技术领域
本发明涉及畜类病毒检测试剂盒，具体涉及一种猪繁殖与呼吸综合征病毒的多重RT-PCR检测试剂盒。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征（Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome,PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus,PRRSV）引起的，以妊娠母猪发生早产、流产、死胎、弱仔和木乃伊胎，仔猪和育肥猪发生呼吸道疾病，生产性能降低，饲料报酬率降低，死亡率升高等临
尽管目前国内外对PRRSV的病原学、血清分型、诊断做了大量的研究，但由于其几乎遍及世界各地，对全世界猪及相关产品的威胁众所周知，它的发病率和造成的经济每年至少为上百亿美元。尤其其与它繁殖与呼吸综合征在临床上很难区分，同时在临床症状和病理变化因感染动物的种类、年龄、病程长短及感染毒株毒力等不同而有所差别，可能缺乏特征病症，这给猪繁殖与呼吸综合征的诊断和防治带来极大困难。因此，单靠临床诊断难以定性。快速简单的实验室诊断方法是确诊猪繁殖与呼吸综合征唯一有效地途径。
为了确定猪繁殖与呼吸综合征是否在某一地区存在，检测动物血清抗体的方法并非完全可靠，还必须通过通过病原学检测以确诊病原的存在，一般检测方法为生物学实验、血清型诊断技术和分子生物学技术等诊断技术，但是这些方法有的敏感性不高、有的特异性不强、有的检出率较低，检测周期太长，并且这些技术普遍费用太高。随着2006年第一例欧洲型猪繁殖与呼吸综合征在我国检出，建立一种快速诊断欧洲型和美洲型株猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的多重RT-PCR试剂盒，完成对PRRS的快速诊断以及对其进行严格监控具有重要意义。
发明内容
本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了一种能够快速、简便、灵敏和经济的区分动物所感染的欧洲型或美洲型株猪繁殖与呼吸综合征病毒的多重RT-PCR检测试剂盒。
为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：一种猪繁殖与呼吸综合征病毒的多重RT-PCR检测试剂盒，所述试剂盒中包括有混合酶EnzymeMix、2×Buffer2、无菌双蒸水和两对引物，两对引物分别为用于扩增美洲型株猪繁殖与呼吸综合征病毒的基因的引物对一和用于扩增欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒的目的基因的引物对二；
所述引物对一包括
上游引物：5′-CACCACGTCGAAAGTGCCGC-3′（SEQIDNO：1）和
下游引物：5′-GACGCCGGACGACAAATGCG-3′（SEQIDNO：2）；
所述引物对二包括
上游引物：5′-GGGGCTGTTGCACATCCTAA-3′（SEQIDNO：3）和
下游引物：5′-ACAAAAGGGCAACAACAGCC-3′（SEQIDNO：4）；
所述混合酶EnzymeMix为2μl，2×Buffer为25μl，无菌双蒸水为50μl；
所述2×Buffer由Tris-盐酸、氯化钾、硫酸镁、硫酸铵、吐温-20和三磷酸脱氧核苷酸dNTPS组成。
进一步的，以提取的检测样品的RNA为模板，上述的一种猪繁殖与呼吸综合征病毒的多重RT-PCR检测试剂盒，在50μl反应体系中加入检测样品的RNA各3μl，EnzymeMix2μl，2×Buffer25μl，10μmol/L的所述引物对一和引物对二的使用量分别为0.8μl，然后加无菌的双蒸水至50μl，其中所述的2×Buffer是由Tris-HCl、KCl、MgSO4、（NH4）2SO4、Tween-20和dNTPS组成的。
本发明的第二个目的是提供了一种根据上述猪繁殖与呼吸综合征病毒的多重RT-PCR检测试剂盒在检测欧洲型和美洲型株猪繁殖与呼吸综合征病毒中的应用。
进一步的，上述的应用，所述猪繁殖与呼吸综合征病毒的多重RT-PCR检测试剂盒的使用方法为：从待检动物的血液或病死动物的组织中提取其全基因组RNA，以RNA为模板，以试剂盒中的特异性欧洲型和美洲型株猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒的引物进行多重RT-PCR，对得到的产物进行电泳，根据电泳图谱分析被检动物是否感染有欧洲型和美洲型株猪繁殖与呼吸综合征病毒。
进一步的，上述的应用，所述待检动物的血液或病死动物的组织的处理方式为用生理盐水稀释或研磨成1:5的乳悬液，全基因组RNA提取的方法采用Trizol法。
进一步的，上述的应用，所述RT-PCR反应程序为50℃30min，94℃2min，循环程序为94℃30s，58℃1min，72℃50s，共35个循环，最后72℃延伸10min。
本发明的有益效果为：本发明提供的一种猪繁殖与呼吸综合征病毒的多重RT-PCR检测试剂盒，较经典的病毒分离、单RT-PCR和血清型分型方法快捷，可以方便地一次性鉴定并区分出属于欧洲型和美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒中的任意一种，以便于对疫病情况及区域、环境做出及时快捷的反应，以最短的时间做出正确的处理办法，这对及时扑灭或阻断传染病的传播具有积极的意义，同时，本发明采取的提取全基因组RNA提取的Trizol法具有快速、简单、成本低和所需试剂少的特点，特别适于小样品的提取，本发明具有广泛的市场应用前景。
附图说明
图1为利用本发明提供的试剂盒检测标准样品的检测结果电泳图。
其中，从左至右依次为：M，DNA分子量标准DL-2000（marker条带的大小依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp）；泳道1为欧洲型和美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒的多重RT-PCR检测结果；泳道2为美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒的RT-PCR检测结果；泳道3为欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒的RT-PCR检测结果；泳道4为阴性对照。
图2本发明提供的试剂盒的敏感性试验结果电泳图。
其中，从左至右依次为：M，DNA分子量标准DL-2000（marker条带的大小依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp）；泳道1-5分别为4.0×105拷贝的RNA、4.0×104拷贝的RNA、4.0×103拷贝的RNA、4.0×102拷贝的RNA和4.0×101拷贝的RNA。
图3为本发明提供的试剂盒的特异性试验结果电泳图。
其中，从左至右依次为：M，DNA分子量标准DL-2000（marker条带的大小依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp）；泳道1为建立的欧洲型和美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒的多重RT-PCR检测结果；泳道2为建立的欧洲型和美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒的多重RT-PCR检测结果检测猪圆环病毒-2型病毒的结果；泳道3为建立的欧洲型和美洲型株猪繁殖与呼吸综合征病毒的多重RT-PCR检测猪细小病毒结果；泳道4欧洲型和美洲型株猪繁殖与呼吸综合征病毒的多重RT-PCR检测猪伪狂犬病毒结果；泳道5为欧洲型和美洲型株猪繁殖与呼吸综合征病毒的多重RT-PCR检测结果O型口蹄疫病毒的结果，泳道6为阴性对照。
具体实施方式
实施例1：
欧洲型和美洲型株猪繁殖与呼吸综合征病毒的多重RT-PCR检测试剂盒的使用方法：
1、欧洲型和美洲型株猪繁殖与呼吸综合征病毒的核酸提取：
采集待检动物的血液或病死动物的组织，制成1:5的乳悬液，用Trozol法提取其全基因组RNA，以RNA为模板，以试剂盒中的特异性欧洲型和美洲型株猪繁殖与呼吸综合征病毒的引物进行多重RT-PCR，对得到的产物进行电泳，根据电泳图谱分析被检动物是否感染有欧洲型和美洲型株猪繁殖与呼吸综合征病毒。
2、多重RT-PCR反应：
本试剂盒参照Genbank登录的欧洲型和美洲型株猪繁殖与呼吸综合征病毒的ORF-6编码区基因的序列，设计并合成两对引物。本试剂盒涉及多重RT-PCR扩增的引物序列及片段的大小如表1所示：
。
按照TaKaRa一步法RT-PCR试剂盒提供的50μl反应体系加入相应的PRRSV的RNA为模板为2μl，PRRSV特异的上下游引物0.8μl以及相应试剂进行RT-PCR反应。RT-PCR反应程序如下：50℃30min，94℃2min，然后是循环程序为94℃30s，58℃1min，72℃50s，35个循环。最后72延伸10min。RT-PCR反应在BIOMRTRA扩增仪中进行。
实施例2：
PRRSV多重RT-PCR方法的建立：
按照实施例1依次在Ep管中依次加入PRRSV的RNA为模板量分别为0.5μl-4μl，PRRSV特异的上下游引物分别为0.2μl-2μl，退火温度分别为57℃、58℃、59℃和60℃，然后分别进行RT-PCR扩增。试验结果如图1所示，在50μl反应体系加入相应的PRRSV的RNA为模板为2μl，PRRSV特异的上下游引物0.8μl，退火温度分别为58℃时，所获得的结果为最佳。
实施例3：
PRRSV多重RT-PCR方法的特异性和敏感性试验：
1、PRRSV多重RT-PCR的敏感性试验：
1.1欧洲型和美洲型PRRSV的定量：
欧洲型和美洲型PRRSV提取的病毒RNA按照4.0×105拷贝的RNA、4.0×104拷贝的RNA、4.0×103拷贝的RNA、4.0×102拷贝的RNA和4.0×101拷贝的RNA分别进行稀释。
1.2结果检测：
RT-PCR产物反应产物进行琼脂糖凝胶电泳。然后用溴化乙锭染色，BIO-RAD凝胶成像仪中照相并分析，电泳结果如图2所示，从图中可以看出欧洲型和美洲型PRRSV的多重RT-PCR可以特异的检出病毒目的基因,并且可以至少检出40拷贝的RNA。
2、建立的PRRSV多重RT-PCR的特异性试验：
2.1猪圆环病毒-2型病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒结果和O型口蹄疫病毒的提取和多重RT-PCRT反应：
分别用鉴定为阳性的猪圆环病毒-2型病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒结果和O型口蹄疫病毒中提取的RNA作为PRRSV的多重PT-PCR的反应模板，以健康猪的血液提取的RNA作为阴性对照模板。然后程序按照实施例1中的PRRSV的多重PT-PCR体系和条件进行反应，反应产物用琼脂凝胶电泳检测。
2.2特异性结果分析：
PRRSV与猪圆环病毒-2型病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒结果和O型口蹄疫病毒的RT-PCR方法交叉反应结果如图3所示。图3中2-6道分别是猪圆环病毒-2型病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒结果和O型口蹄疫病毒的核酸和健康猪血清的RNA。从图中可以看见上述四种病毒与欧洲型和美洲型PRRSV的多重PT-PCR方法无交叉反应。健康猪血液中提取的RNA的反应结果也为阴性。上述结果表明本实验所建立的欧洲型和美洲型PRRSV的多重RT-PCR方法与上述四种在临床症状表现相似的病毒无交叉反应。
3、欧洲型和美洲型PRRSV的多重PT-PCR临床样品检测：
3.1临床样品的准备：
共包括97份临床样品为猪繁殖与呼吸综合征国际参考实验室提供的欧洲型和美洲型PRRS阳性血清。
3.2多重RT-OCR检测结果：
对上述97个欧洲型和美洲型PRRSV阳性的临床样品用所建立的多重RT-PCR方法检测，多重PCR检测方法的敏感性比较检测结果如表2所示，从表中可以看出，多重RT-RCR方法对97个欧洲型和美洲型PRRSV为阳性的临床样品的检出率为97.05%和100%，比ELISA检出率要高约5个百分点。
。
4、结论：
上述试验证明所建立的欧洲型和美洲型PRRSV的多重PT-PCR方法方法具有敏感性高、特异性强、快速、实验设备简单和操作容易等特点，适合于实验室和临床对欧洲型和美洲型PRRSV的快速诊断。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>中国农业科学院兰州兽医研究所
<120>一种猪繁殖与呼吸综合征病毒的多重RT-PCR检测试剂盒及其应用
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>引物对一上游引物
<400>1
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<110>中国农业科学院兰州兽医研究所
<120>一种猪繁殖与呼吸综合征病毒的多重RT-PCR检测试剂盒及其应用
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<212>DNA
<213>引物对一下游引物
<400>2
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<110>中国农业科学院兰州兽医研究所
<120>一种猪繁殖与呼吸综合征病毒的多重RT-PCR检测试剂盒及其应用
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<212>DNA
<213>引物对二上游引物
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<120>一种猪繁殖与呼吸综合征病毒的多重RT-PCR检测试剂盒及其应用
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<213>引物对二下游引物
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<120>一种猪繁殖与呼吸综合征病毒的多重RT-PCR检测试剂盒及其应用
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<213>引物对一上游引物
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<120>一种猪繁殖与呼吸综合征病毒的多重RT-PCR检测试剂盒及其应用
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<213>引物对一下游引物
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<213>引物对二上游引物
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<120>一种猪繁殖与呼吸综合征病毒的多重RT-PCR检测试剂盒及其应用
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<213>引物对二下游引物
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