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1、(10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201310676487.0 (22)申请日 2013.12.12 C12P 7/16(2006.01) C12R 1/145(2006.01) (73)专利权人 中国科学院成都生物研究所 地址 610041 四川省成都市武侯区人民南路 四段九号 (72)发明人 傅舒 刘晓风 郑涛 李东 闫志英 袁月祥 孙永明 (74)专利代理机构 成都赛恩斯知识产权代理事 务所 ( 普通合伙 ) 51212 代理人 张帆 肖国华 CN 101988078 A,2011.03.23, CN 102220386 A,2011.10.19, WO 2010/。
2、077170 A2,2010.07.08, Lan Wang and Hongzhang Chen. Acetone-butanol-ethanol fermentation and isoflavine extraction using kudzu roots.Biotechnology and Bioprocess Engineering .2011, 第 16 卷 739-745. 李新波等.少根紫萍(Landoltia punctata) 高比例燃料丁醇发酵方法研究 .中国酿 造 .2012, 第 31 卷 ( 第 8 期 ),85-88. 龙飞等 . 丙酮丁醇梭菌 Clostridi。
3、um acetobutylicum CICC 8012发酵鲜芭蕉芋生产丁 醇 .应用与环境生物学报 .2013, 第 19 卷 ( 第 1 期 ),54-60. 熊莲等 . 纤维二糖发酵生产丙酮丁醇 .生 物加工过程 .2012, 第 10 卷 ( 第 2 期 ),1-5. (54) 发明名称 一种粉葛同步酶处理发酵生产丁醇的方法 (57) 摘要 本发明选用粉葛作为原料， 利用酶的同步处 理达到快速发酵生产丁醇并提高丁醇浓度的目 的。本发明所述的一种粉葛原料同步酶处理发酵 生产丁醇的方法， 其特点在于酶处理与发酵同步 进行， 简单方便， 易操作， 无污染物产生， 丁醇产 量高。发酵结束后醪液中。
4、丁醇产量最高可达到 16.91g/L， 丁醇产量得到显著提高， 较未添加酶组 提高 21% 以上。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 李影 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书4页 CN 103667364 B 2016.04.13 CN 103667364 B 1/1 页 2 1.一种同步酶处理发酵生产丁醇的方法， 其特征在于， 该方法包括如下步骤 ： (1) 将新鲜粉葛采收切块后， 直接粉碎得粉葛浆， 或烘干粉碎得粉葛干粉 ； (2) 将步骤 (1) 得到的粉葛浆与水按基于干重的质量比 1:9 1:6， 或将步骤 (1) 得到 的粉。
5、葛粉与水按质量比 1:9 1:6 混匀于 95糊化 30-60min， 制成粉葛培养基 ； (3) 冷却后向步骤 (2) 所述的粉葛培养基中添加 1 5g/L 的氮源 ； (4) 将步骤 (3) 所述的添加了氮源的培养基置于 115灭菌 20min ； 冷却至 50 以下， 在无菌条件下加入酶制剂， 同时并接入培养基重量 10 (v/m) 的丙酮丁醇梭菌 (Clostridium acetobutylicum)种子液， 并于37同步预处理、 发酵68-76h后得到丁醇发 酵液 ； 其中， 所述方法中， 步骤 (3) 中所述氮源选自醋酸铵、 酵母膏、 豆粕、 麸皮和尿素， 或其 两种或多种的组合。
6、 ； 步骤 (4) 中所述酶制剂为果胶酶、 纤维素酶中一种或其组合 ； 所述酶制 剂的添加量为 1-5g/kg 粉葛发酵培养基。 2.根据权利要求1所述的同步酶处理发酵生产丁醇的方法， 其特征在于， 步骤(4)中所 述丙酮丁醇梭菌 (Clostridium acetobutylicum) 种子液由以下培养方法获得 ： 玉米粉与 水按质量比1:10混匀后于95糊化30min， 制成玉米醪培养基， 115灭菌20min， 无菌条件 下接入丙酮丁醇梭菌 (Clostridium acetobutylicum)， 37培养 24h 得到。 权 利 要 求 书 CN 103667364 B 2 1/4 。
7、页 3 一种粉葛同步酶处理发酵生产丁醇的方法 技术领域 0001 本发明属于生物发酵技术领域， 具体涉及一种酶处理粉葛原料发酵生产丁醇并提 高丁醇产量的方法。 背景技术 0002 随着社会的发展， 作为不可再生能源的石化能源日益枯竭， 生物质能源等可再生 能源得到越来越多的关注。 生物质以农林资源、 有机废弃物等各种形式存在， 可将其通过各 种方式转变为生物质能源。 0003 丁醇作为生物质能源的一种， 与燃料乙醇相比， 它具有更高的燃值和疏水性， 较低 的挥发性， 可与汽油以任意比例混合。丁醇的生产主要由丙酮丁醇梭菌进行丙酮丁醇发酵 (Acetone-Butanol-Ethanol ferm。
8、entation， ABE)， 其主要产物为丙酮、 丁醇和乙醇， 比例为 3 ： 6 ： 1。为节约原料成本， 秸秆等农业废弃物生产燃料丁醇的研究得到了较大的关注。但 是， 作物秸秆等木质纤维资源分解困难， 导致溶剂产量偏低。这时， 能在边际土地生长的非 粮植物粉葛进入视野。 0004 葛属 (Pueraria DC) 为豆科植物， 在全世界有 20 个种， 11 个种位于中国。其中野 葛(Pueraria lobata(Willd)Ohwi)和甘葛藤(Pueraria thomsonii Benth.)的分布最广， 产量最高。据 中国药典 记载， 粉葛为甘葛藤的干燥根， 当其中葛根素含量大于。
9、 0.3% 时方 可入药。作为多年生藤本植物的块茎 , 利用粉葛生产丁醇具有以下优势 :1. 粉葛原料中含 有葛根素等高附加值的异黄酮物质， 使其与木薯相比更具有经济价值。 这些异黄酮类物质， 可以预防和治疗高血压、 高血脂、 冠心病、 心绞痛、 糖尿病等疾病。2. 分布广泛。在我国， 除 新疆、 西藏、 青海等少数地区未见有其生长。 而且， 在我国川渝、 两广、 两湖、 江西等地已有规 模化种植。3. 淀粉含量高， 其淀粉含量占干重的 60 70%， 在生产燃料乙醇时， 其土地亩产 乙醇量比玉米和木薯均高。 4.氮元素含量高于木薯， 更利于微生物利用。 因此， 粉葛不但可 以药用， 还是一种。
10、极具潜力的丁醇生产原料。 开发粉葛原料作为丁醇生产的原料， 能在改善 能源生产消费结构， 环境保护， 社会经济发展等方面有重要意义。 0005 ABE 发酵产物丁醇对生产菌株产生抑制。有研究表明， 当丁醇浓度达 11g/L 时， 菌 体受到严重抑制。当丁醇浓度进一步到达 15g/L 时， 菌体将不再生长。因此， 许多研究者尝 试通过菌种改造提高发酵醪中的丁醇浓度。Chen 等利用经过化学诱变而得到的拜氏梭菌 BA101（Clostridium beijerinckii BA101） 进行丁醇发酵， 最终丁醇产量为 20.9g/L， 是目 前报道的批次发酵中溶剂产量最高的菌株。 但是， 菌种改造。
11、始终面临遗传不稳定的缺点， 难 以进行工业化应用。本发明通过优化发酵工艺， 利用酶处理同步发酵粉葛原料进行丁醇生 产得到了较高的丁醇产量。 发明内容 0006 本发明选用粉葛作为原料， 利用酶的同步处理达到快速发酵生产丁醇并提高丁醇 浓度的目的。 说 明 书 CN 103667364 B 3 2/4 页 4 0007 本发明提供一种同步酶处理发酵生产丁醇的方法， 该方法包括如下步骤 ： 0008 （1） 将新鲜粉葛采收切块后， 直接粉碎得粉葛浆 , 或烘干粉碎得粉葛干粉 ； 0009 （2） 将步骤 （1） 得到的粉葛浆与水按基于干重的质量比 1:9 1:6， 或将步骤 （1） 得到的粉葛粉与。
12、水按质量比 1:9 1:6 混匀于 95糊化 30-60min， 制成粉葛培养基 ； 0010 （3） 冷却后向步骤 （2） 所述的粉葛培养基中添加 1 5g/L 的氮源 ； 0011 （4） 将步骤 （3） 所述的添加了氮源的培养基置于 115灭菌 20min ； 冷却至 50以 下， 在无菌条件下加入酶制剂， 并接入培养基重量 10%（v/m） 的丙酮丁醇梭菌 （Clostridium acetobutylicum） 种子液 （即 100g 培养基添加 10ml 种子液） ， 并于 37同步预处理、 发酵 68-76h 后得到丁醇发酵液。 0012 其中， 本发明上述方法中， 步骤 （3）。
13、 中所述氮源选自醋酸铵、 酵母膏、 豆粕、 麸皮和 尿素， 或其两种或多种的组合 ； 0013 步骤 （4） 中所述酶制剂为果胶酶、 纤维素酶中一种或其组合。其中纤维素的标准 酶活 （CMC 酶活） 为 1105u/g， 酶活定义 ： 1g 酶粉于 50， 1min 催化 CMC 水解生成 1g 葡 萄糖为一个纤维素酶 CMC 活力单位 ； 果胶酶的标准酶活为 5105U/g， 酶活定义 ： 1g 酶粉于 50， 1min 催化果胶水解生成 1g 半乳糖醛酸的酶量为一个果胶酶活力单位 ； 0014 所述酶制剂的添加量为 1-5g/L 粉葛发酵培养基。 0015 所述丙酮丁醇梭菌 （C.acet。
14、obutylicum） 的保藏编号为 CICC8008， 购买于中国工 业微生物菌种保藏中心。 0016 所述丙酮丁醇梭菌 （C.acetobutylicum） 种子液由以下培养方法获得 ： 玉米粉与 水按质量比1:10混匀后于95糊化30min， 制成玉米醪培养基， 115灭菌20min， 无菌条件 下接入丙酮丁醇梭菌 （C.acetobutylicum） ， 37培养 24h 得到。 0017 本发明所述的粉葛原料同步酶处理发酵生产丁醇的方法， 其优点在于酶处理与发 酵同步进行， 简单方便， 易操作， 无污染物产生， 丁醇产量高。 发酵结束后醪液中丁醇产量可 达到 16.91g/L， 丁醇。
15、产量得到显著提高， 较未添加酶组提高 21% 以上。 具体实施方式 0018 以下所给出的实施例是为进一步说明本发明的技术特征， 并非对本发明的技术方 案进行限制。对本发明中的技术方案进行的任何修改或局部替换， 在不脱离本发明的精神 和范围的情况下， 均应涵盖在本发明的保护范围中。 0019 实施例 1 0020 取切块、 烘干粉碎后的粉葛干粉6.25g放入100ml厌氧瓶内， 加入50ml蒸馏水(质 量比 1:8) 混匀， 将其置于 95糊化 30min。冷却后 A 组和 B 组各添加醋酸铵作为氮源至终 浓度为 2g/L， C 组不做任何添加， 三组同于 115灭菌 20min。冷却至 50。
16、以下后 A 组在无 菌条件下添加果胶酶至终浓度为 3g/L， B 组不添加该酶。三组同时接入培养基重量 10% （v/ m） 的丙酮丁醇梭菌种子液， 37发酵 72h 后分别得到丁醇发酵液。利用气相色谱测得 A 组 丁醇发酵液中丁醇产量为 16.91g/L， 较未添加酶组 （B 组） 提高 25.07%， 较未经任何处理组 （C 组） 提高 36.81%。 0021 实施例 2 0022 取切块、 烘干粉碎后的粉葛干粉 7.10g 放入 100ml 厌氧瓶内， 加入 50ml 蒸馏水 说 明 书 CN 103667364 B 4 3/4 页 5 ( 质量比 1:7) 混匀， 将其置于 95糊化。
17、 45min， 冷却后加入麸皮作为氮源至终浓度为 5g/L， 115灭菌 20min。冷却至 50以下后 A 组在无菌条件下加入纤维素酶至终浓度为 1g/L， B 组不添加酶， 二组同时接入培养基重量 10%（v/m） 的丙酮丁醇梭菌种子液， 37发酵 76h 后 分别得到丁醇发酵液。利用气相色谱测得 A 组丁醇发酵液中丁醇产量为 15.76g/L， 较未添 加酶组 （B 组） 提高 21.14%。 0023 实施例 3 0024 取切块、 直接粉碎后的粉葛浆 5.55g( 干基 ) 放入 100ml 厌氧瓶内， 加入定量蒸馏 水至质量比1:9(基于干基)， 将其置于95糊化30min， 冷却。
18、后加入尿素作为氮源至终浓度 为 2g/L， 115灭菌 20min。冷却至 50以下后 A 组在无菌条件下添加终浓度为 1.5g/L 的 果胶酶和 1.5g/L 纤维素酶， B 组不添加酶， 二组同时接入培养基重量 10%（v/m） 的丙酮丁 醇梭菌种子液， 37发酵 68h 后分别得到丁醇发酵液。利用气相色谱测得 A 组丁醇发酵液 中丁醇产为 16.21g/L， 较未添加酶组 （B 组） 提高 22.84%。 0025 实施例 4 0026 取切块、 烘干粉碎后的粉葛干粉8.25g放入100ml厌氧瓶内， 加入50ml蒸馏水(质 量比 1:6) 混匀， 将其置于 95糊化 60min， 冷却。
19、后加入终浓度为 2g/L 的酵母膏作为氮源， 115灭菌 20min。冷却至 50以下后 A 组在无菌条件下加入纤维素酶至终浓度为 5g/L， B 组不添加酶制剂， 二组同时接入培养基重量 10%（v/m） 的丙酮丁醇梭菌种子液， 37发酵 76h 后分别得到丁醇发酵液。利用气相色谱测得 A 组丁醇发酵液中丁醇产量为 15.29g/L， 较未添加酶组 （B 组） 提高 21.02%。 0027 实施例 5 0028 取切块、 直接粉碎后的粉葛浆 6.25g( 干基 ) 放入 100ml 厌氧瓶内， 加入定量蒸馏 水至质量比 1:8( 基于干基 )， 将其置于 95糊化 30min， 冷却至 5。
20、0以下后加入豆粕作为 氮源至终浓度为 5g/L， 115灭菌 20min， 冷却后 A 组在无菌条件下加入纤维素酶至终浓度 为 3g/L， B 组不添加酶制剂 , 二组同时接入 10%（v/m） 的丙酮丁醇梭菌种子液， 37发酵 72h 后分别得到丁醇发酵液。利用气相色谱测得 A 组丁醇发酵液中丁醇产量为 16.17g/L， 较未添加酶组 （B 组） 提高 23.02%。 0029 实施例 6 0030 取切块、 烘干粉碎后的粉葛干粉6.55g放入100ml厌氧瓶内， 加入50ml蒸馏水(质 量比1:7.6)混匀， 将其置于95糊化45min， 冷却至50以下后加入终浓度为1g/L的醋酸 铵和。
21、终浓度为 2g/L 的豆粕， 115灭菌 20min， 冷却后 A 组在无菌条件下加入果胶酶至终浓 度为 3g/L,B 组不添加， 二组同时接入培养基重量 10% （v/m） 的丙酮丁醇梭菌种子液， 37发 酵 76h 后分别得到丁醇发酵液。利用气相色谱测得 A 组丁醇发酵液中丁醇产量为 16.35g/ L， 较未添加酶组 （B 组） 提高 23.88%。 0031 实施例 7 0032 取切块、 烘干粉碎后的粉葛干粉6.00g放入100ml厌氧瓶内， 加入50ml蒸馏水(质 量比 1:8.33) 混匀， 将其置于 95糊化 30min， 冷却至 50以下后加入醋酸铵、 尿素和豆粕 作为氮源，。
22、 其终浓度分别为 1g/L、 0.5g/L、 和 1g/L， 115灭菌 20min。在冷却后在无菌条件 下向 A 组加入果胶酶至终浓度为 2g/L， B 组不添加酶制剂。二组同时接入培养基重量 10% （v/m） 的丙酮丁醇梭菌种子液， 37发酵 68h。分别得到丁醇发酵液。发酵结束后， 测得发 说 明 书 CN 103667364 B 5 4/4 页 6 酵液中添加和未添加酶组的丁醇产量分别为 16.57g/L（A 组） 和 13.46g/L（B 组） ， A 组较 B 组提高了 23.10%。 0033 结果显示， 本发明所述的酶处理方法工艺简单， 操作方便， 丁醇浓度高， 通过酶同 步处理的粉葛原料发酵后丁醇最高浓度可达16.91g/L。 利用酶同步处理的粉葛在进行发酵 时， 其丁醇产量提高显著， 较未添加酶组提高 21% 以上。 说 明 书 CN 103667364 B 6 。