《一种利用黄孢原毛平革菌固体发酵玉米秸秆生产厚垣孢子样细胞的方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种利用黄孢原毛平革菌固体发酵玉米秸秆生产厚垣孢子样细胞的方法.pdf（5页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610117193.8 (22)申请日 2016.03.02 C12N 3/00(2006.01) C12R 1/645(2006.01) (71)申请人 河南师范大学 地址 453007 河南省新乡市牧野区建设东路 46 号 (72)发明人 王海磊 王莹 李平 李祎 刘磊 (74)专利代理机构 新乡市平原专利有限责任公 司 41107 代理人 路宽 (54) 发明名称 一种利用黄孢原毛平革菌固体发酵玉米秸秆 生产厚垣孢子样细胞的方法 (57) 摘要 本发明公开了一种利用黄孢原毛平革菌固体 发酵玉米秸秆生产厚垣孢子样细胞的方法。本发。
2、 明的技术方案要点为 ： 黄孢原毛平革菌利用玉米 秸秆为碳源， 通过固体发酵产生厚垣孢子样细胞， 其中每千克固体发酵培养基含以下成分 ： 玉米秸 秆粉碎物 300-500g、 酒石酸铵 50g、 KH2PO4 26g、 MgSO47H2O 24g、 CaCl2 20g、 MnSO45H2O 10g、 维 生素 B1 0.1g、 苯甲醇 0.5g， 余量为水。本发明以 玉米秸秆为碳源来生产厚垣孢子样细胞， 不仅可 减轻秸秆焚烧对大气环境造成的污染， 提高废弃 秸秆的利用率， 而且产生的厚垣孢子样细胞还可 作为生物制剂用于环境治理、 酶制剂发酵及农田 土壤生物修复等领域。 (51)Int.Cl. 。
3、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书3页 CN 105543159 A 2016.05.04 CN 105543159 A 1.一种利用黄孢原毛平革菌固体发酵玉米秸秆生产厚垣孢子样细胞的方法， 其特征在 于： 黄孢原毛平革菌利用玉米秸秆为碳源， 通过固体发酵产生厚垣孢子样细胞， 其中每千克 固体发酵培养基含以下成分： 玉米秸秆粉碎物300-500g、 酒石酸铵50g、 KH2PO426g、 MgSO4 7H2O24g、 CaCl220g、 MnSO45H2O10g、 维生素B10.1g、 苯甲醇0.5g， 余量为水。 2.根据权利要求1所述的利用黄。
4、孢原毛平革菌固体发酵玉米秸秆生产厚垣孢子样细胞 的方法， 其特征在于： 所述的厚垣孢子样细胞的直径为9-15m。 3.根据权利要求1所述的利用黄孢原毛平革菌固体发酵玉米秸秆生产厚垣孢子样细 胞的方法， 其特征在于： 所述的固体发酵过程为接种10-20mL黄孢原毛平革菌分生孢子悬 液于每千克固体发酵培养基中， 其中黄孢原毛平革菌分生孢子悬液的孢子浓度为3107 个/mL， 固体发酵罐的温度控制在33， 静置发酵10天， 发酵过程中每2小时搅拌一次。 4.根据权利要求1所述的利用黄孢原毛平革菌固体发酵玉米秸秆生产厚垣孢子样细胞 的方法， 其特征在于： 所述的玉米秸秆在使用之前进行粉碎处理， 粉碎物。
5、于50烘箱中烘干 后备用。 5.根据权利要求1所述的利用黄孢原毛平革菌固体发酵玉米秸秆生产厚垣孢子样细胞 的方法， 其特征在于： 所述的黄孢原毛平革菌为商业化菌株， 购自美国典型培养物保藏中 心， 菌株编号为ATCC24725。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105543159 A 2 一种利用黄孢原毛平革菌固体发酵玉米秸秆生产厚垣孢子样 细胞的方法 技术领域 0001 本发明属于厚垣孢子样细胞的生产技术领域， 具体涉及一种利用黄孢原毛平革菌 固体发酵玉米秸秆生产厚垣孢子样细胞的方法。 背景技术 0002 黄孢原毛平革菌 （Phanerochaetechrysosporium） 为一种典型。
6、的白腐真菌， 属于 非褶菌目， 伏革科， 显革菌属 （李慧蓉 白腐真菌生物学和生物技术 化学工业出版社 2005） 。 其菌丝一般无隔膜， 无锁状联合。 分生孢子为异核体， 担孢子是同核体。 在固体培养 时， 该真菌能产生厚垣孢子 （chlamydospore） ， 厚垣孢子个体较大， 细胞直径为60 m左右。 此 外， P.chrysosporium还能以一种厚垣孢子样细胞 （chlamydospore-likecell， CLC） 的形 式存在 （EunyongC,JunseO,SangpillH,Ik-SungA,YeoJY.Enhancedproduction ofmanganesep。
7、eroxidasefromimmobilizedPhanerochaetechrysosporiumdueto theincreasedautolysisofchlamydospore-likecells.BiotechnologyLetter. 2005 ,27(7 ):477-481;ZacchiL ,MorrisI ,HarveyPJ .Disordered ultrastructureinlignin-peroxidasesecretinghyphaeofthewhite-rotfungus Phanerochaetechrysosporium.Microbiology.2000,14。
8、6(3):759-765） ， CLC的细胞 直径为9-15m， 在细胞体积上区别于黄孢原毛平革菌的厚垣孢子， 但其也具备厚垣孢子的 易分散、 细胞壁厚和易保藏等优点。 由于缺少简单、 高效的生产手段， CLC的制备十分困难， 因此， 国内外研究人员均没有把P.chrysosporium的CLC当作一个可深入研究的对象。 根据 目前的文献检索， 国内外尚没有P.chrysosporium厚垣孢子样细胞生产技术的相关报道。 0003 P.chrysosporium广泛应用于环境治理如废水处理、 土壤及河流污染修复、 酶制 剂发酵、 农业等领域。 对于P.chrysosporium的研究最初集中在。
9、生物质资源化方面， 由于其 能产生木质素过氧化物酶 （ligninperoxidase， LiP） 及锰依赖性过氧化物酶 （manganese peroxidase， MnP） ， 并具有降解包括木质素在内的许多酚型或非酚型化合物的能力 （Bumpus JA,TienM ,WrightD,AustSD.Oxidationofpersistentenvironmental pollutantsbyawhiterotfungus.Science.1985,228(4076):1434-1436） ， 因此可 用于木质素的降解及资源化。 随后， 大量报道表明P.chrysosporium在废水处理 。
10、（如焦化废 水、 染料废水等） 、 土壤及水体污染生物修复领域也有着广阔的应用前景 （BoganBW , SchoenikeB,LamarRT,CullenD.ManganeseperoxidasemRNAandenzyme activitylevelsduringbioremediationofpolycyclicaromatichydrocarbon- contaminatedsoilwithPhanerochaetechrysosporium.AppliedandEnvironmental Microbiology.1996,62(7):2381-2386； Rodarte-Morale。
11、sAI,FeijooG,Moreira MT,LemaJM.Biotransformationofthreepharmaceuticalactivecompoundsby thefungusPhanerochaetechrysosporiuminafedbatchstirredreactorunder airandoxygensupply.Biodegradation.2011,23(1):145-156； LuY,YanLH, 说明书 1/3 页 3 CN 105543159 A 3 WangY,ZhouSF,FuJJ,ZhangJF.Biodegradationofphenoliccomp。
12、oundsfrom cokingwastewaterbyimmobilizedwhiterotfungusPhanerochaete chrysosporium.JournalofHazardousMaterial.2009,165(1-3):1091-1097） 。 此 外， P.chrysosporium作为生物农药还可以防治病虫害， 并能通过降解作物连作后土壤里 的大量化感物质 （如酚酸类物质） ， 解除连作作物的自毒作用。 徐淑霞等发现P . chrysosporium对黄瓜连作土壤中的羟基苯甲酸、 香草酸、 阿魏酸等酚酸类物质具有明显的 降解作用， 土壤经P.chrysosporiu。
13、m修复后， 黄瓜根部病害明显减轻， 枯萎病及根结线虫病 相对病情指数降低 （徐淑霞， 张世敏， 尤晓颜， 贾新成， 吴坤 黄孢原毛平革菌对黄瓜连作土 壤酚酸物质的降解 应用生态学报 2008,19(11):2480-2484） 。 因此， P.chrysosporium 可作为防治剂用于作物病虫害防治及连作障碍的消除。 0004 作物秸秆如玉米秸秆是农作物生产过程中产生的一种重要生物质资源。 现阶段我 国对秸秆处理的方法主要是以还田为主， 约37%的秸秆直接以肥料的形式利用， 但秸秆肥料 在使用前需要经过一定的预处理工艺， 变相增加了成本。 其次22.6%的秸秆被用作牲畜饲 料处理， 但直接饲。
14、喂秸秆消化率极低， 其中的营养物和有效能量并不能直接被家畜吸收利 用。 剩余的农作物秸秆被直接焚烧或弃置， 造成资源的极大浪费， 并对大气环境造成严重污 染。 因此， 如何有效利用大量的秸秆资源已成为人们研究的焦点。 发明内容 0005 本发明解决的技术问题是提供了一种利用黄孢原毛平革菌固体发酵玉米秸秆生 产厚垣孢子样细胞的方法， 该方法以玉米秸秆作为营养基质， 利用黄孢原毛平革菌固体发 酵生产厚垣孢子样细胞， 产生的厚垣孢子样细胞在环境治理、 酶制剂发酵和农田生物修复 等领域具有一定的应用潜力。 0006 本发明为解决上述技术问题采用如下技术方案， 一种利用黄孢原毛平革菌固体发 酵玉米秸秆生。
15、产厚垣孢子样细胞的方法， 其特征在于： 黄孢原毛平革菌利用玉米秸秆为碳 源， 通过固体发酵产生厚垣孢子样细胞， 其中每千克固体发酵培养基含以下成分： 玉米秸秆 粉碎物300-500g、 酒石酸铵50g、 KH2PO426g、 MgSO47H2O24g、 CaCl220g、 MnSO45H2O 10g、 维生素B10.1g、 苯甲醇0.5g， 余量为水。 0007 所述的厚垣孢子样细胞的直径为9-15m， 区别于直径约60m的黄孢原毛平革菌厚 垣孢子 （chlamydospore） 。 0008 所述的固体发酵过程为： 接种10-20mL黄孢原毛平革菌分生孢子悬液于每千克固 体发酵培养基中， 其。
16、中黄孢原毛平革菌分生孢子悬液的孢子浓度为3107个/mL， 固体发酵 罐的温度控制在33， 静置发酵10天， 发酵过程中每2小时搅拌一次。 0009 所述的玉米秸秆在使用之前进行粉碎处理， 粉碎物于50烘箱中烘干后备用。 0010 所述的黄孢原毛平革菌为商业化菌株， 购自美国典型培养物保藏中心， 菌株编号 为ATCC24725。 0011 本发明以玉米秸秆为碳源来生产厚垣孢子样细胞， 不仅可减轻秸秆焚烧对大气环 境造成的污染， 提高废弃秸秆的利用率， 而且产生的厚垣孢子样细胞还可作为生物制剂用 于环境治理、 酶制剂发酵及农田土壤生物修复等领域。 说明书 2/3 页 4 CN 105543159。
17、 A 4 具体实施方式 0012 以下通过实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明， 但不应该将此理解为本 发明上述主题的范围仅限于以下的实施例， 凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发 明的范围。 实施例 0013 一、 不同秸秆量对CLC产量的影响 1、 利用PDA （马铃薯葡萄糖琼脂培养基） 平板培养P.chrysosporium， 3-5天后， 平板上 分生孢子用无菌水洗脱， 适当稀释后， 制备成浓度为3107个/mL的分生孢子悬液。 0014 2、 根据配方1-3分别制备固体发酵培养基： 配方1： 玉米秸秆粉碎物300g、 酒石酸铵50g、 KH2PO426g、 MgSO47H2O。
18、24g、 CaCl220g、 MnSO45H2O10g、 维生素B10.1g、 苯甲醇0.5g， 加水至总重为1kg。 0015 配方2： 玉米秸秆粉碎物400g、 酒石酸铵50g、 KH2PO426g、 MgSO47H2O24g、 CaCl2 20g、 MnSO45H2O10g、 维生素B10.1g、 苯甲醇0.5g， 加水至总重为1kg。 0016 配方3： 玉米秸秆粉碎物500g、 酒石酸铵50g、 KH2PO426g、 MgSO47H2O24g、 CaCl2 20g、 MnSO45H2O10g、 维生素B10.1g、 苯甲醇0.5g， 加水至总重为1kg。 0017 3、 接种与发酵 。
19、固体发酵罐体积为2L,装1kg经灭菌的固体发酵培养基， 发酵罐内接种15mLP. chrysosporium分生孢子悬液 （孢子浓度=3107个/mL） ， 温度控制在33， 固体发酵过程中 每2小时搅拌一次， 发酵时间为10天。 0018 4、 CLC计数 利用平板菌落计数法测定CLC的数量， 单位CFU/g。 0019 二、 实验结果 实验结果如表1所示， 固体发酵10天后， 玉米秸秆粉碎物含量为400g/kg时， P . chrysosporium的CLC产量最高， 为8.9108CFU/g。 玉米秸秆粉碎物含量为300g/kg和 500g/kg时， CLC的产量略有下降， 分别为6.5。
20、108CFU/g和7.4108CFU/g。 以上结果表明 玉米秸秆可以作为营养基质用于CLC的固体发酵， 玉米秸秆的不同用量对CLC的产量具有一 定的影响。 0020 表1不同玉米秸秆含量对CLC产量的影响 玉米秸秆粉碎物含量 （g/kg）300400500 CLC （CFU/g）6.51088.91087.4108 以上实施例描述了本发明的基本原理、 主要特征及优点， 本行业的技术人员应该了解， 本发明不受上述实施例的限制， 上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理， 在 不脱离本发明原理的范围下， 本发明还会有各种变化和改进， 这些变化和改进均落入本发 明保护的范围内。 说明书 3/3 页 5 CN 105543159 A 5 。