos:代表阳性。
7、LFSRPA方法检测临床样品
首先，我们用LFSRPA方法测试qPCR确认的7份阳性样品和7份阴性样品，LFSRPA 试验结果表明：qPCR确认的7份阳性样品均为阳性，qPCR确认的7份阴性样品均为阴性。我们 用建立的LFSRPA方法来检测采集自山东省的临床样品(n＝45)、甘肃省的临床样品(n＝ 17)以及健康猪的血清样品(n＝12)，并将检测结果与qPCR的检测结果相比较。结果表明12 份健康猪的血清样品LFSRPA检测结果和qPCR检测结果一致，均都为阴性。在62份临床样品 中，LFSRPA检测结果为31份阳性样品，这与qPCR检测结果完全一致(CT值为18-30)。我们同 样用LFSRPA方法检测了PCV1阳性的样品(n＝8)，结果表明，PCV2LFSRPA检测结果均为阴 性，因此，该方法具有很好的特异性。基于检测的82份样品，与qPCR检测结果相比较，LFS RPA的敏感性和特异性均为100％，结果如表6所示。
qPCR方法参照文献(Yang,Z.Z.,etal.,DetectionofPCV2DNAbySYBRGreen I-basedquantitativePCR.JZhejiangUnivSciB,2007.8(3):p.162-9.)方法进行。
表6比较LFSRPA方法和qPCR方法的临床样品检测结果
综上可见，本发明设计合成的一对引物和一条探针基因序列以及其形成的试纸条 RPA(LFSRPA)方法可以快速诊断猪2型圆环病毒，而且该检测方法简单、快速、检测结果真 实可靠。