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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610031761.2 (22)申请日 2016.01.18 C12N 1/20(2006.01) C12R 1/41(2006.01) (71)申请人 黑龙江省科学院微生物研究所 地址 150010 黑龙江省哈尔滨市道里区兆麟 街 68 号 (72)发明人 于徳水 陈薇 沙长青 甄涛 于丽萍 王玉霞 张先成 赵晓宇 (74)专利代理机构 哈尔滨市伟晨专利代理事务 所 ( 普通合伙 ) 23209 代理人 荣玲 (54) 发明名称 一种慢生型大豆根瘤菌液体保护剂 (57) 摘要 本发明公开了一种慢生型大豆根瘤菌液体保 护剂， 其由 。
2、YMA 培养基、 蛋白胨、 黄原胶、 NaCl、 硼 酸制成， 其中 ： 蛋白胨的含量为0.10.2wt、 黄 原胶的含量为 0.01 0.02wt、 NaCl 的含量为 0.25 0.35wt、 硼酸的含量为 0 0.01wt。 本发明提供的慢生型大豆根瘤菌液体保护剂中既 有维持微生物渗透压的盐类、 糖类物质， 又有刺激 菌剂和大豆生长的蛋白质和微量元素， 还有能够 有效成膜、 促进根瘤菌在大豆表面形成比较优势 的蛋白类物质， 在实际应用中会形成占位优势， 抵 御土著根瘤菌的侵染， 增加有效结瘤数量， 提高接 种根瘤菌剂的使用效果。 与根瘤菌剂配伍使用， 可 以提高根瘤菌剂在土壤中的存活率，。
3、 能在大豆种 子表面形成比较优势， 抵御土著根瘤菌的竞争， 减 少无效结瘤。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书19页 CN 105524868 A 2016.04.27 CN 105524868 A 1.一种慢生型大豆根瘤菌液体保护剂， 其特征在于所述保护剂由YMA培养基、 蛋白胨、 黄原胶、 NaCl、 硼酸制成， 其中： 蛋白胨的含量为0.10.2wt、 黄原胶的含量为0.01 0.02wt、 NaCl的含量为0.250.35wt、 硼酸的含量为00.01wt。 2.根据权利要求1所述的慢生型大豆根瘤菌液体保护剂， 。
4、其特征在于所述蛋白胨的含 量为0.10.2wt、 黄原胶的含量为0.010.02wt、 NaCl的含量为0.250.35wt。 3.根据权利要求2所述的慢生型大豆根瘤菌液体保护剂， 其特征在于所述蛋白胨的含 量为0.18wt、 黄原胶的含量为0.015wt、 NaCl的含量为0.28wt。 4.根据权利要求2所述的慢生型大豆根瘤菌液体保护剂， 其特征在于所述蛋白胨的含 量为0.15wt、 黄原胶的含量为0.012wt、 NaCl的含量为0.33wt。 5.根据权利要求2所述的慢生型大豆根瘤菌液体保护剂， 其特征在于所述蛋白胨的含 量为0.13wt、 黄原胶的含量为0.011wt、 NaCl的含。
5、量为0.30wt。 6.根据权利要求1所述的慢生型大豆根瘤菌液体保护剂， 其特征在于所述蛋白胨的含 量为0.10.2wt、 黄原胶的含量为0.010.02wt、 NaCl的含量为0.250.35wt、 硼酸 的含量为0.0050.01wt。 7.根据权利要求6所述的慢生型大豆根瘤菌液体保护剂， 其特征在于所述蛋白胨的含 量为0 .18wt、 黄原胶的含量为0 .015wt、 NaCl的含量为0 .28wt、 硼酸的含量为 0.008wt。 8.根据权利要求6所述的慢生型大豆根瘤菌液体保护剂， 其特征在于所述蛋白胨的含 量为0 .15wt、 黄原胶的含量为0 .012wt、 NaCl的含量为0 。
6、.33wt、 硼酸的含量为 0.1wt。 9.根据权利要求6所述的慢生型大豆根瘤菌液体保护剂， 其特征在于所述蛋白胨的含 量为0 .13wt、 黄原胶的含量为0 .018wt、 NaCl的含量为0 .30wt、 硼酸的含量为 0.007wt。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105524868 A 2 一种慢生型大豆根瘤菌液体保护剂 技术领域 0001 本发明涉及一种大豆根瘤菌保护剂。 背景技术 0002 在大豆生产过程中使用根瘤菌接种剂是一项成熟的技术， 在增加产量、 提高大豆 品质等方面已得到广泛的认可。 据文献报道国外使用根瘤菌接种剂的大豆田占总播种面积 的3050， 有些国家可以达到。
7、70以上甚至更高； 而我国接种根瘤菌剂的面积仅占播种 面积的13。 近年来黑龙江省政府为加快推广大豆根瘤菌技术， 促进大豆增产提质、 节本 增效， 每年拿出500万元财政资金， 在全省大豆主产区以补贴和自筹相结合的方式推广大豆 根瘤菌接种剂技术， 并结合大豆高产创建、 科技示范园区建设、 大豆测土配方施肥等办法推 动大豆优质化生产。 国内从事根瘤菌研究的机构和人员不胜枚举， 研究的方向、 领域和取得 的科研成果数不胜数， 但实际应用却少得可怜。 根瘤菌剂应用不广泛的原因有很多， 其中一 个主要原因就是大豆根瘤菌剂产品在土壤中不能形成比较优势， 在土壤中的存活率低， 与 土著根瘤菌相比竞争力弱，。
8、 造成使用效果不理想。 在使用根瘤菌接种剂的同时配伍使用保 护剂可以解决这一问题。 0003 作为中国绿色大豆的主产区， 近年来黑龙江省始终保持每年4000万亩左右的大豆 种植面积， 农垦九三管理局和黑河地区作为全国非转基因大豆主产区， 多年来始终致力于 绿色大豆产业发展， 先后投入10亿多元用于绿色大豆标准化基地建设， 建立非转基因大豆 核心示范区。 目前这一区域内大豆种植面积在2000万亩以上， 年产量达到200万吨以上。 但 根瘤菌剂的应用还很少， 仅占播种面积的2左右， 根瘤菌剂应用前景广阔。 0004 大豆根瘤菌剂保护剂是一种与根瘤菌剂配合使用的活性物质， 对根瘤菌剂具有营 养和保护。
9、作用， 并能够促进根瘤菌剂在大豆种子表面成膜和保持一定的种群优势， 提高根 瘤菌剂的使用效果。 由于根瘤菌的多样性， 针对每一种根瘤菌剂， 应该有专门的保护剂。 0005 目前， 对根瘤菌剂保护剂的研究报道还不多见。 而且大部分研究的重心放在了对 菌剂的保存期和保藏效果上， 而不是提高大豆种子表面成膜能力、 形成菌群优势、 促进结瘤 等方面。 发明内容 0006 本发明利用响应面法研究具有根瘤菌保护作用的蛋白类、 盐类、 糖类和微量元素 类物质， 通过不同种类、 不同组合、 不同配比、 不同浓度的比较分析， 在实验室中模拟实际应 用条件， 提供一种具有提高根瘤菌存活率和存活时间作用的慢生型大豆。
10、根瘤菌液体保护 剂。 0007 本发明的目的是通过以下技术方案实现的： 0008 一种慢生型大豆根瘤菌液体保护剂， 由YMA培养基、 蛋白胨、 黄原胶、 NaCl、 硼酸制 成， 其中： 蛋白胨的含量为0.10.2wt、 黄原胶的含量为0.010.02wt、 NaCl的含量为 0.250.35wt、 硼酸的含量为00.01wt。 说明书 1/19 页 3 CN 105524868 A 3 0009 按照质量比由混合而成。 0010 本发明具有如下优点： 0011 1、 本发明提供的慢生型大豆根瘤菌液体保护剂中既有维持微生物渗透压的盐类、 糖类物质， 又有刺激菌剂和大豆生长的蛋白质和微量元素， 。
11、还有能够有效成膜、 促进根瘤菌 在大豆表面形成比较优势的蛋白类物质， 在实际应用中会形成占位优势， 抵御土著根瘤菌 的侵染， 增加有效结瘤数量， 提高接种根瘤菌剂的使用效果。 0012 2、 与根瘤菌剂配伍使用， 可以提高根瘤菌剂在土壤中的存活率， 能在大豆种子表 面形成比较优势， 抵御土著根瘤菌的竞争， 减少无效结瘤， 为最终实现大豆根瘤菌剂的大面 积推广与应用， 提高我省大豆产量和品质打下基础。 具体实施方式 0013 下面对本发明的技术方案作进一步的说明， 但并不局限于此， 凡是对本发明技术 方案进行修改或者等同替换， 而不脱离本发明技术方案的精神和范围， 均应涵盖在本发明 的保护范围中。
12、。 0014 具体实施方式一： 本实施方式提供的慢生型大豆根瘤菌液体保护剂由YMA培养基 (磷酸氢二钾0.5g， 硫酸镁0.2g， 氯化钠0.1g， 酵母提取物0.4g， 甘露醇10g， 琼脂20g， pH7.0， 蒸馏水1000ml)、 蛋白胨、 黄原胶、 NaCl、 硼酸制成， 其中： 蛋白胨的含量为0.10.2wt、 黄 原胶的含量为0 .010 .02wt、 NaCl的含量为0 .250 .35wt、 硼酸的含量为0 0.01wt。 0015 具体实施方式二： 本实施方式与具体实施方式一不同的是， 蛋白胨的含量为0.1 0.2wt、 黄原胶的含量为0.010.02wt、 NaCl的含量。
13、为0.250.35wt。 0016 具体实施方式三： 本实施方式与具体实施方式二不同的是， 蛋白胨的含量为 0.18wt、 黄原胶的含量为0.015wt、 NaCl的含量为0.28wt混合而成。 0017 具体实施方式四： 本实施方式与具体实施方式二不同的是， 蛋白胨0.15wt、 黄原 胶0.012wt、 NaCl0.33wt混合而成。 0018 具体实施方式五： 本实施方式与具体实施方式一不同的是， 蛋白胨的含量为0.1 0.2wt、 黄原胶的含量为0.010.02wt、 NaCl的含量为0.250.35wt、 硼酸的含量为 0.0050.01wt。 0019 具体实施方式六： 本实施方式。
14、与具体实施方式五不同的是， 蛋白胨的含量为 0.18wt、 黄原胶的含量为0.015wt、 NaCl的含量为0.28wt、 硼酸的含量为0.008wt。 0020 具体实施方式七： 本实施方式与具体实施方式五不同的是， 本蛋白胨的含量为 0.15wt、 黄原胶的含量为0.012wt、 NaCl的含量为0.33wt、 硼酸的含量为0.1wt。 0021 具体实施方式八： 本实施方式提供了一种慢生型大豆根瘤菌液体保护剂， 通过对 血清蛋白和蛋白胨等蛋白类物质， 氯化钠、 氯化钾和氯化钙等盐类， 黄原胶、 葡萄糖、 蔗糖、 海藻糖等糖类， 钼酸铵、 硼酸等微量元素进行单因素比较研究， 以根瘤菌存活时。
15、间和存活率 为指标， 确定各单因素的种类和浓度。 采用响应面法进行统计分析， 复配保护剂配方， 通过 盆栽实验验证， 筛选保护剂组合。 具体内容如下： 0022 1.试验材料与方法 0023 1.1试验材料 说明书 2/19 页 4 CN 105524868 A 4 0024 1.1.1培养基 0025 YM培养基： 磷酸氢二钾0.5g， 硫酸镁0.2g， 氯化钠0.1g， 酵母提取物0.4g， 甘露醇 10g， pH7.0， 蒸馏水1000ml。 0026 YMA培养基： 磷酸氢二钾0.5g， 硫酸镁0.2g， 氯化钠0.1g， 酵母提取物0.4g， 甘露醇 10g， 琼脂20g， pH7.。
16、0， 蒸馏水1000ml。 0027 1.1.2供试菌种 0028 慢生型大豆根瘤菌； 大豆品种： 黑河43号。 0029 1.2试验方法 0030 1.2.1慢生型大豆根瘤菌活化 0031 取一环于-80保存的慢生型大豆根瘤菌， 接种到装有5mL的YM液体培养基的试管 中， 于28， 180rpm培养3d。 用接种环将慢生型大豆根瘤菌菌液划线接种到YMA平板上， 28 放置恒温培养箱， 倒置静止培养7d左右直至出现单菌落为止。 再挑取单菌落接种到YM液体 培养基中， 28， 180rpm培养3d待用。 0032 1.2.2慢生型大豆根瘤菌发酵培养 0033 挑取一环新鲜的平板种子接种于250。
17、ml的三角瓶中， 装液量为30ml， 28180rpm振 荡培养3d后， 以2的接种量接种于500ml的三角瓶中， 装液量为100ml， 28180rpm振荡培 养3d后分装到试管中， 每支试管10ml。 0034 1.3活菌计数 0035 平板菌落计数法： 取100ul慢生型大豆根瘤菌菌液样品， 加入装有900ul无菌水的 离心管中， 即为10-1稀释液， 再用200ul移液枪吸取10-1稀释液100ul移入装有900ul无菌水 的离心管中， 即为10-2稀释液， 以此类推， 一定要注意每次更换枪头， 制成10-3、 10-4、 10-5、 10 -6、 10-7、 10-8等一系列稀释度的。
18、菌液， 供平板计数使用。 分别涂布平板， 28培养7d后计数。 0036 1.4筛选显著因子 0037 采用不同种类、 不同配比进行单因素、 两因素、 三因素和四因素试验， 对蛋白类、 盐 类、 糖类和微量元素四大类， 12种化合物， 即牛血清蛋白、 蛋白胨、 黄原胶、 海藻糖、 蔗糖、 葡 萄糖、 羧甲基纤维素钠、 NaCl、 KCl、 CaCl2、 钼酸铵、 硼酸进行全面考察。 选择12因子6水平的 试验设计， 每个因子取6个水平， 使水平成梯度变化， 检测各梯度下的有效活菌数， 从而确定 最大响应面值的区域， 筛选出显著因子及最佳终浓度， 最终筛选组合获得效果较好的配方。 0038 表1。
19、-1不同种化合物 0039 说明书 3/19 页 5 CN 105524868 A 5 0040 表1-2设计因子与水平 0041 0042 0043 1.5响应面分析 0044 确定了影响慢生型大豆根瘤菌的各主要因子， 爬坡实验确定了3-4个主要因子响 应区域的中心点， 在主要因子的响应区各取3-4个水平， 设计3因素3水平和4因素3水平的响 应面分析试验。 0045 1.6数据分析 0046 一个处理包含3个平行试验， 取值为3个平行试验的均值。 Plackett-Burman设计采 用Minitab16软件完成， Box-Behnken设计的响应面分析由Design-Expert8.0完。
20、成。 0047 1.7保护剂对根瘤菌的作用效果 0048 将四种经响应面分析优化后的最佳终浓度的配比分别将培养好的慢生型大豆根 瘤菌菌液与四种保护剂混合， 在室温条件下放置6个月， 检测活菌数， 评价保护剂对慢生型 大豆根瘤菌的作用效果。 0049 1.8温室盆栽试验 0050 将最终筛选效果较好的配方进行温室盆栽试验， 试验共设4个处理和1个对照， 每 个处理3次重复， 在温室条件下， 模拟自然土壤环境进行盆栽试验验证。 取培养好的慢生型 大豆根瘤菌发酵液分别与不同配方的保护剂进行混合并对大豆进行拌种， 将拌种后的大豆 种子栽培到花盆中， 每盆播种三粒大豆种子， 2个月后初荚期(R3)对主根。
21、根瘤数、 侧根根瘤 说明书 4/19 页 6 CN 105524868 A 6 数、 总根瘤数、 株高、 植株干重等指标进行检测。 0051 取50粒与不同种保护剂拌菌后的种子置于含有50ml无菌水的125ml摇瓶中， 200rpmmin-1震荡30分钟， 以平板计数法检测每粒大豆种子表面的活菌数。 0052 2、 结果与分析 0053 2.1筛选显著因子 0054 2.1.1单因素 0055 2.1.1.1蛋白类 0056 表2-1蛋白类各水平活菌数 0057 0058 单因素试验是同一批次进行的， 故每个因子的对照都是相同的， 对照1为在室温放 置1个月后的未加化合物慢生型大豆根瘤菌的活菌。
22、数为2.429108cfu/mL； 对照2为新鲜培 养基对数期的活菌数为4.235109cfu/mL。 由表2-1可见， 牛血清蛋白在终浓度为0.05时 活菌数最高为2.311108cfu/mL， 蛋白胨在终浓度为0.1时活菌数最高为2.331108cfu/ mL。 0059 2.1.1.2糖类 0060 表2-2糖类各水平活菌数 0061 说明书 5/19 页 7 CN 105524868 A 7 0062 0063 由表2-2可见， 黄原胶在终浓度为0.01时活菌数最高为1.910108cfu/mL， 海藻 糖在终浓度为1.8时活菌数最高为1.886108cfu/mL， 蔗糖在终浓度为0.。
23、2时活菌数最 高为2.009108cfu/mL， 葡萄糖在终浓度为1.4时活菌数最高为2.009108cfu/mL， 羧甲 基纤维素钠在终浓度为0.01时活菌数最高为2.219108cfu/mL。 0064 2.1.1.3盐类 0065 表2-3盐类各水平活菌数 0066 说明书 6/19 页 8 CN 105524868 A 8 0067 0068 由表2-3可见， NaCl在终浓度为0.30时活菌数最高为2.311108cfu/mL， KCl在 终浓度为0.15时活菌数最高为2.086108cfu/mL， CaCl2在终浓度为0.15时活菌数最高 为2.107108cfu/mL。 0069。
24、 2.1.1.4微量元素 0070 表2-4微量元素各水平活菌数 0071 0072 由表2-4可见， 钼酸铵在终浓度为0.03时活菌数最高为2.051108cfu/mL， 硼酸 在终浓度为0.005时活菌数最高为2.086108cfu/mL。 0073 综上所述， 表2-5为各因子中最佳终浓度的数值， 进行两因素试验。 0074 表2-5单因素最佳终浓度 0075 说明书 7/19 页 9 CN 105524868 A 9 0076 0077 2.1.2两因素 0078 2.1.2.1蛋白类和糖类 0079 表2-6蛋白和糖类组合的活菌数 0080 说明书 8/19 页 10 CN 1055。
25、24868 A 10 0081 两因素试验是同一批次进行的， 故每组的对照都是相同的， 对照1为在室温放置1 个月后的未加化合物慢生型大豆根瘤菌的活菌数为2.298108cfu/mL； 对照2为新鲜培养 基对数期的活菌数为4.176109cfu/mL。 由表2-6可见， 在蛋白类和糖类的组合中蛋白胨+ 黄原胶的活菌数最高为2.530108cfu/mL， 牛血清蛋白+黄原胶数值位为2.465108cfu/ mL。 0082 2.1.2.2蛋白类和盐类 0083 表2-7蛋白和盐类组合的活菌数 0084 0085 由表2-7可见， 在蛋白类和盐类的组合中牛血清蛋白+CaCl2的活菌数最高为2.66。
26、2 108cfu/mL。 0086 2.1.2.3蛋白类和微量元素 说明书 9/19 页 11 CN 105524868 A 11 0087 表2-8蛋白和微量元素组合的活菌数 0088 0089 由表2-8可见， 在蛋白类和微量元素的组合中蛋白胨+硼酸的活菌数最高为2.379 108cfu/mL。 0090 2.1.2.4糖类和盐类 0091 表2-9糖类和盐类组合的活菌数 0092 0093 0094 由表2-9可见， 在糖类和盐类的组合中黄原胶+KCl的活菌数最高为2.72108cfu/ 说明书 10/19 页 12 CN 105524868 A 12 mL个。 0095 2.1.2.5。
27、糖类和微量元素 0096 表2-10糖类和微量元素组合的活菌数 0097 0098 由表2-10可见， 在糖类和微量元素的组合中羧甲基纤维素钠+硼酸的活菌数最高 为2.621108cfu/mL。 0099 2.1.2.6盐类和微量元素 0100 表2-11盐类和微量元素组合的活菌数 0101 0102 0103 由表2-11可见， 在盐类和微量元素的组合中NaCl+硼酸的活菌数最高为2.783 108cfu/mL。 0104 综上所述， 蛋白和多糖的组合中， 蛋白胨+黄原胶和牛血清蛋白+黄原胶数值高于 说明书 11/19 页 13 CN 105524868 A 13 其他组合， 选择蛋白胨、 。
28、牛血清蛋白、 黄原胶继续进行三因素试验； 在盐类方面， 三种盐没有 一种显著高于其他的， 所以都将进行三因素试验； 在微量元素方面， 硼酸与各类化合物组合 都高于钼酸铵， 选择硼酸进行下面的试验。 0105 2.1.3三因素 0106 表2-12三因素组合的活菌数 0107 0108 三因素试验是同一批次进行的， 故每组的对照都是相同的， 对照1为在室温放置1 个月后的未加化合物慢生型大豆根瘤菌的活菌数为2.236108cfu/mL； 对照2为新鲜培养 基对数期的活菌数为4.218109cfu/mL。 由表2-12可见， 在三因素的组合中蛋白胨+黄原胶 +NaCl为3.203108cfu/mL。
29、， 选择蛋白胨、 黄原胶、 NaCl作为显著因子， 将其与硼酸组合进行 四因素试验。 0109 2.1.4四因素 0110 表2-13四因素组合的活菌数 0111 说明书 12/19 页 14 CN 105524868 A 14 0112 四因素试验是同一批次进行的， 故每组的对照都是相同的， 对照1为在室温放置1 个月后的未加化合物慢生型大豆根瘤菌的活菌数为2.339108cfu/mL； 对照2为新鲜培养 基对数期的活菌数为4.306109cfu/mL。 由表2-13可见， 在四因素的组合中蛋白胨+黄原胶 +NaCl+硼酸的活菌数最高为3.322108cfu/mL。 0113 综上所述， 随。
30、着化合物种类的增加菌数也在增加， 在三因素和四因素中选取2个效 果较好的配方， 通过响应面法对2种保护剂配方进行优化。 四种配方分别为： 0114 1)蛋白胨+黄原胶+NaCl 0115 2)蛋白胨+黄原胶+NaCl+硼酸 0116 2.2响应面分析 0117 2.2.1蛋白胨+黄原胶+NaCl配方优化 0118 表2-14响应面试验设计与结果 0119 0120 说明书 13/19 页 15 CN 105524868 A 15 0121 表2-15响应面试验设回归分析 0122 说明书 14/19 页 16 CN 105524868 A 16 0123 0124 ProbF小于0.0500的。
31、值表示模型项显著， 大于0.1000表明模型项不显著由方差分 析结果可以看出， 该模型的一次项中的A， 二次项中的A2、 B2， 和交互作用的AB对有效活菌数 的影响都是显著的； 回归模型的P值为0 .0239， 表明模型是显著的， 而失拟项的P值为 0.0809， 失拟不显著； 模型的决定系数R20.8632， 说明模型达到较好的拟合程度。 经分析 软件回归拟合得到该模型的回归方程： R16.33+0.059A+0.035B-0.040C+0.088AB+ 0.022AC+9.750E-003BC-0.080A2-0.097B2-0.062C2 0125 为解得该回归方程的极值点， 对其各自。
32、变量分别求一阶偏导， 得到三元一次方程 组， 解出该模型的极值点， 从而计算出对应因素的取值： 蛋白胨0.13、 黄原胶0.011、 NaCl0.30， 此时模型的理论最优有效活菌数为3.180108cfu/mL。 0126 根据响应面分析结果， 慢生型大豆根瘤菌有效活菌数最优极值点为终浓度， 蛋白 胨0.13、 黄原胶0.011、 NaCl0.30预测最优值为3.180108cfu/mL。 为了验证这一结 果的有效性， 按照上述分析结果进行重复试验， 检测结果为3.1850.21108cfu/mL与预 测值相近， 说明了该模型拟合的有效性。 0127 2.2.2蛋白胨+黄原胶+NaCl+硼酸。
33、配方优化 0128 表2-16响应面试验设计与结果 0129 0130 说明书 15/19 页 17 CN 105524868 A 17 0131 表2-17响应面试验设回归分析 说明书 16/19 页 18 CN 105524868 A 18 0132 0133 ProbF小于0.0500的值表示模型项显著， 大于0.1000表明模型项不显著由方差分 析结果可以看出， 该模型的一次项中的A， 二次项中的A2对有效活菌数的影响都是显著的； 而交互作用对有效活菌数的影响不显著； 回归模型的P值0.0001， 表明模型是显著的， 而 失拟项的P值为0.6210， 失拟不显著； 模型的决定系数R20。
34、.9201， 说明模型达到较好的拟 合程度。 经分析软件回归拟合得到该模型的回归方程： 0134 R16.24+0.056A-1.583E-003B-4.333E-003C+0.011D+3.500E-003AB-3.750E- 003AC-0.033AD+0.011BC-0.034BD+2.000E-003CD-0.14A2-9.750E-004B2-2.100E-003C2+ 3.150E-003D2 说明书 17/19 页 19 CN 105524868 A 19 0135 为解得该回归方程的极值点， 对其各自变量分别求一阶偏导， 得到四元一次方程 组， 解出该模型的极值点， 从而计算出。
35、对应因素的取值： 蛋白胨0.13、 黄原胶0.018、 NaCl0.30、 硼酸0.007此时模型的理论最优有效活菌数为3.316108cfu/mL。 0136 根据响应面分析结果， 慢生型大豆根瘤菌有效活菌数最优极值点为终浓度， 蛋白 胨0.13、 黄原胶0.018、 NaCl0.30、 硼酸0.007预测最优值为3.316108cfu/mL。 为 了验证这一结果的有效性， 按照上述分析结果进行重复试验， 检测结果为3.3040.25 108cfu/mL与预测值相近， 说明了该模型拟合的有效性。 0137 2.3保护剂作用效果 0138 分别将培养好的慢生型大豆根瘤菌菌液与两种保护剂混合， 。
36、在室温条件下放置6 个月， 检测活菌数， 评价保护剂对慢生型大豆根瘤菌的作用效果。 结果如表2-18所示。 0139 表2-18储存时间对各处理活菌数的影响 0140 0141 注： 表中数据为3次试验重复结果平均值标准误差， 同一列的不同字母表示差异 显著(p0.05) 0142 处理1为蛋白胨0.13、 黄原胶0.011、 NaCl0.30； 处理2为蛋白胨0.13、 黄 原胶0.018、 NaCl0.30、 硼酸0.007； 处理3(CK)为未加任何保护剂的原菌液。 0143 由表2-18可见， 原菌液为新鲜培养基对数期的活菌数， 各处理及对照活菌数都在 4.1109cfu/mL以上； 。
37、放置6个月后各处理及对照活菌数有所下降， 各处理间差异不显著， 但各处理与对照相比差异显著， 对照活菌数为2.458108cfu/mL， 经保护剂作用后两个配 方的活菌数都在3.1108cfu/mL以上， 与对照相比存活率提高25以上。 0144 2.4温室中不同保护剂对根瘤产生的影响 0145 在温室条件下进行盆栽试验， 在R3期进行根瘤、 干重等数据检测， 结果见表2-19。 0146 表2-19温室盆栽试验结果 0147 说明书 18/19 页 20 CN 105524868 A 20 0148 注： 表中数据为3次试验重复结果平均值标准误差， 同一列的不同字母表示差异 显著(p0.05。
38、) 0149 处理1为蛋白胨0.13、 黄原胶0.011、 NaCl0.30； 处理2为蛋白胨0.13、 黄 原胶0.018、 NaCl0.30、 硼酸0.007； 处理3为未加任何保护剂的原菌液。 通过表2-19 可见， 各处理间的株高、 主根根瘤干重、 侧根根瘤干重、 植株干重及表面有效活菌数与对照 相比无显著差异， 但均高于对照； 处理2的主根根瘤数和侧根根瘤数与对照相比差异显著； 各处理主根根瘤数与对照相比均提高10以上； 说明添加保护剂的根瘤菌株高、 结瘤数、 干 重及种子表面有效活菌数方面均好于未添加保护剂的根瘤菌。 0150 3.结论与讨论 0151 1、 确定单因素中各因子的最。
39、佳终浓度， 蛋白类的蛋白胨在终浓度为0.1时活菌 数最高为2.331108cfu/mL； 糖类的羧甲基纤维素钠在终浓度为0.01时活菌数最高为 2.219108cfu/mL； 盐类的NaCl在终浓度为0.30时活菌数最高为2.311108cfu/mL； 微量 元素类的硼酸在终浓度为0.005时活菌数最高为2.086108cfu/mL。 0152 2、 确定两因素中各因子中的显著因子， 蛋白和多糖的组合， 蛋白胨+黄原胶和牛血 清蛋白+黄原胶的活菌数分别为2.530108cfu/mL和2.465108cfu/mL； 高于其他组合， 蛋 白类选择蛋白胨、 牛血清蛋白； 多糖类选择黄原胶； 盐类中三。
40、种盐中无显著的， 都将被选择； 微量元素选择硼酸， 硼酸与各类化合物组合均高于钼酸铵。 0153 3、 确定三因素中各因子中的显著因子， 其中蛋白胨+黄原胶+NaCl为3.203 108cfu/mL； 确定蛋白胨、 黄原胶、 NaCl是显著因子， 将其与硼酸组合进行四因素试验。 0154 4、 在四因素的组合中蛋白胨+黄原胶+NaCl+硼酸的活菌数最高为3.322108cfu/ mL。 0155 5、 随着化合物种类的增加菌数也在增加， 在三因素和四因素中选取2个效果较好 的配方， 通过响应面法对2种保护剂配方进行优化。 两种配方分别为： 蛋白胨+黄原胶+NaCl； 蛋白胨+黄原胶+NaCl+。
41、硼酸。 0156 6、 本发明采用筛选显著因子试验中从12个组分中筛选出4个显著因子： 蛋白胨、 黄 原胶、 NaCl、 硼酸， 获得最大响应值的稳定响应区， 并用响应面分析法的Box-Behnken设计确 定显著因子的最优终浓度的两个配比： 0157 1)蛋白胨0.13、 黄原胶0.011、 NaCl0.30， 检测结果为3.1850.21 108cfu/mL； 0158 2)蛋白胨0.13、 黄原胶0.018、 NaCl0.30、 硼酸0.007， 检测结果为3.304 0.25108cfu/mL。 0159 7、 常温条件下放置6个月后根瘤菌剂的存活率， 对照活菌数为2.458108cfu/mL， 经保护剂作用后两个配方的活菌数都在3.1108cfu/mL以上， 与对照相比存活率提高25 以上， 说明经筛选后的保护剂配方可以有效的提高根瘤菌的存活率。 0160 8、 两种优化配方后的保护剂在根瘤菌的株高、 主根结瘤数、 侧根结瘤数、 植株干重 及种子表面有效活菌数方面均好于未添加保护剂的根瘤菌， 其中处理2的主根根瘤数和侧 根根瘤数与对照相比差异显著； 各处理主根根瘤数与对照相比均提高10以上。 说明书 19/19 页 21 CN 105524868 A 21 。