《一种脊尾白虾微卫星标记的3重PCR检测方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种脊尾白虾微卫星标记的3重PCR检测方法.pdf（8页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)申请公布号 CN 102676689 A (43)申请公布日 2012.09.19 CN 102676689 A *CN102676689A* (21)申请号 201210190585.9 (22)申请日 2012.06.11 C12Q 1/68(2006.01) (71)申请人 中国水产科学研究院黄海水产研究 所 地址 266071 山东省青岛市市南区南京路 106 号 (72)发明人 刘萍 李健 贾舒雯 (74)专利代理机构 青岛联智专利商标事务所有 限公司 37101 代理人 杨秉利 (54) 发明名称 一种脊尾白虾微卫星标记的 3 重 PCR 检测方 法 (57) 摘要 本发明。
2、提供了一种脊尾白虾微卫星标记的 3 重 PCR 检测方法， 它包括设计并合成 3 重 PCR 引 物 ； 提取基因组 DNA ； 3 重 PCR 反应 ； 检测 PCR 产 物 ； PCR 反应包括 3 重 PCR 反应体系和 3 重 PCR 反 应程序。本发明建立了进行脊尾白虾家系和亲子 鉴定的3重PCR反应体系， 实现了在一个PCR反应 中同时检测3个微卫星位点， 因此与原有的PCR方 法相比效率提高了 3 倍。本发明具有高效、 经济、 简便易行等特点， 可以在脊尾白虾遗传多样性分 析、 亲缘关系鉴定、 家系管理和良种选育进行推广 应用。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书。
3、 3 页 序列表 2 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 3 页 序列表 2 页 附图 1 页 1/1 页 2 1. 一种脊尾白虾微卫星标记的 3 重 PCR 检测方法， 它包括 ： (1) 设计并合成 3 重 PCR 引 物 ； (2) 提取基因组 DNA ； (3)3 重 PCR 反应 ； (4) 检测 PCR 产物 ； 其特征在于所述 3 重 PCR 反应包括 3 重 PCR 反应体系和 3 重 PCR 反应程序， 所述 3 重 PCR 反应体系的引物为 EC007、 EC054 和 EC709 的组合， 所述各引物序。
4、列如下 ： EC007 F: AATATGCAGTGGCAAGCT ； R:TTCCCATCATCTTCCTCC ； EC054 F: CTTTGCCCCTACTAACTGTTGC ； R:ACGACTGACCTGAGAAATCCCT ； EC709 F: GGCTGTCCCTTGGAACTA ； R:ACGAAATCCGAATAACCC。 2. 根据权利要求 1 所述的一种脊尾白虾微卫星标记的 3 重 PCR 检测方法， 其特征在于 所述 3 重 PCR 反应体系为 ： 10Buffer 2.0L ； 25mmol/L MgCl2 1.2L ； 10mmol/L dNTP 1.5L ； 所述。
5、5mmol/L引物EC007: F: 1.5L + R:1.5L、 EC054: F: 05L + R:0.5L、 EC709 ： F: 1.5L + R:1.5L ； 50ng/L 脊尾白虾基因组 DNA 2.0L ； 5U/L Taq 聚合 酶 0.2L ； ddH2O 补充至 20L。 3. 根据权利要求 1 所述的一种脊尾白虾微卫星标记的 3 重 PCR 检测方法， 其特征在于 所述PCR反应程序为 ： 95 预变性5min ； 95变性45 s， 56退火45 s， 72延伸45 s， 共 进行 25 次循环 ； 最后 72延伸 5min ； 4保存并结束反应。 4. 根据权利要求 。
6、1 所述的一种脊尾白虾微卫星标记的 3 重 PCR 检测方法， 其特征在于 采用琼脂糖凝胶电泳方法检测 PCR 产物。 权 利 要 求 书 CN 102676689 A 2 1/3 页 3 一种脊尾白虾微卫星标记的 3 重 PCR 检测方法 技术领域 0001 本发明涉及脊尾白虾微卫星标记的 PCR 检测方法， 具体涉及一种脊尾白虾微卫星 标记的 3 重 PCR 检测方法。 背景技术 0002 微卫星 (microsatellites) 或称简单序列重复 (simple sequence repeats,SSR) 是指由 1 6 个核苷酸组成的简单串联重复 DNA 序列。迄今研究过的所有生物种。
7、类中都 发现了它的存在， 并且分布密度很大。由于微卫星广泛分布于基因组中， 具有密度大、 多态 性丰富、 高度杂合且稳定性好、 遵循孟德尔分离定律共显性遗传、 易于 PCR 扩增等特点， 已 成为近年来最引人注目的新型 DNA 标记， 并广泛应用于生物资源的家系谱系认证、 基因连 锁分析、 遗传图谱构建、 种质鉴定、 种群遗传多样性等许多研究领域。多重 PCR(Multiplex PCR) 是在同一个反应中同时扩增两个或多个位点的聚合链式反应。它具有提高效率， 避免 样品浪费， 快速周转时间， 并可大大节约实验成本的优点。 0003 微卫星多重 PCR 技术在水产动物中已有广泛应用， 主要进行。
8、亲子鉴定和遗传多样 性分析， Patricia Novel 等已在狼鲈 (Dicentrarchus labrax)、等在 褐鳟 (Salmo trutta)、 Javier Porta 等在塞内加尔鳎 (Solea senegalensis)、 Yan Wang 等在牡蛎 (Crassostrea virginica Gmelin)、 GAO Huan 等在中国对虾 (Fenneropenaeus chinensis)、 Yutao Li 等在斑节对虾 （Penaeus monodon）和任宪云等在三疣梭子蟹 （Portunus trituberculatus） 中有相关报道。 0004 随。
9、着脊尾白虾人工养殖业的迅速发展， 其基础研究工作近年来逐渐开展起来， 截 止到目前为止， 脊尾白虾还未见有微卫星多重 PCR 体系建立等方面的技术。 发明内容 0005 针对现有技术中脊尾白虾基础研究工作缺失， 给家系建立过程中遗传参数的评估 带来困难等缺点， 本发明提供了一种脊尾白虾微卫星标记的3重PCR检测方法， 本发明在大 量微卫星分子标记的基础上构建了 3 重 PCR 检测体系， 大大缩短实验时间， 提高了实验效 率， 所得结果可同时反映出脊尾白虾在多个微卫星位点的遗传变异。 0006 为实现上述发明目的， 本发明采用下述技术方案予以实现 ： 0007 一种脊尾白虾微卫星标记的 3 重。
10、 PCR 检测方法， 它包括 ： (1) 设计并合成 3 重 PCR 引物 ； (2) 提取基因组 DNA ； (3)3 重 PCR 反应 ； (4) 检测 PCR 产物 ； 其特征在于所述 3 重 PCR 反应包括3重PCR反应体系和3重PCR反应程序， 所述3重PCR反应体系的引物为EC7、 EC54 和 EC709 的组合， 所述各引物序列如下 ： 0008 EC007 F:AATATGCAGTGGCAAGCT ； 0009 R:TTCCCATCATCTTCCTCC ； 0010 EC054 F:CTTTGCCCCTACTAACTGTTGC ； 0011 R:ACGACTGACCTGAG。
11、AAATCCCT ； 说 明 书 CN 102676689 A 3 2/3 页 4 0012 EC709 F:GGCTGTCCCTTGGAACTA ； 0013 R:ACGAAATCCGAATAACCC。 0014 进 一 步 的，所 述 3 重 PCR 反 应 体 系 为 ： 10Buffer 2.0L ； 25mmol/L MgCl21.2L ； 10mmol/L dNTP 1.5L ；所 述 5mmol/L 引 物 EC007:F:1.5L+R:1.5L、 EC054:F:05L+R:0.5L、 EC709 ： F:1.5L+R:1.5L ； 50ng/L 脊 尾 白 虾 基 因 组 D。
12、NA 2.0L ； 5U/LTaq 聚合酶 0.2L ； ddH2O 补充至 20L。 0015 再进一步的， 所述 PCR 反应程序为 ： 95预变性 5min ； 95变性 45s， 56退火 45s， 72延伸 45s， 共进行 25 次循环 ； 最后 72延伸 5min ； 4保存并结束反应。 0016 其中， 本发明采用琼脂糖凝胶电泳方法检测 PCR 产物。 0017 与现有技术相比， 本发明的优点和积极效果是 ： 0018 1、 微卫星标记由于其多态性丰富、 易于检测、 呈孟德尔共显性遗传等优点， 是进行 系谱分析和群体遗传多样性研究的一种比较理想的工具， 但常规 PCR 扩增在一。
13、个脊尾白虾 检测中只能获得 12 个点位基因。本发明所述检测方法是在多个多态性微卫星标记的基础 上进行标记间组合、 搭配以及实验方法优化， 获得更简便、 快捷的 PCR 检测方法， 大大缩短 了实验时间， 它与常规的PCR方法相比效率提高了3倍左右， 且所得结果可同时反映出脊尾 白虾在多个微卫星位点的遗传变异。 0019 2、 本发明可以在脊尾白虾群体遗传多样性分析、 亲子鉴定、 家系管理和良种选育 进行推广应用。 0020 结合附图阅读本发明的具体实施方式后， 本发明的其他特点和优点将变得更加清 楚。 附图说明 0021 图 1 是本发明的微卫星标记 3 重 PCR 检测方法对脊尾白虾 8 。
14、个个体的检测图谱， 1-8 是 8 个脊尾白虾个体， M 为 MD206-pBR322DNA/MspI DNA 分子 Marker。 具体实施方式 0022 下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细的说明。 0023 实施例 1 0024 本发明提供的脊尾白虾微卫星标记的 3 重 PCR 构建方法如下 ： 0025 1、 以本发明提供的脊尾白虾微卫星富集文库中的微卫星核心序列为基础， 使用 Primer Premier 6.0 软件在其微卫星核心序列的两端设计相应的 PCR 引物， 获得一系列具 有 PCR 扩增产物大小不等的 SSR 标记。 0026 2、 利用 Primer。
15、 Premier 6.0 软件进行引物间的评价， 对显示大部分的 G（能量 变化的 Gibbs） 值在 -4 以上的引物选出备用， G（能量变化的 Gibbs） 值在 -4 以上主要说 明多重 PCR 体系中单对引物之间不易形成引物二聚体以及具有低发夹结构， 以免影响 PCR 反应效率。通过对多对微卫星标记引物间的搭配、 组合， 对其进行多重 PCR 体系的构建及测 试， 并对 PCR 实验的反应条件和加样参数进行优化， 从而建立了本发明所述的 1 组 3 重微卫 星 PCR 检测方法。 0027 本发明的一种脊尾白虾微卫星标记的 3 重 PCR 检测方法具体步骤如下 ： 说 明 书 CN 1。
16、02676689 A 4 3/3 页 5 0028 (1)、 本发明所选用的 3 种引物序列如下 ： 0029 0030 (2)、 脊尾白虾基因组DNA提取 ： 取脊尾白虾肌肉组织， 采用苯酚/氯仿的方法提取 脊尾白虾基因组 DNA。1琼脂糖凝胶电泳检测基因组 DNA 完整性， 利用 RNA/DNA 分光光度 仪进行基因组 DNA 浓度的检测并稀释成 50ng/l 终浓度， -20保存备用。 0031 (3)、 PCR 反 应 体 系 为 ： 10Buffer 2.0L ； 25mmol/L MgCl21.2L ； 10mmol/L dNTP 1.5L ； 所述 5mmol/L 引物 EC00。
17、7:F:1.5L+R:1.5L、 EC054:F:05L+R:0.5L、 EC709 ： F:1.5L+R:1.5L ； 50ng/L 脊尾白虾基因组 DNA 2.0L ； 5U/L Taq 聚合酶 0.2L ； ddH2O 补充至 20L。 0032 常规 PCR 的反应程序 ： 95预变性 5min ； 95变性 45s， 56退火 45s， 72延伸 45s， 共进行 25 次循环 ； 最后 72延伸 5min ； 4保存并结束反应。 0033 (4)、 PCR 产物的检测 ： 将 PCR 产物在 6% 的变性聚丙烯酰胺凝胶， 12W 恒功率电泳 1-1.5 小时进行分离。将胶板通过 1。
18、0% 的冰醋酸溶液 20min 蒸馏水 6min 0.1% 的硝酸 银溶液 25min 3% 的碳酸钠溶液显色数分钟， 终止反应。即可得到脊尾白虾 EC007、 EC054 和 EC709 共 3 个基因位点的组合的具有高度多态性的图谱， 实验结果如图 1 所示， 图 1 中 1-8 为 8 个脊尾白虾个体采用本发明所述 3 重 PCR 检测方法的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。实 验结果表明效果良好。 0034 依据本发明提供的脊尾白虾微卫星标记3重PCR的引物组合和检测方法可以快速 地检测脊尾白虾单个个体在 3 个微卫星区的遗传变异， 通过聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱直观 地表现出个体的指纹图谱， 本发明。
19、可用于脊尾白虾的亲子鉴定和遗传多样性分析等。本发 明可广泛应用于脊尾白虾群体遗传标记筛选、 系谱认证、 遗传图谱构建等方面。 0035 以上实施例仅用以说明本发明的技术方案， 而非对其进行限制 ； 尽管参照前述实 施例对本发明进行了详细的说明， 对于本领域的普通技术人员来说， 依然可以对前述实施 例所记载的技术方案进行修改， 或者对其中部分技术特征进行等同替换 ； 而这些修改或替 换， 并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。 说 明 书 CN 102676689 A 5 1/2 页 6 SEQUENCE LISTING 中国水产科学研究院黄海水产研究所 一种脊尾白。
20、虾微卫星标记的 3 重 PCR 检测方法 6 PatentIn version 3.3 1 18 DNA 人工序列 1 aatatgcagt ggcaagct 18 2 18 DNA 人工序列 2 ttcccatcat cttcctcc 18 3 22 DNA 人工序列 3 ctttgcccct actaactgtt gc 22 4 22 DNA 人工序列 4 acgactgacc tgagaaatcc ct 22 序 列 表 CN 102676689 A 6 2/2 页 7 5 18 DNA 人工序列 5 ggctgtccct tggaacta 18 6 18 DNA 人工序列 6 acgaaatccg aataaccc 18 序 列 表 CN 102676689 A 7 1/1 页 8 图 1 说 明 书 附 图 CN 102676689 A 8 。