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1、(10)申请公布号 CN 102676692 A (43)申请公布日 2012.09.19 CN 102676692 A *CN102676692A* (21)申请号 201110407014.1 (22)申请日 2011.12.08 C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (71)申请人 中国人民解放军军事医学科学院基 础医学研究所 地址 100850 北京市海淀区太平路 27 号 (72)发明人 徐东刚 洪明 王圆圆 邢微微 (74)专利代理机构 北京众合诚成知识产权代理 有限公司 11246 代理人 史双元 (54。
2、) 发明名称 一种手足口病毒 EV71 核酸检测试剂盒 (57) 摘要 本发明公开了属于病毒检测技术领域的一种 手足口病毒 EV71 核酸检测试剂盒。该试剂盒由 N.BstNBI酶、 T7RNA聚合酶、 AMV反转录酶和RNase H、 NASBA反应液、 NASBA反应引物、 RIDA探针、 DEPC 水、 甲型流感病毒 HINI RNA、 乳癌细胞 MCF-7 总 RNA和EV71RNA组成。 本发明采用NASBA结合RIDA 技术检测手足口病毒 EV71 核酸序列， 具有灵敏， 特异， 简便， 快捷， 高效， 不依赖特殊仪器等优点。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 3。
3、 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 3 页 1/1 页 2 1. 一种手足口病毒 EV71 核酸检测试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒由 N.BstNBI 酶、 T7RNA 聚合酶、 AMV 反转录酶和 RNase H、 NASBA 反应液、 NASBA 反应引物、 RIDA 探针、 空白对 照、 阴性对照和阳性对照组成 ； 所述 NASBA 反应液由 dNTPs、 NTP、 ITP、 RNasin、 AMV 反转录 酶 Buffer、 T7RNA 聚合酶 Buffer、 RNase H Buffer、 DMSO、 山梨醇和 NEB b。
4、uffer 组成 ； 所述 NASBA 反应引物的核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO1 和 SEQ ID NO2 所示 ； 所述 RIDA 探针的 核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO3 所示。 2. 根据权利要求 1 所述一种手足口病毒 EV71 核酸检测试剂盒， 其特征在于， 所述空白 对照为 DEPC 水， 阴性对照为甲型流感病毒 HINI RNA 和 / 或乳癌细胞 MCF-7 总 RNA， 阳性对 照为手足口病毒 EV71RNA。 3. 根据权利要求 1 所述一种手足口病毒 EV71 核酸检测试剂盒， 其特征在于， 所述 RIDA 探针 5端标记荧光基团为 FAM， 3端标记荧。
5、光猝灭基团为 TAMARA。 4. 根据权利要求 1 所述一种手足口病毒 EV71 核酸检测试剂盒， 其特征在于， 所述 NEB buffer 为 NEB buffer 3。 权 利 要 求 书 CN 102676692 A 2 1/3 页 3 一种手足口病毒 EV71 核酸检测试剂盒 技术领域 0001 本发明属于病毒检测技术领域， 具体涉及一种手足口病毒EV71核酸检测试剂盒。 背景技术 0002 手足口病是由肠道病毒引起的传染病， 多发生于 5 岁以下儿童， 可引起手、 足、 口 腔等部位的疱疹， 少数患儿可引起心肌炎、 肺水肿、 无菌性脑膜脑炎等并发症。个别重症患 儿如果病情发展快， 。
6、导致死亡。 引发手足口病的肠道病毒有20多种， 柯萨奇病毒A组的16、 4、 5、 9、 10 型， B 组的 2、 5 型， 以及肠道病毒 71 型均为手足口病较常见的病原体， 其中以柯萨 奇病毒 A16 型 (Cox A16) 和肠道病毒 71 型 (EV 71) 最为常见。 0003 手足口病毒感染的特异性诊断方法有三种， 即病毒分离鉴定， 血清学检测技术以 及分子生物学技术。病毒的分离培养和血清学方法繁杂费时， 无法满足大量样本的快速诊 断。近年来分子生物学技术尤其以核酸等温扩增技术为基础的检测技术发展迅猛。传统 PCR 包括逆转录聚合酶链反应 (RT-PCR) 及实时荧光定量 PCR。
7、 技术在检测 EV71 病毒这类的 RNA 病毒时， 首先需要将其反转录成 cDNA， 一方面操作耗时， 另一方面 DNA 容易造成交叉污 染， 引起后续试验的假阳性， 此外传统 PCR 技术对仪器要求比较高， 不易在基层医院进行推 广。 0004 常用的核酸等温扩增技术有环介导等温扩增 (LAMP)， 序列依赖性等温扩增 (NASBA)， 核酸等温信号放大技术 (RIDA)。NASBA， 是由一对引物介导的， 连续均一的体外特 异的对单链 RNA 进行恒温扩增的方法， 可将模板 RNA 扩增约 109-12 倍。具有操作简便， 灵 敏度高， 污染小等优点， 不过传统的 NASBA 结果的判定。
8、易受温度， pH 值等因素的影响。 0005 RIDA 则是针对单链核酸标本利用特殊的探针收集荧光信号来判定是否存在目标 序列的一种新的核酸等温扩增技术。这一信号放大过程不存在扩增过程， 因此不会有扩增 产物的污染存在， 特异性较高， 但其灵敏度较低， 检测极限仅为 1012 拷贝 /ul。我们创新性 的将两种检测方法结合， 二者优势互补， 扬长避短， 可以快速， 简便， 灵敏， 特异的实现对病 原微生物的高通量检测及分型。 发明内容 0006 本发明的目的在于提供一种手足口病毒 EV71 核酸检测试剂盒。 0007 一种手足口病毒EV71核酸检测试剂盒， 所述试剂盒由N.BstNBI酶、 T。
9、7RNA聚合酶、 AMV 反转录酶和 RNase H、 NASBA 反应液、 NASBA 反应引物、 RIDA 探针、 DEPC 水、 甲型流感病 毒 HINI RNA、 乳癌细胞 MCF-7 总 RNA 和 EV71 RNA 组成 ； 所述 NASBA 反应液由 dNTPs、 NTP、 ITP、 RNasin、 AMV反转录酶Buffer、 T7 RNA聚合酶Buffer、 RNase H Buffer、 DMSO、 山梨醇和 NEB buffer 组成 ； 所述 NASBA 反应引物的核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO1 和 SEQ ID NO2 所示 ； 所述 RIDA 探针的核苷酸。
10、序列如序列表 SEQ ID NO3 所示。 0008 所述 RIDA 探针 5端标记荧光基团为 FAM， 3端标记荧光猝灭基团为 TAMARA。 0009 所述 NEB buffer 为 NEB buffer 3。 说 明 书 CN 102676692 A 3 2/3 页 4 0010 本发明的有益效果 ： 0011 本试剂盒首次将 NASBA 与 RIDA 两种技术进行了优化组合， 新技术的优势如下 ： 第 一， 单纯的扩增反应通过产生大量的核酸产物来实现对目标基因的检测， 该模式容易产生 污染， 而新方法通过扩增结合信号放大的模式来实现对目标基因的检测， 第一步扩增的过 程可以控制在很短的。
11、时间内， 使产物的量控制在一定范围之内， 然后通过后续的信号放大 系统来判定结果。由于 NASBA 扩增产物为 RNA 极易降解因 而污染的可能性相对较小同时 信号放大过程因为不存在扩增， 所以不会产生污染。 第二， 通过在RIDA技术之前引入NASBA 增强了 RIDA 的灵敏度， 同时两种方法的结合相对于单纯的扩增反应特异性有了很大提高， 即使第一步出现非特异扩增也可以通过第二步信号放大加以纠正。 再通过对反应时间的控 制(减少第二步反应时间)可以使得第二步反应即使单独出现非特异也不会有信号显示从 而也最大程度的降低了第二步反应出现非特异的可能性。 由于两步同时出现非特异的可能 性非常小，。
12、 特别是由于第一步扩增产物片段较小， 针对扩增产物的信号放大几乎不可能出 现非特异结果。所以这两种方法的结合是一种互补， 既提高了灵敏度也增强了特异性。第 三， 整个反应可以只需一个水浴锅和一个简易荧光检测器即可实现对结果的判定， 有利于 在基层医疗检疫机构推广。 0012 综上所述， 本试剂盒具有灵敏， 特异， 简便， 快捷， 高效， 不依赖特殊仪器等优势， 可 以实现对手足口病毒 EV71 的筛选及快速诊断， 便于在基层医院的推广。 具体实施方式 0013 下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。 0014 实施例 1 手足口病毒 EV71 核酸检测试剂盒的设计 0015 一种手足口病毒 。
13、EV71 核酸检测试剂盒， 采用如下实验设计而成 ： 0016 (1)RNA 提取 ： 取甲型流感病毒 HINI 培养液 ( 阴性对照 )1ml， 乳癌细胞 MCF-7 培养 液 ( 阴性对照 )1ml， 手足口病病毒 EV71 培养液 ( 阳性对照 )1ml， DEPC 水 ( 空白对照 )1ml ； RNA 提取采用 TAKARA 病毒核酸提取专用试剂盒， 提取方法参照说明书进行。提取到的核酸 样本利用紫外分光光度计测量浓度， 经过换算得到每微升拷贝数。 0017 (2)引物设计 ： 从Genebank下载核酸序列， 选择肠道病毒EV71 5端非编码区， 设 计合成 NASBA 引物， 引。
14、物的 Tm 值一般比复性温度高 7到 10。设计的引物及序列如下 ： 0018 P1 ： 5 -AATTCTAATACGACTCACTATAGGGCACCGGATGGCCAATCCA-3 (SEQ ID NO1) ； 0019 P2 ： 5 -GGTGTGAAGAGCCTATTGAG-3 (SEQ ID NO2) ； 0020 RIDA探针根据前一步NASBA扩增后的靶序列设计， 探针序列 ： 5-AGGCGTGTGGAGT CCCTAACCGACTG-3(SEQ ID NO3)5端标记荧光基团为FAM(购自TAkARA公司)， 3端标记 荧光猝灭基团为TAMARA(购自TAkARA公司)。 。
15、探针序列下划线部分为切刻内切酶N.BstNBI 对应的识别位点。 0021 引物由北京奥科生物公司合成。探针由 TAKARA 公司合成。 0022 (3) 反应步骤 ： 在 15L NASBA 混和物 ( 包含 1mmol/L dNTPs， 1mmol/L NTP， 0.5mmol/L ITP， P1 和 P2 引物各 0.4mol/L， 6U RNasin， 2.5L AMV 反转录酶 Buffer(NEB 公司 )， 2.5L T7 RNA 聚合酶 Buffer(NEB 公司 )， 1L RNase H Buffer(NEB 公司 ) 中加 入 1L 模版 ( 模版为甲型流感病毒 HINI。
16、 RNA， 乳癌细胞 MCF-7RNA， 手足口病病毒 EV71RNA 说 明 书 CN 102676692 A 4 3/3 页 5 或者 DEPC 水 )， 混匀后在水浴锅上 65加热 5min， 然后在 41温浴 5min。温浴结束后向溶 液中加入 0.08 U RNase H， 32U T7RNA 聚合酶， 4U AMV 反转录酶， 1L DMSO， 7.5mmol 山梨 醇， 50pmol/L RIDA 探针， 2L NEB buffer3， 5U N.BstNBI 酶 (NEB 公司 )。总反应体积达 到 20L。在水浴锅上 40反应 90min 后将温度调整为 55， 水浴加热 1。
17、0min。反应结束 后取出反应管放置在紫外下观察颜色变化。 0023 (4) 结果 ： 含有手足口病病毒 EV71 RNA 模板的反应管在紫外下发出绿色荧光， 其 余各个反应管均为淡红色。 0024 实施例 2 手足口病毒 EV71 核酸检测试剂盒的组成 0025 一种手足口病毒 EV71 核酸检测试剂盒包括 ： N.BstNBI 酶 500U、 T7 RNA 聚合酶 3200U、 AMV反转录酶400U、 RNase H 80U、 dNTPs 1mol、 NTP 1mol、 ITP 0.5mol、 RNasin 600U、 AMV反转录酶Buffer 500L、 T7 RNA聚合酶Buffe。
18、r500L、 RNase H Buffer 500L、 DMSO 500L、 山梨醇1mol和NEB buffer 3500L、 P1和P2引物各0.4mmol、 RIDA探针5000pmol、 DEPC水1ml、 甲 型流感病毒HINI RNA 1mg、 乳癌细胞MCF-7总RNA1mg和EV71 RNA1mg ； RIDA 探针 5端标记荧光基团为 FAM， 3端标记荧光猝灭基团为 TAMARA。 0026 实施例 3 手足口病毒 EV71 核酸检测试剂盒的检测效果 0027 取河北省疾病预防控制中心提供的 8 例手足口病患者血清样本以及 18 例健康志 愿者血清样本按照实施例 1 步骤 (3) 的检测方法和步骤 (4) 的判定方法， 对样本进行检测， 在各阴性、 空白对照检测管均为淡红色条件下， 阳性对照检测管及 8 例手足口病患者样本 检测管在紫外下均发出绿色荧光， 18 例健康志愿者血清样本检测管在紫外下均为淡红色。 该实验证实本试剂盒的检测准确率能达到 100。 说 明 书 CN 102676692 A 5 。