一种从木材中分离和纯化纤维素的高效复合酶方法.pdf

本发明涉及一种从木材中分离和纯化纤维素的高效复合酶方法，其采用生物处理方法降解分离植物材料中的木质素，从而得到纤维素，其反应条件温和，仅少量使用化学试剂，产生的废水量少，污水处理量小，生产成本低；其包括以下步骤：1.木材原料的预处理；2.预处理木质纤维素的酶解；3.纤维素处理液的纯化。

1、  一种从木材中分离和纯化纤维素的高效复合酶方法，其特征在于：其包括以下步骤：
(1)、木材原料的预处理：将木材原料洗净后削面为1cm～2cm大小，用超声波灭菌器进行灭菌处理，随后投入降解池中，加水浸投，将其润胀，得到预处理木质素纤维素；
(2)、预处理木质纤维素的酶解：在所述预处理木质纤维素中加入高效复合酶，投料比为50:1～45:1(体积比)，常温常压下酶解28～36小时，即获得木质纤维素处理液，其中木质素得以完全降解，纤维素、木质素以及半纤维素呈半分离状态；
(3)、纤维素处理液的纯化：往木质纤维素处理液中加入三氯甲烷，投料比为2:1～1.5:1(体积比)，混合萃取6～8小时，分离后移出三氯甲烷，三氯甲烷层中为木质素，萃取率为90～96％。纤维素处理液中的纤维素得率为89～95％，纯度为85～90％。

2、  根据权利要求1所述的一种从木材中分离和纯化纤维素的高效复合酶方法，其特征在于：所述高效复合酶为以下各材料的混合物(g/L)：复合酶液800～1000mL，KH₂PO₄ 0.3～0.5g，NH₄Cl 1～1.2g，MnSO₄ 0.5～0.8g，CuSO₄ 0.3～0.5g，软腐菌95～100g，定容至1L。

3、  根据权利要求2所述的一种从木材中分离和纯化纤维素的高效复合酶方法，其特征在于：所述复合酶的制备：在琼脂培养基中接入单色下皮黑菌(Cerrenaunicolor)、变色栓菌(Trametes versicolor)和黄孢原毛平革菌(Phanerochaetchrysosporium EM-446)，在35℃下培养10～12天，从琼脂表面移出1cm²～2cm²的菌丝体，接种到盛有2000mL营养培养基的5000mL三角瓶中，35℃下培养4天～5天，匀浆，将该培养液转移至盛有50L主培养基的培养器中，振摇，35℃下培养5天～7天，离心后取上清液，即为木质纤维素复合酶，其中木质素过氧化物酶(Lignin peroxidase，简称LiP)为2500U/L～3000U/L，锰过氧化物酶(Manganese-dependent peroxidase，简称MnP)为800U/L～1200U/L，漆酶(Laccase)为60000U/L～130000U/L。

4、  根据权利要求3所述的一种从木材中分离和纯化纤维素的高效复合酶方法，其特征在于：所述琼脂培养基为包含以下质量份数的材料混合物(g/L)：NaNO₃ 1.8g/L～2.0g/L，K₂HPO₄ 0.4g/L～0.6g/L，KCl 0.4g/L～0.6g/L，MgSO₄ 0.4g/L～0.6g/L，FeSO₄ 0.008g/L～0.012g/L，琼脂12g/L～18g/L，木质素磺酸钙12g/L～18g/L，青霉素0.001g/L～0.003g/L，调pH至6.5～6.8，定容至1L。

5、  根据权利要求3所述的一种从木材中分离和纯化纤维素的高效复合酶方法，其特征在于：所述营养培养基为包含以下质量份数的材料混合物(g/L)：葡萄糖8～12g，蛋白胨0.2～0.3g，酵母抽提物0.3～0.5g，KH₂PO₄ 0.8～1.2g，Na₂HPO₄·12H₂O 0.2～0.3g，MgSO₄·7H₂O 0.5～0.8g，定容至1L。

6、  根据权利要求3所述的一种从木材中分离和纯化纤维素的高效复合酶方法，其特征在于：所述主培养基为包含以下质量份数的材料混合物(g/L)：麸皮180～220g，木屑750～850g，蛋白胨0.3～0.5g，酵母抽提物0.5～0.8g，Na₂HPO₄·12H₂O0.2～0.4g，MgSO₄·7H₂O 0.4～0.7g，KH₂PO₄ 0.8～1.2g，定容至1L。

一种从木材中分离和纯化纤维素的高效复合酶方法
技术领域
本发明涉及纤维素的分离纯化生产领域，具体为一种从木材中分离和纯化纤维素的高效复合酶方法。
背景技术
能源短缺问题是本世纪人类面临的重大难题之一，当前各国竞相开发酒精作为汽油的替代品，目前酒精多采用淀粉转化法制备，每生产1吨酒精就需要3.3吨～3.5吨淀粉，其生产成本高，从而产生与人争粮的局面。采用木材等可再生生物纤维素生产酒精是国际科研攻关的重点方向之一，该技术体系主要由两大步骤组成：第一步，获得纤维素；第二步，由纤维素生产酒精。工业上，纤维素经酸解或酶解预处理后，生成的葡萄糖可进入乙醇发酵的途径。半纤维素经水解产生的木糖可有效降低乙醇的生产成本，但木质素不能转化为乙醇，但其存在对后续发酵生产乙醇有一定负面影响。
木质纤维素的结构比较复杂，细胞壁中的半纤维素和木质素通过共价键联结成网络结构，纤维素镶嵌其中。木质素是由苯基丙烷结构单元通过碳碳键连接而成的高分子复合的芳香类聚合物，木质素不能水解为单糖，在纤维素周围形成保护层，防止酸或酶进入纤维素和半纤维素的区域，影响纤维素的水解。因此，高效利用纤维素的关键在于破坏木质纤维素的网状结构，使纤维素和木质素、半纤维素分离。现代工业依靠一些物理化学方法除去木质素，如机械破碎、酸碱处理、有机溶剂处理等方法，这些方法涉及高压设备或经常使用一些腐蚀性试剂，耗能大且产生大量废水，废水如不经处理直接排放会严重污染环境，而废水处理费用昂贵，故生产成本相当高。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了一种从木材中分离和纯化纤维素的高效复合酶方法，其采用生物处理方法降解分离植物材料中的木质素来得到纤维素，其反应条件温和，使用化学试剂少，不会产生大量废水，大大降低了废水处理费用，节约了成本。
其特征在于：其包括以下步骤：
1、木材原料的预处理：将木材原料洗净后削面为1cm～2cm大小，用超声波灭菌器进行灭菌处理，随后投入降解池中，加水浸投，将其润胀，得到预处理木质素纤维素；
2、预处理木质纤维素的酶解：在所述预处理木质纤维素中加入高效复合酶，投料比为50:1～45:1(体积比)，常温常压下酶解28～36小时，即获得木质纤维素处理液，其中木质素得以完全降解，纤维素、木质素以及半纤维素呈半分离状态；
3、纤维素处理液的纯化：往木质纤维素处理液中加入三氯甲烷，投料比为2:1～1.5:1(体积比)，混合萃取6～8小时，分离后移出三氯甲烷，三氯甲烷层中为木质素，萃取率为90～96％。纤维素处理液中的纤维素得率为89～95％，纯度为85～90％。
其进一步特征在于：所述高效复合酶为以下各材料的混合物(g/L)：复合酶液800～1000mL，KH₂PO₄ 0.3～0.5g，NH₄Cl 1～1.2g，MnSO₄ 0.5～0.8g，CuSO₄0.3～0.5g，软腐菌95～100g，定容至1L。
其更一步特征在于：所述复合酶的制备：在琼脂培养基中接入单色下皮黑菌(Cerrena unicolor)、变色栓菌(Trametes versicolor)和黄孢原毛平革菌(Phanerochaet chrysosporium EM-446)，在35℃下培养10～12天，从琼脂表面移出1cm²～2cm²的菌丝体，接种到盛有2000mL营养培养基的5000mL三角瓶中，35℃下培养4天～5天，匀浆，将该培养液转移至盛有50L主培养基的培养器中，振摇，35℃下培养5天～7天，离心后取上清液，即为木质纤维素复合酶，其中木质素过氧化物酶(Lignin peroxidase，简称LiP)为2500U/L～3000U/L，锰过氧化物酶(Manganese-dependent peroxidase，简称MnP)为800U/L～1200U/L，漆酶(Laccase)为60000U/L～130000U/L。
所述琼脂培养基为包含以下质量份数的材料混合物(g/L)：NaNO₃ 1.8g/L～2.0g/L，K₂HPO₄ 0.4g/L～0.6g/L，KCl 0.4g/L～0.6g/L，MgSO₄ 0.4g/L～0.6g/L，FeSO₄ 0.008g/L～0.012g/L，琼脂12g/L～18g/L，木质素磺酸钙12g/L～18g/L，青霉素0.001g/L～0.003g/L，调pH至6.5～6.8，定容至1L。
所述营养培养基包含以下质量份数的材料混合物(g/L)(g/L)：葡萄糖8～12g，蛋白胨0.2～0.3g，酵母抽提物0.3～0.5g，KH₂PO₄ 0.8～1.2g，Na₂HPO₄·12H₂O0.2～0.3g，MgSO₄·7H₂O 0.5～0.8g，定容至1L；
所述主培养基包含以下质量份数的材料混合物(g/L)(g/L)：麸皮180～220g，木屑750～850g，蛋白胨0.3～0.5g，酵母抽提物0.5～0.8g，Na₂HPO₄·12H₂O 0.2～0.4g，MgSO₄·7H₂O 0.4～0.7g，KH₂PO₄ 0.8～1.2g，定容至1L。
本发明的从木材中分离和纯化纤维素的高效复合酶方法，其采用生物处理方法降解分离植物材料中的木质素，从而得到纤维素，其反应条件温和，仅少量使用化学试剂，产生的废水量少，污水处理量小，污水处理费用低，生产成本低。
具体实施方式
实施例一：
1、木材原料的预处理：将木材原料洗净后削面为1cm～2cm大小，用超声波灭菌器进行灭菌处理，随后投入降解池中，加水浸投，将其润胀，得到预处理木质素纤维素；
2、预处理木质纤维素的酶解：按体积比为50:1的比例，在500份预处理木质纤维素中加入10份高效复合酶，常温常压下酶解36小时，即获得木质纤维素处理液，其中木质素得以完全降解，纤维素、木质素以及半纤维素呈半分离状态；
3、纤维素处理液的纯化：按体积比为1.5:1的比例，往150份木质纤维素处理液中加入100份三氯甲烷，混合萃取7小时，分离后移出三氯甲烷，三氯甲烷层中为木质素，萃取率为93％。纤维素处理液中的纤维素得率为92％，纯度为87.5％。
其中高效复合酶为以下各材料的混合物：复合酶液800mL，KH₂PO₄ 0.5g，NH₄Cl 1.1g，MnSO₄ 0.8g，CuSO₄ 0.4g，软腐菌95g，定容至1L。
复合酶的制备：在琼脂培养基中接入单色下皮黑菌(Cerrena unicolor)、变色栓菌(Trametes versicolor)和黄孢原毛平革菌(Phanerochaet chrysosporiumEM-446)，在35℃下培养12天，从琼脂表面移出1cm²的菌丝体，接种到盛有2000mL营养培养基的5000mL三角瓶中，35℃下培养4天。匀浆，将该培养液转移至盛有50L主培养基的培养器中。振摇，35℃下培养6天。离心后取上清液，即为木质纤维素复合酶，其中木质素过氧化物酶(Lignin peroxidase，简称LiP)为2500U/L，锰过氧化物酶(Manganese-dependent peroxidase，简称MnP)为1000U/L，漆酶(Laccase)为130000U/L。
所述琼脂培养基为包含以下质量分数的材料混合物(g/L)：NaNO₃ 1.8g，K₂HPO₄ 0.5g，KCl 0.6g，MgSO₄ 0.4g，FeSO₄ 0.01g，琼脂15g，木质素磺酸钙12g，青霉素0.003g，调pH至6.5，定容至1L。
营养培养基为包含以下质量份数的材料混合物(g/L)：葡萄糖10g，蛋白胨0.2g，酵母抽提物0.3g，KH₂PO₄ 1.2g，Na₂HPO₄·12H₂O 0.25g，MgSO₄·7H₂O 0.65g，定容至1L；
主培养基为包含以下质量份数的材料混合物(g/L)：麸皮220g，木屑750g，蛋白胨0.4g，酵母抽提物0.65g，Na₂HPO₄·12H₂O0.4g，MgSO₄·7H₂O0.7g，KH₂PO₄1.0g，定容至1L。
实施例二：
1、木材原料的预处理：将木材原料洗净后削面为1cm～2cm大小，用超声波灭菌器进行灭菌处理，随后投入降解池中，加水浸投，将其润胀，得到预处理木质素纤维素；
2、预处理木质纤维素的酶解：按体积比为45:1的比例，在450份预处理木质纤维素中加入10份高效复合酶，常温常压下酶解32小时，即获得木质纤维素处理液，其中木质素得以完全降解，纤维素、木质素以及半纤维素呈半分离状态；
3、纤维素处理液的纯化：按体积比为2:1的比例，往200份木质纤维素处理液中加入100份三氯甲烷，混合萃取6小时，分离后移出三氯甲烷，三氯甲烷层中为木质素，萃取率为96％。纤维素处理液中的纤维素得率为95％，纯度为90％。
其中高效复合酶为以下各材料的混合物：复合酶液900mL，KH₂PO₄ 0.4g，NH₄Cl₄ 1.2g，MnSO₄ 0.5g，CuSO₄ 0.5g，软腐菌97.5g，定容至1L。
复合酶的制备：在琼脂培养基中接入单色下皮黑菌(Cerrena unicolor)、变色栓菌(Trametes versicolor)和黄孢原毛平革菌(Phanerochaet chrysosporiumEM-446)，在35℃下培养11天，从琼脂表面移出1.5cm²的菌丝体，接种到盛有2000mL营养培养基的5000mL三角瓶中，35℃下培养5天。匀浆，将该培养液转移至盛有50L主培养基的培养器中。振摇，35℃下培养5天。离心后取上清液，即为木质纤维素复合酶，其中木质素过氧化物酶(Lignin peroxidase，简称LiP)为2750U/L，锰过氧化物酶(Manganese-dependent peroxidase，简称MnP)为1200U/L，漆酶(Laccase)为95000U/L。
所述琼脂培养基为包含以下质量分数的材料混合物(g/L)：NaNO₃ 1.9g，K₂HPO₄ 0.6g，KCl 0.5g，MgSO₄ 0.5g，FeSO₄ 0.008g，琼脂18g，木质素磺酸钙15g，青霉素0.002g，调pH至6.65，定容至1L。
所述营养培养基为包含以下质量份数的材料混合物(g/L)：葡萄糖8g，蛋白胨0.3g，酵母抽提物0.4g，KH₂PO₄ 1.0g，Na₂HPO₄·12H₂O 0.2g，MgSO₄·7H₂O0.8g，定容至1L。
所述主培养基为包含以下质量份数的材料混合物(g/L)：麸皮200g，木屑850g，蛋白胨0.3g，酵母抽提物0.5g，Na₂HPO₄·12H₂O 0.3g，MgSO₄·7H₂O 0.4g，KH₂PO₄ 1.2g，定容至1L。
实施例三：
1、木材原料的预处理：将木材原料洗净后削面为1cm～2cm大小，用超声波灭菌器进行灭菌处理，随后投入降解池中，加水浸投，将其润胀，得到预处理木质素纤维素；
2、预处理木质纤维素的酶解：按体积比为47.5:1的比例，在475份预处理木质纤维素中加入10份高效复合酶，常温常压下酶解28小时，即获得木质纤维素处理液，其中木质素得以完全降解，纤维素、木质素以及半纤维素呈半分离状态；
3、纤维素处理液的纯化：按体积比为1.75:1的比例，往175份木质纤维素处理液中加入100份三氯甲烷，混合萃取8小时，分离后移出三氯甲烷，三氯甲烷层中为木质素，萃取率为90％。纤维素处理液中的纤维素得率为89％，纯度为85％。
其中高效复合酶为以下各材料的混合物：复合酶液1000mL，KH₂PO₄ 0.3g，NH₄Cl₄ 1.0g，MnSO₄ 0.65g，CuSO₄ 0.3g，软腐菌100g，定容至1L。
复合酶的制备：在琼脂培养基中接入单色下皮黑菌(Cerrena unicolor)、变色栓菌(Trametes versicolor)和黄孢原毛平革菌(Phanerochaet chrysosporiumEM-446)，在35℃下培养10天，从琼脂表面移出2cm²的菌丝体，接种到盛有2000mL营养培养基的5000mL三角瓶中，35℃下培养4.5天。匀浆，将该培养液转移至盛有50L主培养基的培养器中。振摇，35℃下培养7天。离心后取上清液，即为木质纤维素复合酶，其中木质素过氧化物酶(Lignin peroxidase，简称LiP)为3000U/L，锰过氧化物酶(Manganese-dependent peroxidase，简称MnP)为800U/L，漆酶(Laccase)为60000U/L。
所述琼脂培养基为包含以下质量份数的材料混合物(g/L)：NaNO₃ 2.0g，K₂HPO₄ 0.4g，KCl 0.4g，MgSO₄ 0.6g，FeSO₄ 0.012g，琼脂12g，木质素磺酸钙18g，青霉素0.001g，调pH至6.8，定容至1L；
所述营养培养基为包含以下质量份数的材料混合物(g/L)：葡萄糖12g，蛋白胨0.25g，酵母抽提物0.5g，KH₂PO₄ 0.8g，Na₂HPO₄·12H₂O 0.3g，MgSO₄·7H₂O0.5g，定容至1L；
所述主培养基为包含以下质量份数的材料混合物(g/L)：麸皮180g，木屑800g，蛋白胨0.5g，酵母抽提物0.8g，Na₂HPO₄·12H₂O 0.2g，MgSO₄·7H₂O 0.55g，KH₂PO₄ 0.8g，定容至1L。
本发明方法实施例中，上述琼脂培养基、营养培养基和主培养基均需要在121℃温度条件下进行灭菌处理，此为行业内通有已有技术。