技术领域
本发明属于肿瘤治疗技术领域，具体涉及一种具有抗肿瘤血管生成作用的靶向FAP的合成肽Z-GP-V2。
背景技术
近年来，恶性肿瘤的发病率和死亡率逐年上升，现已成为发达国家和部分发展中国家成人死亡的最主要原因，是全球最大的公共问题之一，严重威胁着人们的健康和生命安全。因此，癌症的治疗受到国际社会的普遍关注和高度重视，而寻找安全有效、不良反应较小的抗肿瘤药物一直是生物医学研究的焦点问题。传统的临床治疗药物原则是通过直接杀伤肿瘤细胞来抑制肿瘤生长的，但是，这些药物通常对正常细胞具有细胞毒性，在杀伤肿瘤细胞的同时，也易造成人体产生诸如骨髓抑制、免疫功能低下、不规则出血、恶心呕吐等副作用，而且随着药物使用时间的延长，肿瘤细胞易对这些药物产生抗性。因此，从不同途径寻找效果好、毒性低、特异性强的抗肿瘤药物是目前肿瘤治疗的主要目标，而越来越多的研究者以肿瘤微环境中的各种基质细胞为靶点来研究癌症治疗，并取得了一定的治疗效果，已成为肿瘤治疗研究的新热点。
以肿瘤血管内皮细胞为靶点，通过抑制肿瘤血管生成来抑制肿瘤生长的肿瘤血管阻断疗法受到了人们的广泛重视。理论而言，肿瘤是血管依赖型的恶性细胞，其生长、转移、复发和预防均与肿瘤血管生成密切相关。事实上，90%的癌症患者，都是死于血管通道转移，这也是肿瘤血管造成的最大危害。因此，抑制肿瘤新生血管的生长才能从根本上达到治疗肿瘤的目的。现有的内源性血管生成抑制剂多数是ECM和血液凝滞过程中一些天然组分的片段，但这些片段由于结构较大而不能有效穿透组织，同时存在在人体内易于清除的缺陷，加上药剂使用量大、应用成本高的缺陷，严重限制了内源性血管生成抑制剂在临床中的应用。所以，现在许多学者正致力于研究一些与较大内源性蛋白或多肽具有相似作用的小分子多肽药物。
成纤维细胞激活蛋白（fibroblast Activation Protein，FAP ）是一种膜丝氨酸肽酶，是Ⅱ型丝氨酸蛋白酶家族成员之一，具有二肽肽酶及胶原酶活性，可促进肿瘤的浸润和转移以及微血管的生成，特异性表达于90%以上的上皮肿瘤的基质成纤维细胞的胞膜和胞浆中，包括结肠癌，乳腺癌，卵巢癌，膀胱癌，肺癌（原发的和转移的），阳性细胞靠近肿瘤毛细血管的内皮细胞并围绕着肿瘤结节，但在正常成人的组织、良性和癌前病变的上皮性损伤组织中通常不表达。FAP的蛋白酶活性可以增强肿瘤细胞对细胞外基质的侵袭力，促进肿瘤的生长和增殖。研究表明，FAP在瘤形成的整个过程中均发挥促进作用，还可以有效增强肿瘤新生血管的形成，靶向抑制FAP可以阻止肿瘤的基质源性及血管源性供给营养。由于其对肿瘤生长的重要影响作用及特异性表达于肿瘤基质成纤维细胞中的特点，FAP在肿瘤靶向治疗中具有重要的意义。
发明内容
基于FAP的二肽底物（Z-GP）以及现有Tie2靶向肽结构基础上，本发明设计提出了一种新的合成肽物质：Z-GP-V2，从而为肿瘤的预防和治疗提供新的借鉴和参考。
本发明所采取的详细技术方案如下。
一种靶向FAP的抗血管生成的合成肽Z-GP-V2，该合成肽由两个功能结构域通过丙氨酸柔性连接子连接构建而成，具体为由丙氨酸柔性连接子将靶向FAP的二肽底物（Z-GP，N-苄氧羰基甘氨酸脯氨酸）和靶向Tie2具有抗肿瘤血管生成的多肽片段（V2肽，NLLMAAS）连接起来构成；
该肽分子量为：1149.6 Da，序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：Z-Gly-Pro-Ala-Ala-Asn-Leu-Leu-Met-Ala-Ala-Ser；即Z-GPAANLLMAAS或者Z-GP-AA-NLLMAAS。
所述靶向FAP的抗血管生成的合成肽Z-GP-V2，采用Fmoc固相多肽合成法制备而成，具体过程为：
（1）选用Wang树脂与待合成肽C端的第一个Fmoc-氨基酸羧基以共价键形式连接，再以该氨基酸的N端作为该条多肽合成的起点，并让其与下一个氨基酸的羧基端发生脱水缩合反应，形成肽键；
（2）然后，将N端的Fmoc-氨基酸的保护基进行脱保护，再让第二个氨基酸的N端与后面的氨基酸的羧基反应，如此不断重复这一过程直至多肽合成完毕；
（3）最后再将合成的多肽从树脂上切割下来，经过乙醚沉淀与洗涤，得到粗肽；
（4）经过脱盐处理，RP-HPLC分析纯化，即可得到本发明所述的靶向FAP的抗肿瘤血管生成的合成肽Z-GP-V2，所得合成肽Z-GP-V2可于-20℃冻存备用。
所述靶向FAP的合成肽Z-GP-V2，用于抗肿瘤血管生成。
已有研究表明，FAP具有特异性肽链内切酶活性，能选择性水解N-末端封闭的甘氨酰脯氨酸二肽序列，如携带Z-Gly-Pro(Z-GP)二肽的底物，因而针对该底物可设计针对性药物以阻断FAP的作用。而对V2肽的研究表明，该肽是一种特异性作用于肿瘤血管生成相关因子受体Tie2的小分子多肽，特异性阻断在血管形成过程中较为关键的Ang（血管生成素）与其受体相结合，进而阻断血管生成。但是无论针对Z-GP所设计的治疗方式，抑或V2肽的应用，这种单一靶向血管内皮细胞受体的治疗方法还存在一定的局限性和缺陷，其主要原因在于，新生血管的形成不仅发生在肿瘤细胞周边，在伤口愈合、子宫内膜周期性变化、心肌梗塞后和糖尿病等情况下也会发生，而当VEGF的正常功能受到抑制时，针对肿瘤治疗应用的这些药物将会引起高血压、蛋白尿、出血、血栓事件、胃肠道穿孔、伤口愈合综合征等副反应的发生，因而一定程度上限制了这类单一靶向药物的治疗效果，从而影响了这类治疗方法的推广和应用。
本发明在现有的单一靶向药物作用基础上，通过丙氨酸柔性连接子将Z-GP与靶向Tie2具有抗肿瘤血管生成活性的V2肽进行连接，获得了一种新的双靶向的合成肽Z-GP-V2。进一步通过体外细胞划痕实验和迁移实验，验证了该合成肽的抗血管生成作用。而通过具有丰富血管的小鼠S180移植瘤模型实验的验证，发现该肽对肿瘤的抑制效果明显，具有抗肿瘤血管生成作用，且无明显的毒副作用，具有较好的医疗应用前景，同时也为靶向抗肿瘤血管治疗提出了一种新思路。
总体而言，靶向抗肿瘤血管生成的治疗方法，相较于直接以肿瘤组织为靶点的治疗方法，具有不易产生耐药性、特异性强、毒副作用小等诸多优点；同时由于一个血管内皮细胞会支持50~100个肿瘤细胞生长，所以阻断肿瘤血管后，抑制瘤体效果会成倍放大。本发明基于抗肿瘤血管生成治疗方法的巨大优势，通过利用特异性底物二肽Z-GP对V2肽进行修饰，获得了新的合成肽Z-GP-V2，而新的合成肽对于改善V2肽的靶向性，提高其抗肿瘤血管生成作用，及降低其毒副作用等方面都表现出较好的应用效果，同时也为新的抗肿瘤血管生成治疗方法提供了新的借鉴和参考。
附图说明
图1为所制备的合成肽Z-GP-V2的ESI-MS质谱分析鉴定结果；
图2为合成肽Z-GP-V2在5μM时，在细胞划痕实验中对于HUVECs迁移的影响；
图3为合成肽Z-GP-V2在细胞迁移实验中对于HUVECs迁移的影响；
图4为合成肽Z-GP-V2对荷S180的BABL/c小鼠体重变化的影响结果图；
图5为合成肽Z-GP-V2对荷S180的BABL/c小鼠移植瘤体积变化的影响结果图；
图6为合成肽Z-GP-V2对荷S180的BABL/c小鼠的移植瘤瘤重的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术方案进行详细介绍，但在介绍具体实施例前，首先对本发明中所用到部分实验试剂及实验设备等情况简要介绍如下。
生物材料：
S180细胞（鼠肉瘤细胞）、HUVECs（人脐静脉内皮细胞），购买于ATCC（American Type Culture Collection）；
SPF级5~8周龄BALB/c雌鼠（50只），购买于河南省实验动物中心；
实验试剂：
Fmoc多肽固相合成的Wang树脂、Fmoc保护的L型氨基酸，为吉尔生化（上海）有限公司产品；
Fmoc多肽固相合成中的洗涤试剂、1-羟基苯并三唑（HOBt）、N,N-二异丙基碳二亚胺（DIC）、4-二甲氨基吡啶（DMAP）、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、甲醇（MeOH）、二氯甲烷（DCM）、茚三酮、六氢吡啶、哌啶、醋酸酐、三氟乙酸（TFA）、乙腈等，自天津市风船化学试剂科技有限公司；
RPMI-1640培养基，为北京Solarbio公司产品；
磷酸盐缓冲液（PBS）配置相关试剂，购自天津市科密欧化学试剂有限公司；
FBS（胎牛血清），购自杭州四季青生物有限公司；
实验设备：
多肽合成仪，江苏通州市南兴申海玻仪厂；
旋转蒸发器RE-52，上海亚荣生化仪器厂；
RP-HPLC分析仪，日本岛津公司；
倒置显微镜AE2000，Olympus公司。
实施例 1
本发明所提供的合成肽Z-GP-V2，该肽分子量为：1149.6，具体为：Z-Gly-Pro-Ala-Ala-Asn-Leu-Leu-Met-Ala-Ala-Ser，采用Fmoc固相多肽合成法制备而成，以某次合成0.2073克的合成肽Z-GP-V2为例，具体制备方法如下所述。
（1）称取0.3gWang树脂放入DMF润洗过的多肽合成仪中，然后加入4 mLDMF，静置30min，使树脂充分溶胀，然后用真空泵抽去DMF。
（2）第一个氨基酸的添加：按公式1称取丝氨酸、HoBt及DIC对应的量，按公式2称取DMAP对应的量，分别为287.55mg、101.3475mg、94.65μL、9.162mg，先用4 mL DMF溶解丝氨酸和HoBt加入合成仪中，然后直接在合成仪中加入DIC，25℃~28℃下搅拌反应10min后，再将用1mL DMF溶解的DMAP加入合成仪中，继续在此温度下搅拌反应2.5h；
所述公式1为：氨基酸的质量=该氨基酸的相对分子质量×2.5（当量）×树脂的质量；
所述公式2为：DMAP的质量=DMAP的相对分子质量×0.25（当量）×树脂的质量。
（3）将步骤（2）中反应完毕的树脂按以下顺序及次数进行洗涤，DMF两次→MeOH三次→DCM三次→DMF两次，摇床中震荡洗涤，每次洗涤两分钟，洗涤结束时用真空泵将液体抽干；
用分光光度计测定波长为290nm处树脂和第一个氨基酸的吸光度OD，根据公式计算取代值，加封头液封头两次，每次20min，在摇床中震荡，然后洗涤，洗涤方法同上，洗涤结束时用真空泵将液体抽干然后洗涤；
取代值计算公示为：取代值=OD/（1.65×m树酯），m树酯为树脂的质量。
（4）第二个氨基酸即丙氨酸的添加：合成时是从C端到N端方向进行，对步骤（2）中第一个氨基酸添加后树脂脱保护两次；
所述脱保护是指在合成仪中加入4 mL脱保护液（哌啶与DMF的体积比为1:3），25℃~28℃下搅拌反应20min，真空泵抽干；
然后洗涤，洗涤方法及步骤同步骤（3）中洗涤；
然后挑取树脂茚检呈蓝色时，按公式3称取第二个氨基酸丙氨酸、HoBt、DIC的量，分别为217.91mg、94.591mg、88.34μL，先用4 mL DMF溶解丙氨酸和HoBt加入合成仪中，然后直接在合成仪中加入DIC，25℃~28℃下搅拌反应 2.5h；反应结束后按步骤（3）的方法洗涤树脂，洗涤结束后挑取树脂茚检呈无色；
所述公式3为：氨基酸的量=该氨基酸的相对分子质量（此处为脯氨酸）×2.5×树脂的质量（此处为0.3）×取代值（此处为步骤（3）中取代值计算结果）。
（5）后续氨基酸的添加：后续氨基酸的添加方法同第二个氨基酸的添加过程，直至加完所有氨基酸；其中茚检样品时，显色要求有所调整，茚检时，若前一个氨基酸是脯氨酸、丝氨酸和组氨酸时则茚检呈红棕色。
（6）切割多肽：从树酯上切割多肽，首先按步骤（4）中的脱保护方法进行两次；洗涤（同步骤（3））；然后进行切割；
所述切割为，将切割试剂加入合成仪中，搅拌柱搅拌三小时，然后将合成仪中的液体抽入球形烧瓶中，并用DCM冲洗3遍；
把球形烧瓶装在旋转蒸发仪上蒸发1小时；
在球形烧瓶中加入乙醚再蒸发4~6次，最后加入冰乙醚在冰上静置30min，白色沉淀即为析出的粗肽；
将含粗肽的乙醚溶液2000rpm离心2min，得粗肽沉淀，把粗肽在37℃烘箱中烘干（烘干约需3h）；
需要强调的是，所述切割试剂需现配现用，其具体组成配比为：三蒸水0.3mL、苯甲硫醚0.3mL、1,2-二硫醇0.15mL、苯酚0.3mL、三氟乙酸TFA4.95mL。
（7）粗肽纯化：利用RP-HPLC纯化粗肽，纯化体系为：乙腈，1‰，TFA=25%~50%；流速5min/mL，检测波长是228nm；
纯化后所得精肽即为本发明所述靶向FAP的合成肽Z-GP-V2，纯度检测表明，纯化后后其纯度大于95%，可于-20℃保存备用。
对纯化后的合成肽Z-GP-V2进行ESI-MS质谱鉴定，结果如图1。从图1中可以看出，所制备的合成肽Z-GP-V2的分子量符合预期。
实施例 2
对于实施例1所制备的合成肽Z-GP-V2，发明人对其抗肿瘤血管生成作用进行了具体的实验验证，相关实验简要介绍如下。
一、 体外抗血管生成作用验证
1 、细胞划痕实验
利用细胞划痕实验，对合成肽Z-GP-V2对人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的迁移影响进行评价，相关实验过程简要介绍如下。
（1）将HUVECs以1×105个/mL的细胞密度接种于24孔板中，待细胞铺板率达到90%以上后，用200μL枪头轻轻地沿着标记进行划痕；
（2）随后，用PBS将划去的细胞清洗干净，将Z-GP-V2分别以不同浓度（100、25、5μM）加入每个复孔中，每个浓度为一个实验组，每组3个复孔，同时，以无血清RPMI 1640培养基为阴性对照组、V2肽为阳性对照组、Z-GP为无关肽对照组；
所述V2肽、Z-GP二肽参考现有技术制备而成，使用前均由RPMI 1640无血清培养基溶解稀释至200μM；
（3）在37℃、5%CO2的恒温培养箱中，培养24小时，期间每隔12小时在倒置显微镜下以40×的放大倍数进行观察拍照记录，并按照下述公式计算各个时间段的划痕愈合程度并绘制柱状图；
计算公式：[1-（12小时－24小时的相对区域/0小时的相对区域）]×100%。
实验结果如图2所示。从图中可以看出，本发明中的合成肽Z-GP-V2有抑制HUVECs迁移的作用，在24小时时，阴性对照组的“伤口”愈合程度是5μM Z-GP-V2实验组的1.3倍，具有极其显著的差异（***p<0.001），这一结果说明实验组HUVECs的迁移速度慢于阴性对照组，Z-GP-V2对于HUVECs的迁移有很好的抑制效果。就单独的Z-GP处理组而言，其“伤口”愈合程度几乎和阴性对照组相同，说明Z-GP本身对于HUVECs的迁移并没有明显的影响作用。而就V2肽与合成肽Z-GP-V2组对比结果可以看出，随着时间的延长，合成肽Z-GP-V2组的愈合程度要优于V2肽组，但始终具有抑制HUVECs迁移的效果，表明合成肽Z-GP-V2对于HUVECs迁移的副作用相对较小，但依旧保持了V2本身抑制HUVECs迁移的能力。
2 、细胞迁移实验
为进一步验证Z-GP-V2抑制HUVECs迁移的作用，发明人以8.0μm的Transwell小室进行了实验（BD公司），实验过程简介如下：
（1）HUVECs依次先后经过无血清RPMI 1640培养基饥饿处理12小时，不同药物浓度（100、25、5μM）的Z-GP-V2处理12小时，同时以无血清培养基为阴性对照组、以V2肽为阳性对照组、以Z-GP为无关肽对照组，处理12小时后，收集细胞并用无血清培养基进行重悬；
所述V2肽、Z-GP二肽参考现有技术制备而成，使用前均由RPMI 1640无血清培养基溶解稀释至200μM；
（2）以1.5×105个/mL的细胞密度接种于Transwell上室中，每孔200μL，下室加入750μL含10%FBS的RPMI 1640培养基，放入37℃、5%CO2的恒温培养箱中培养12小时；
（3）培养结束后，将旧的培养基吸出，用PBS清洗2遍；
（4）用3.8%的多聚甲醛固定细胞20min；到时间后，用PBS清洗2遍；
（5）用0.2%的结晶紫染色15min；到时间后，用PBS清洗5遍；
（6）清洗干净后，向每孔加入适量的超纯水，放到倒置显微镜下以40×的放大倍数进行观察拍照计数并绘制柱状图。
实验结果如图3所示。从图3中可以看出，合成肽Z-GP-V2有抑制HUVECs迁移的作用，阴性对照组的迁移细胞数是25μM 浓度合成肽Z-GP-V2时迁移的HUVECs的细胞数的3.4倍，具有显著差异（**p<0.01），这一结果表明合成肽Z-GP-V2处理后的HUVECs的迁移速度减慢，合成肽Z-GP-V2有抑制HUVECs迁移的能力。就单独的Z-GP处理组而言，其细胞迁移的数目和阴性对照组相比几乎达到一致，再次说明Z-GP本身就HUVECs的迁移能力没有明显的影响。而就V2肽组与合成肽Z-GP-V2组的对比可以看出，不同浓度下，合成肽Z-GP-V2组与V2组均具有抑制HUVECs迁移作用，这两组迁移的细胞数量明显低于阴性对照组，再次说明Z-GP-V2保持了V2的抑制内皮细胞迁移的能力。
基于现有研究基础上，发明人认为，与Z-GP所连接的序列可在Z-GP作为FAP的底物基础上，实现初步定位功能，而由于FAP存在于肿瘤基质中，因而与Z-GP所连接的序列亦可初步定位于肿瘤基质中。结合上述体外实验结果可以看出，与Z-GP所连接的肽序列（即本发明所提供的合成肽Z-GP-V2）相较于初始的V2肽，其仍然保留较好的多肽活性，仍然具有较好的抗肿瘤作用；或者说，Z-GP二肽底物本身并没有影响V2肽的抗血管生成作用。而鉴于初始V2肽作用时所缺乏的靶向性，本发明所提供的合成肽Z-GP-V2，能够更好地作用于目标靶位（血管内皮细胞），对于更好地抑制内皮细胞迁移，发挥抗肿瘤血管生成作用具有较好的改进效果，同时鉴于更低的毒副作用效果，使得本发明所提供的合成肽Z-GP-V2具有较好的推广应用意义。
二、合成肽 Z-GP-V2 的抗肿瘤活性的体内实验验证
为进一步检验合成肽Z-GP-V2的抗肿瘤活性，以实施例1制备的合成肽Z-GP-V2进一步进行了抗肿瘤相关实验，具体实验情况如下。
抑瘤率实验
实验过程如下：
（1）于每只小鼠的右前肢腋下荷1×107个瘤细胞，待小鼠的瘤体积达到50~100mm3时按瘤体积随机分组，分为7组，分别为Z-GP-V2高剂量组（0.6μM）、Z-GP-V2低剂量组（0.2μM）、V2高剂量组（0.6μM）、V2低剂量组（0.2μM）、Z-GP高剂量组（0.6μM）、Z-GP低剂量组（0.2μM）、和生理盐水组（阴性对照组），每组5只；
使用时，合成肽Z-GP-V2（V2肽或Z-GP）直接溶于生理盐水配成相应浓度，按1mL/Kg注射用量注射；
需要注意的是，将合成肽Z-GP-V2（V2肽或Z-GP）溶于生理盐水后，需过滤除菌，为使用方便期间，可过滤除菌后分装后-20℃保存备用；
（2）尾静脉给药的方式注射，共给药12天；各组每天上午给药；实验期间小鼠自由进食和饮水；
（3）实验期间每日测量小鼠体重并记录，绘制曲线，以评价合成肽Z-GP-V2的毒副作用；同时每日测量肿瘤的长（a）短（b）径，并按公式（计算公示为：V=1/2×(a×b2)）计算肿瘤体积并绘制肿瘤生长曲线；给药结束的第二天将小鼠脱颈处死取出肿瘤并称重。
小鼠体重变化曲线如图4所示，小鼠肿瘤体积变化曲线如图5所示，小鼠瘤重情况如图6所示。
从图4中可以看出，合成肽Z-GP-V2给药组的体重变化在正常范围内，表明该合成肽没有明显的毒副作用。而从图5和图6我们可知，Z-GP-V2给药组的瘤体积和瘤重比阴性对照即生理盐水组要小，有差异（*p<0.05），且高浓度显示出了较好的抑制效果，同时Z-GP组未显示出明显的抑瘤活性，说明靶向FAP的合成肽Z-GP-V2具有一定的抗肿瘤作用。
进一步而言，就V2肽与合成肽Z-GP-V2组对比而言，虽然Z-GP-V2处理组的抗肿瘤效果并不足够突出，但由于V2肽并没有靶向肿瘤的功能基序，从图4的小鼠体重变化中可以看出其仍然具有一定的毒副作用（随着时间的延长，小鼠体重增加的并不明显），而Z-GP-V2实验组具有一定的抗肿瘤效果，且没有明显的毒副作用。
自1986年发现FAP以来，对于该蛋白的定位、表达和功能做了大量研究工作，初步研究认为，FAP在肿瘤的侵润和转移中扮演了重要的角色，其与90%的上皮细胞癌有关系，但在正常成人的组织、良性和癌前病变的上皮性损伤组织中通常不表达该蛋白，因此FAP可以作为肿瘤体内免疫诊治中较有前途的靶分子。
本发明通过丙氨酸柔性连接子将FAP的二肽底物与靶向Tie2具有抗血管生成作用的V2肽相耦联，使这条设计的合成肽Z-GP-V2具有双靶向的功能，利用Z-GP与FAP的高亲和性以及FAP在肿瘤基质部位的高表达特性，减少和降低了本身Tie2选择性多肽V2的非特异性所造成的毒副作用，同时较好地保留了新的合成肽中V2肽部分的抗肿瘤血管生成作用效果。通过上述一系列体内、体外的实验验证，本发明所提供的合成肽Z-GP-V2在应用于抗血管肿瘤生成时，没有明显的副作用，加上其制备方法较为成熟和完善，因而具有较好地医疗应用前景。
SEQUENCE LISTING
<110> 郑州大学
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<130> none
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Gly Pro Ala Ala Asn Leu Leu Met Ala Ala Ser
1 5 10