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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610096541.8 (22)申请日 2016.02.23 CGMCC No. 11949 2015.12.30 C12N 1/20(2006.01) A01N 63/00(2006.01) A01P 7/02(2006.01) C12R 1/07(2006.01) (71)申请人 云南省微生物发酵工程研究中心有 限公司 地址 650217 云南省昆明市经济技术开发区 昌宏路 49 号 (72)发明人 何月秋 李兴玉 何鹏飞 吴毅歆 何鹏搏 王再强 王强 杨发祥 (74)专利代理机构 昆明合众智信知识产权事务 所 53113 代理。
2、人 康珉 (54) 发明名称 一株防治植物叶螨的解淀粉芽孢杆菌菌株W1 及应用 (57) 摘要 本发明公开一株防治植物叶螨的解淀粉芽孢 杆菌菌株W1及应用。 所述菌株W1保藏号为 ： CGMCC No.11949。所述菌株 W1 是从自然死亡的二斑叶 螨虫体中分离获得。 该菌株W1在培养皿杀螨实验 中致死率达到 92.3。在温室防效实验中对玉米 叶片、 草莓、 番茄、 蚕豆上的叶螨、 以及果园中苹果 树、 梨树上的叶螨， 防治效果均达到 80以上。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书8页 序列表1页 。
3、CN 105543151 A 2016.05.04 CN 105543151 A 1.一株防治植物叶螨的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)菌株W1， 其保 藏号为： CGMCCNo.11949。 2.权利要求1所述的防治植物叶螨的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens) 菌株W1发酵液的制备方法， 包括以下步骤： (1)取出在-80冰箱中保存的权利要求1所述的防治植物叶螨的解淀粉芽孢杆菌 (Bacillusamyloliquefaciens)菌株W1， 划线于LB固体平板上过夜培养活化， 次日挑取单 菌落， 接入装有150mLpH为。
4、8的LB液体培养基的500mL锥形瓶中， 35， 170rpm发酵48h获得 种子液。 (2)按5接种量将种子液转接到盛有300mLpH为8的LB液体培养基的1000mL锥形瓶 中， 在温度35， 170rpm发酵48h得权利要求1所述的防治植物叶螨的解淀粉芽孢杆菌 (Bacillusamyloliquefaciens)菌株W1发酵液。 3.权利要求1所述的防治植物叶螨的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens) 菌株W1在防治植物叶螨的应用。 4.权 利 要 求 2 所 述 的 株 防 治 植 物 叶 螨 的 解 淀 粉 芽 孢 杆 菌 ( B a c i l l 。
5、u s amyloliquefaciens)菌株W1发酵液的制备方法制备得到的权利要求1所述的防治植物叶螨 的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)菌株W1发酵液在防治植物叶螨的应用。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105543151 A 2 一株防治植物叶螨的解淀粉芽孢杆菌菌株W1及应用 技术领域 0001 本发明涉及一株解淀粉芽孢杆菌菌株及在防治植物叶螨的应用。 技术背景 0002 当前农业有害生物防治中， 植食性螨类是世界公认的最难防的有害生物类群之 一， 其主要类别为叶螨， 俗称红蜘蛛， 属于节肢动物门(Arthropoda)， 蛛形纲(Arachni。
6、da)， 蜱螨亚纲(Acari)， 真螨目(Acariformes)， 叶螨总科(Tetranychoidea)。 叶螨是一种世界性 害螨， 因其个体小、 世代短、 发育周期短、 繁殖快、 适应性强、 突变率高， 极易产生抗药性， 防 治极为困难， 造成农作物螨害愈演愈烈的 “小虫成大灾” 局势， 使农业生产遭受极大损失， 影 响到农业增产和农民增收， 成为目前农业生产上一个重要的亟待解决的大问题。 0003 化学防治依然是我国园艺作物生产中治理螨害的主要对策， 但是杀螨剂的滥用和 误用极易导致叶螨抗药性的产生， 极大降低了化学农药的田间防治效果。 2008年统计显示 叶螨对目前药剂中的92中。
7、活性成分产生了抗药性， 包括神经毒素类杀虫剂如有机憐酸酯类 和拟除虫菊酯类， 选择性杀螨剂如线粒体电子传递抑制剂和有机锡类等。 叶螨抗药性情况 比其它田间害虫如小菜蛾、 蚜虫等要严重许多， 因而有科学人员将叶螨视为最耐药的物种。 其中二斑叶螨(TetranychusUrticaeKoch)无论是在温室蔬菜上还是露天的果树上， 其抗 药性要明显高于其它螨类。 如二斑叶螨对阿维菌素、 三氯杀螨醇和克螨特等的抗性倍数是 其他螨类的10倍以上。 二斑叶螨的全基因组DNA研究发现， 其体内的解毒基因是其它动物的 3倍之多， 含有一个抗药性基因家族的39个基因， 而昆虫和脊椎动物只有14个。 因此， 开展。
8、以 生物防治为主要手段的防治策略是实现可持续控制的重要途径。 0004 在害螨的各种防治手段中， 生物防治一直是一个研究的重点和热点， 在害螨防治 策略中扮演重要角色。 目前在害螨天敌、 植物源农药和叶螨病原菌等方面的生防研究均取 得了一些进展和成果。 叶螨的天敌种类繁多， 植绥螨和食螨瓢虫是研究和应用较多的两种， 尤其是植绥螨在许多国家已工厂化大规模生产。 荷兰有60的温室用智利小植绥螨防治黄 瓜上的二斑叶螨， 而英国、 芬兰、 瑞典和丹麦已超过70。 福建省农业科学院植物保护所初 步建立了我国第一个捕食螨大量繁殖基地， 在全国推广应用面积达13.3万公顷。 但天敌利 用因存在不易建立优势种。
9、群、 维持天敌种群的费用昂贵， 不能和化学防治一起综合防治等 缺点而在其应用和发展上受到限制。 植物性农药有效成分安全、 低毒， 大多是一类具有杀螨 活性的植物次生代谢物质， 已经报道进行过杀螨活性测定的植物接近200余种， 但由于活性 低活性成分不明确， 具有开发利用价值的寥寥无几。 0005 节肢动物体内广泛分布着各种胞质遗传的细胞内共生菌， 分为初生共生菌 (primarysymbiont)和次生共生菌(secondarysymbiont)。 初生共生菌是宿主生存必需 的， 与寄主协同进化， 广泛分布于寄主的组织细胞内， 主要通过母系垂直传播， 同时还能进 行水平传播。 次生共生菌不是寄。
10、主存活所必需的， 对寄主可能有益也可能有害， 有害者可称 为叶螨病原菌。 叶螨病原菌与叶螨之间经过漫长的进化过程， 在它们之间形成了相互依存 和制约的关系。 如何利用该病原菌及其生物活性物质， 已成为近年来发达国家许多实验室 说明书 1/8 页 3 CN 105543151 A 3 的主攻方向。 0006 叶螨在自然界中的病原菌相对较少， 目前记录最主要的是沃尔巴克氏体 (Wolbachia)， 最初发现于尖音库蚊(Culexpipiens)卵巢中， 能够感染昆虫、 螨等多种节肢 动物。 这类细菌能够引发寄主生殖异常行为， 如胞质不亲和、 孤雌生殖、 杀雄和雌性化等现 象。 具有相似活性的菌株。
11、还有Candidatuscardinium， 简称Cardinium， 是从匀鞭蚜小蜂属 (Encarsia)寄生蜂中发现的， 能够引起叶螨雌性化， 诱导孤雌生殖， 诱导胞质不亲和， 影响 宿主适合度和改变寄主的产卵行为。 蜡蚧轮枝菌(VerticilliumlecaniiZimm)可用于防 治蚜虫、 粉虱和螨。 顶孢霉菌株( Acremoniumhansfordii )从自然感病的桃蚜 (MyzuspersicaeSulzer)幼虫分离获得的， 对菜青虫、 桃蚜和二斑叶螨有侵染作用， 寄主感 染顶孢霉后， 消耗了其体内蛋白质， 破坏了合成蛋白质的组织和器官使体内解毒酶和保护 酶失去平衡。 叶。
12、螨病原菌的研究案例和利用相对较少， 但是利用叶螨病原菌进行 “以菌治 螨” ， 可以安全有效调节虫口密度， 在生防中起着重要的作用， 应是生物防治工作的重要组 成部分。 0007 我国幅员辽阔， 东西跨度大， 南北温差明显， 有复杂多变的气候和风貌迥异的地理 条件， 应加大对害虫病原菌资源调查的力度， 并深入探究和保存这些宝贵的害虫生物防治 材料。 为生防事业开辟新路， 尤其在当前害虫普遍产生耐药性以及注重害虫综合治理的持 续性和无公害性的前提下， 着力开发这些微生物资源， 筛选具有高致病力的菌株， 有效减少 了化学农药的用量， 改善生态平衡， 促进环境保护。 发明内容 0008 为解决化学防。
13、治叶螨易产生抗药性导致的防治效果较差， 以及植物性农药杀螨存 在的活性低、 活性成分不明确、 开发利用价值较差的技术问题， 本发明提供一株对植物叶螨 防治效果高的解淀粉芽孢杆菌菌株W1及应用。 0009 本发明的技术方案如下： 0010 1.一株防治植物叶螨的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)菌株W1， 其保藏号为： CGMCCNo.11949。 0011 2 .技 术 方 案 1 所 述 的 防 治 植 物 叶 螨 的 解 淀 粉 芽 孢 杆 菌( B a c i l l u s amyloliquefaciens)菌株W1发酵液的制备方法， 包括以下步骤：。
14、 0012 (1)取出在-80冰箱中保存的技术方案1所述的防治植物叶螨的解淀粉芽孢杆菌 (Bacillusamyloliquefaciens)菌株W1， 划线于LB固体平板上过夜培养活化， 次日挑取单 菌落， 接入装有150mLpH为8的LB液体培养基的500mL锥形瓶中， 35， 170rpm发酵48h获得 种子液。 0013 (2)按5接种量将种子液转接到盛有300mLpH为8的LB液体培养基的1000mL锥形 瓶中， 在温度35， 170rpm发酵48h得技术方案1所述的防治植物叶螨的解淀粉芽孢杆菌 (Bacillusamyloliquefaciens)菌株W1发酵液。 0014 3 .。
15、技 术 方 案 1 所 述 的 防 治 植 物 叶 螨 的 解 淀 粉 芽 孢 杆 菌( B a c i l l u s amyloliquefaciens)菌株W1在防治植物叶螨的应用。 0015 4 .技 术 方 案 2 所 述 的 防 治 植 物 叶 螨 的 解 淀 粉 芽 孢 杆 菌( B a c i l l u s amyloliquefaciens)菌株W1发酵液的制备方法制备得到的技术方案1所述的防治植物叶螨 说明书 2/8 页 4 CN 105543151 A 4 的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)菌株W1发酵液在防治植物叶螨的应用。 001。
16、6 与现有技术相比， 本发明的有益效果： 0017 本发明从自然死亡的二斑叶螨虫体中分离获得一株对叶螨致死作用很强的菌株 W1。 通过生理生化及16SrDNA序列分析， 菌株W1鉴定为革兰氏阳性的解淀粉芽孢杆菌。 本发 明菌株W1在培养皿杀螨实验中致死率达到92.3。 在温室防效实验中， 菌株W1发酵液分别 喷洒布有叶螨的玉米叶片、 草莓、 番茄、 蚕豆、 以及果园中苹果树、 梨树， 对其叶螨防治效果 均达到80以上。 0018 本发明解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)菌株W1于2015年12月30 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称： 。
17、CGMCC)， 保藏号为： CGMCC No.11949， 该普通微生物中心地址： 中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号， 邮政编码： 100101。 该菌株经该普通微生物中心于2015年12月30日检查为存活。 0019 序列表中SEQIDNO： 1所示的是上游引物gyrB-AF的碱基序列。 0020 序列表中SEQIDNO： 2所示的是下游引物gyrB-AR的碱基序列。 具体实施方式 0021 以下结合实施例对本发明作详细的说明， 除本发明菌株W1在上述保藏机构保藏 外， 各实施例中所用其余材料均为市售。 各实施例中无特殊说明的为常规方法。 0022 实施例1本发明解淀粉芽孢杆菌(Bacil。
18、lusamyloliquefaciens)菌株W1CGMCC No.11949(以下简称： 菌株W1)的获得、 鉴定、 培养保存和保藏。 0023 1菌株W1的分离与筛选 0024 1.1菌株W1的分离 0025 从玉米叶片上找出自然死亡的二斑叶螨， 将二斑叶螨放入无菌凹玻片中， 用75 (v/v)的酒精进行表面消毒1min， 无菌水清洗5次后用无菌滤纸吸干二斑叶螨表面的水分， 将二斑叶螨放入无菌研钵中， 加入无菌水， 研磨后将研磨液吸至LB培养基平板上， 用三角器 涂匀； 同时吸取等量第三次无菌水漂洗液涂板， 用来检测二斑叶螨表面消毒是否彻底； 最后 将平板倒置于37下黑暗培养12d直至有菌。
19、落长出， 观察菌落形态， 挑取形态不同的菌落 于LB固体培养基平板上划线纯化培养， 共分离到37种菌株， 分别用质量分数为40的甘油 保存于-80冰箱中。 0026 1.1.1杀螨菌株筛选及菌株W1的获得 0027 将从二斑叶螨体分离得到的37种菌株分别接种于pH为7的LB液体培养基中， 在温 度37， 170rpm发酵24h， 所得发酵液分别喷洒于培养皿内的活体叶螨身上， 每皿放置30头 叶螨， 并设置空白对照(LB液体培养基)， 每个处理3次重复， 观察实验中叶螨的生长情况并 记录存活情况。 获得一株具有杀螨效果的菌株， 命名为W1， 用质量分数为40的甘油保存 于-80冰箱中。 0028。
20、 将菌株W1接种于LB液体培养基中摇菌， 获得菌体浓度为105cfu/ml、 106cfu/ml、 107cfu/ml、 108cfu/ml的发酵液， 分别均匀喷洒于布满叶螨的玉米叶片上， 并设置空白对照 (LB液体培养基)， 每个处理3次重复， 记录叶螨的存活情况， 计算校正死亡率。 校正死亡率计 算公式采用Abbott氏校正公式： 死亡率(死亡螨数处理总螨数)100校正死亡率 (处理死亡数-对照死亡数)(1-对照死亡率)100 说明书 3/8 页 5 CN 105543151 A 5 0029 结果证明浓度为107cfu/mL的杀螨效果最好， 校正死亡率达到92.3。 0030 1.2菌株。
21、W1的鉴定 0031 1.2.1形态特征及生理生化测定 0032 按照科学出版社2001年2月出版的 常见细菌系统鉴定手册 ， 对菌株W1进行形态 和生理生化鉴定， 以确定其分类地位。 菌株W1的形态特征： 菌体呈杆状， 两端钝圆， 单个、 成 对或成串出现， 有芽孢， 胞囊不膨大， 芽孢椭圆形， 中生到次端生， 革兰氏染色均匀且为阳 性， 抗酸染色阴性， 无伴胞晶体， 能运动， 鞭毛周生。 在LB培养基上呈白色不透明菌落， 表面 粗糙， 菌落边缘不规则， 在PSA、 PDA、 NA及LB培养基上均不产色素。 在营养琼脂平板上， 初期 菌落呈乳白色， 脓状， 圆形， 边缘整齐， 菌落隆起， 表。
22、面湿润； 后期菌落呈微黄色， 边缘不整 齐， 表面干燥有皱褶； 在营养琼脂斜面上划线培养， 呈直线形； 在液体LB培养基中静止培养， 表面有白色菌膜。 菌株W1生理生化特征见表1。 根据菌落形态菌体特征以及菌株W1生理生化 特性综合分析表明， 菌株W1为革兰氏阳性菌， 初步鉴定为芽孢杆菌。 0033 表1菌株W1生理生化特性 0034 0035 0036 表1中：“+” 代表阳性，“-” 代表阴性。 0037 1.2.216SrDNA基因序列测定 0038 利用分子标记gyrB基因序列鉴定菌株W1的分类。 按照冯广达(冯广达等， 用于PCR 扩增的细菌DNA提取方法比较， 华南农业大学学报， 。
23、2013， 3(34):439-442)提出的方法快速 提取菌株W1的基因组DNA。 gyrB部分片段的PCR体系(60 L)包括： 含Mg2+10EasyTaqBuffer 6.0 L， 2.5mMdNTPs4.8 L， 引物对： 10 mol上游引物gyrB-AF3.0 L， 10 mol下游引物 gyrB-AR3.0 L， 5U/ LEasyTaq聚合酶0.6 L， 1050ng/ L基因组DNA2.0 L， 补加无菌 ddH2O至总体积为60 L。 上游引物gyrB-AF的碱基序列如SEQIDNO： 1所示， 下游引物gyrB- AR的碱基序列如SEQIDNO： 2所示。 0039 反。
24、应程序： 94预变性4min30s； 9440s， 5240s， 721min30s， 30个循环； 说明书 4/8 页 6 CN 105543151 A 6 72最终延伸10min， 16保存。 0040 PCR反应完成后， 吸取5 LPCR产物于0.8琼脂糖凝胶电泳检测； 切胶回收PCR产 物； 将部分回收产物与线性化的pMD18-T(购自宝生物工程(大连)有限公司)于16连接过 夜。 次日， 将连接产物全部加入到大肠杆菌TG1感受态细胞中(购自宝生物工程(大连)有限 公司)， 热激转化。 37培养810h后， 菌落PCR鉴定阳性转化子。 挑取单个阳性转化子于含 100 g/mL氨苄抗生素。
25、的LB液体培养基中， 37， 160rpm过夜培养， 取菌液交给华大基因公司 测序。 将测序所得的拼接结果在NCBI核酸数据库(http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) 中与已有序列进行同源性比对， 利用软件MAGE构建系统进化树。 0041 1.2.3结果 0042 对提取的菌株W1基因组DNA直接进行PCR扩增， 得到了约为1500bp的明亮条带， 与 16SrDNA在所有的细菌中都高度保守且长度恒定(约1.5kb)的报道一致。 扩增产物经回收 后， 与pMD-18载体连接， 转入感受态细胞E.coliDH5 (购自宝生物工程(大连)有限公司)， 蓝白斑筛选后挑取。
26、白色单菌落， PCR电泳检测得到长度约为1500bp的条带， 其为阳性重组质 粒。 菌株W1的16SrDNA序列经与NCBI核酸数据库BLAST中已有序列进行同源性比对， 确定菌 株W1与Bacillussp.为同一属， 与Bacillusamyloliquefaciens的同源性为99.5， 结合 上述菌株W1的形态特征、 生理生化特性及16SrDNA序列， 将菌株W1鉴定为解淀粉芽孢杆菌 (Bacillusamyloliquefaciens)。 0043 本发明解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)菌株W1于2015年12月30 日保藏于中国微生物菌种保藏管理。
27、委员会普通微生物中心(简称： CGMCC)， 保藏号为： CGMCC No.11949， 该普通微生物中心地址： 中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号， 邮政编码： 100101。 该菌株经该普通微生物中心于2015年12月30日检查为存活。 0044 实施例2菌株W1发酵条件的优化 0045 一、 单因素试验设计 0046 取出在-80冰箱中保存的菌株W1， 划线于LB固体平板上过夜培养活化， 次日挑取 单菌落， 接种于pH为7的LB液体培养基中在温度37， 160rpm发酵24h中发酵， 发酵液按5 接种量接入装有150mL发酵培养基的500mL发酵瓶中， 于恒温摇床37、 160rpm条件。
28、下培养 24h， 设三个重复， 取三次重复的发酵液混合均匀， 测定细菌培养物的OD600值。 同时样品用无 菌水10倍梯度稀释， 取10-6cfu/ml、 10-7cfu/ml和10-8cfu/ml浓度梯度稀释液， 转移至预先倒 好的LB固体平板(200 l/皿)， 均匀涂布， 30过夜培养， 次日计数。 每个浓度梯度处理设置4 个重复(即4个培养皿)。 以监测菌株W1的生长情况。 保持以上所有条件和方法一致， 每次只 改变温度、 LB液体培养基的pH值、 发酵时间、 装液量和转速中的一个因素， 以确定菌株W1的 最优发酵条件。 所述装液量是容器中装入发酵培养基体积。 各条件考察设计如下： 温。
29、度25 、 30、 35、 40； LB液体培养基的pH值4、 5、 6、 7、 8、 9、 10； 发酵时间4h、 8h、 12h、 24h、 36h、 48h； 装液量150mL、 200mL、 250mL、 300mL； 转速150rpm、 160rpm、 170rpm。 0047 二、 结果 0048 培养温度对菌株W1的生长有较大的影响， 温度在25-35时， 菌株W1数量随着温 度的升高而增加， 并且在温度为35， 菌株W1数量达到最大。 当温度继续升高则不利于菌体 生长， 菌株数量下降。 所以将35拟定为菌株W1的发酵温度。 0049 LB液体培养基的pH过高或过低都不太利于菌体。
30、生长， 即过酸或过碱是都会影响菌 说明书 5/8 页 7 CN 105543151 A 7 株W1的生长代谢， 特别是菌株W1浓度过高， pH为10时， 菌株W1几乎不能生长， pH在58变化 时， 菌株W1数量随着pH的升高而增加， 当pH达到8， 菌株W1数量达到最大， 随后pH升高菌量下 降。 故将LB液体培养基的pH值定位为8。 0050 500mL三角瓶中装液量150mL时， 从初始的4h到末期的48h， 菌株W1的数量都高于其 他装液量， 说明溶氧值的降低对菌株W1的生长起到了抑制作用。 菌株W1对溶氧值的要求比 较高， 装液量为150mL较适合该菌生长， 因此装液量为150mL是。
31、菌株W1的最佳发酵装液量。 0051 发酵时间小于24h时， 转速为170rpm时的菌株W1的数量高于160rpm和150rpm， 发酵 时间在2448h期间， 转速为160rpm时， 菌株W1的数量高于150rpm和170rpm， 因此， 菌株W1的 最佳发酵转速应是发酵时间小于24h采用170rpm， 发酵时间在2448h期间采用160rpm。 0052 综上所述， 菌株W1按5接种量接种在LB液体培养基中， 最优发酵条件为温度35 ， LB液体培养基的pH为8， 500mL三角瓶中装液量150mL， 发酵转速应是发酵时间小于24h转 速为170rpm， 发酵时间在2448h期间转速为16。
32、0rpm。 0053 实施例3菌株W1的定殖能力测定 0054 一、 菌株W1的GFP标记 0055 取出在-80冰箱中保存的菌株W1划线于LB固体平板上过夜培养活化， 次日挑取 单菌落， 接种于5mLGMI培养基中， 30， 150rpm振荡培养过夜， 按10接种量转接于5mL GMI培养基中， 37， 230rpm振荡培养3.5h， 取发酵液按5接种量接种于5mLGMII培养基 中， 37， 230rpm振荡培养1.5h， 取1mL培养物， 5000rpm室温离心5min， 用1/10体积上清液重 新悬浮细菌沉淀， 即为解淀粉芽孢杆菌菌株W1感受态细胞。 将10 L质粒pEGFP-C1(p。
33、EGFP-C1 购自购自宝生物工程(大连)有限公司)加入制备好的解淀粉芽孢杆菌菌株W1感受态细胞 中， 充分混匀， 37水浴60min； 37， 200rpm培养4h； 取100 L涂布于含有100 g/mL氨苄青霉 素的LB平板上， 37培养。 12h取生长出来的菌落在光电折射仪下观察， 取荧光较强的菌株 作为转化菌株， 选取单菌落， 用质量分数为40甘油保存于-80冰箱， 为菌株W1的GFP标记 菌株W1-GFP。 所述GMI培养基配方为： 10 xSpizizen盐0.5mL、 2酸水解酪酸0.1mL、 5酵母 提取物0.1mL、 40葡萄糖0.1mL、 20MgSO4H2O5 L、 0。
34、.5L-色氨酸50 L， 加水至5mL， 其 百分含量以质量分数计。 GMI培养基制备方法为： 各成分分别在0.1Mpa下灭菌20min， 各成分 再按配方计量量取混合后， 加水稀释至5mL。 所述GMII培养基配方： 10 xSpizizen盐0.5mL、 2酸水解酪酸50 L、 40葡萄糖0.1mL、 20MgSO4H2O40 L， 加水至5mL， 其百分含量以质 量分数计。 GMII培养基制备方法为： 各成分分别在0.1Mpa下灭菌20min， 各成分再按配方计 量量取混合后， 加水稀释至5mL。 0056 二、 玉米， 番茄， 蚕豆种植以及带菌株W1基质的制备 0057 玉米， 番茄，。
35、 蚕豆的种植采用盆栽， 接种方式为浇灌拌菌和叶面喷洒。 玉米、 番茄、 蚕豆籽粒均按以下方法进行种植和接种： 0058 分别挑选30催芽且长势一致的玉米、 番茄或蚕豆籽粒分别移植于装有土的花盆 中， 每盆5颗， 每个处理设置8个重复。 挑取在氨苄青霉素LB平板上的菌株W1-GFP单菌落， 接 入含有氨苄青霉素的LB液体培养基中， 37160rpm振摇培养3d以形成内生芽孢， 10000rpm 室温离心8min， 无菌水洗涤3次， 所得沉淀为含菌株W1-GFP的无菌水悬浮菌体， 最后用一定 体积的含菌株W1-GFP的无菌水悬浮菌体与土搅拌混匀， 使菌株W1含量达到107cfu/g土即得 带菌株W。
36、1基质， 等量将带菌株W1基质分装到花盆中， 700g带菌株W1基质/盆， 另一方面用无 说明书 6/8 页 8 CN 105543151 A 8 菌水将上述含菌株W1-GFP的无菌水悬浮菌体稀释使菌株W1含量达到107cfu/g， 均匀喷洒植 株叶面。 不定时察看基质水分含量情况， 酌情浇水保持基质湿润， 但要注意不能浇过， 以防 菌体随着水流而散失。 0059 三、 回收检测GFP标记菌株W1-GFP 0060 在萌发的种子移栽后的第3， 5， 7， 14， 30天取样， 回收检测标记菌株W1-GFP在玉米， 番茄， 蚕豆的根际、 根表、 根、 茎以及叶的定殖数量。 0061 从土壤中拔取。
37、玉米， 番茄， 蚕豆幼苗， 轻轻抖落根系上的土壤颗粒， 收集土壤颗粒 即为根际土壤样品。 然后用毛笔轻刷附着在根系的土壤颗粒， 即为根表土壤样品。 根际土壤 样品和根表土壤样品均按以下方法检测绿色荧光的菌落数量： 0062 分别取50g根际土壤样品、 50g根表土壤样品分别用无菌水10倍(v/v)稀释成土壤 悬液后， 置于37摇床上120rpm振摇30min混匀， 再无菌水10倍(v/v)梯度稀释6次， 取第4、 5、 6次的稀释液分别均匀涂布含氨苄青霉素的LB固体平板上， 每个处理3个重复。 37过夜 培养， 待菌落长出后， 置于光电折射仪上统计呈绿色荧光的菌落数量。 0063 用流水冲洗玉。
38、米， 番茄， 蚕豆根系5min， 以洗净依然吸附在根表面的微小颗粒， 用 1(m/m)次氯酸钠消毒2min， 70(v/v)酒精浸泡处理30s， 无菌水洗涤4次， 最后一次无菌 水取样涂布于含有氨苄青霉素的抗性平板， 以确保消毒彻底， 用滤纸吸干根表面水分， 作为 根组织样品。 分别取最下层老龄叶到茎基部的组织， 作为茎组织样品。 分别取各自叶片， 剪 成1cm左右长度的小段， 作为叶组织样品。 分别取各样品50g于无菌研钵内加10mL无菌水研 磨， 涡旋仪上涡旋4min后， 用无菌水10倍梯度稀释4次， 取第2、 3、 4次稀释液涂布于含氨苄青 霉素的LB固体平板上， 每个处理3个重复。 3。
39、7过夜培养， 待菌落长出后， 置于光电折射仪上 统计呈绿色荧光的菌落数量。 0064 四、 标记菌株W1-GFP在玉米、 番茄、 蚕豆定殖部位的观察 0065 在各植物移植后的第3、 5、 7、 14、 24天取样观察标记菌株在根、 茎、 叶的定殖情况。 取样时， 将各植物幼苗从土壤中轻轻拔出， 用无菌水持续冲洗附着于根表的土壤颗粒及杂 物等， 用吸水纸吸干根系表面的残留水分。 分别取根系、 茎、 叶并切成5mm小段， 将其置于载 玻片上， 滴加1滴无菌水， 盖上盖玻片， 在LeicaDM2500荧光显微镜下观察， 蓝光激发， 利用 软件收集分析图像。 0066 五、 结果 0067 玉米， 。
40、番茄， 蚕豆种植后的第3、 5、 7、 14、 24d， 在各植物幼苗的根际土、 根表土、 根 部、 茎、 叶内能都能检测到标记菌株W1-GFP， 且定值密度均呈现先升后降的趋势， 最后趋于 稳定。 标记菌株W1-GFP在各植物不同区域的定殖密度均表现为根际土根表土根茎 叶。 在根际土和根表土中定值密度在105cfu/g106cfu/g之间。 但在根、 茎、 叶内的定殖密度 各不相同。 标记菌株W1-GFP在玉米根、 茎、 叶内的定殖密度维持在102103cfu/g之间。 在番 茄根、 茎、 叶内的定殖密度维持在104105cfu/g之间。 标记菌株W1-GFP在蚕豆根、 茎、 叶内的 定殖密。
41、度维持在103105cfu/g之间。 共聚焦激光扫描显微镜观察标记菌株W1-GFP在玉米、 番茄、 蚕豆体内的定殖结果发现在接种后的第3天， 可以观察到标记菌株W1-GFP在各植物根 部根伸长区和分生区、 茎薄壁组织和茎髓部均有定殖。 这表明菌株W1能在玉米、 番茄和蚕豆 三种作物体内很好地定殖， 菌株W1与玉米、 番茄和蚕豆有良性的互作关系。 0068 实施例4菌株W1对作物螨害的防效试验 说明书 7/8 页 9 CN 105543151 A 9 0069 一、 菌株W1发酵液的制备方法， 包括以下步骤： 0070 (1)取出在-80冰箱中保存的菌株W1， 划线于LB固体平板上过夜培养活化，。
42、 次日 挑取单菌落， 接入装有150mLpH为8的LB液体培养基的500mL锥形瓶中， 35， 170rpm发酵 48h获得种子液。 0071 (2)按5接种量将种子液转接到盛有300mLpH为8的LB液体培养基的1000mL锥形 瓶中， 在温度35， 170rpm发酵48h得所述菌株W1发酵液。 0072 二、 对作物螨害的防效试验 0073 用实施例4中一、 菌株W1发酵液的制备方法制备得到的发酵液应用到温室内的玉 米、 草莓、 番茄和蚕豆作物上的叶螨防治， 同时应用于苹果园和梨树园的叶螨防治。 选择长 势一致， 叶螨发生严重的区域， 各植物设置3个小区， 各小区间设置保护行， 每个小区选。
43、取3 株， 每株按不同植物选择3-10片叶， 编号挂牌， 定株、 定叶调查统计喷药前二斑叶螨的基数。 用背负式单管手动喷雾器对每个处理的全部植物进行全株喷施菌株W1发酵液， 以所有叶子 正反面均着药， 且叶尖稍有药液下滴为宜。 设置清水对照。 喷施后1、 3、 5、 7、 9d分别调查标记 叶片的活叶螨数量。 统计计算防治效果， 叶螨减退率(活螨基数药后活螨数)活螨基 数100； 防治效果(处理组叶螨减退率对照组叶螨减退率)(100对照组叶螨减 退率)100。 试验结果显示用药后35天， 叶螨密度明显减少， 7天以后对叶螨防治效果 均超过80以上， 防治效果最好的是在玉米上， 达到89.4。 说明书 8/8 页 10 CN 105543151 A 10 云南省微生物发酵工程研究中心有限公司 一株防治植物叶螨的解淀粉芽孢杆菌菌株W1及应用 / 2 PatentInversion3.3 1 20 DNA 人工序列 上游引物gyrB-AF 1 gcgctgtccgaactgtacct20 2 23 DNA 人工序列 下游引物gyrB-AR 2 cggtgatcagcgtcgccacttcc23 序列表 1/1 页 11 CN 105543151 A 11 。