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1、(10)授权公告号 CN 102676528 B (45)授权公告日 2013.08.07 CN 102676528 B *CN102676528B* (21)申请号 201210173385.2 (22)申请日 2012.05.30 C12N 15/113(2010.01) C12N 15/85(2006.01) (73)专利权人 山东农业大学 地址 271018 山东省泰安市岱宗大街 61 号 (72)发明人 姜运良 张旭 康丽 王鹏飞 季相山 CN 102453716 A,2012.05.16, CN 102154288 A,2011.08.17, CN 102127545 A,2011。
2、.07.20, CN 101979547 A,2011.02.23, (54) 发明名称 一种骨骼肌特异性 MYHC- a 启动子及其应 用 (57) 摘要 本发明属于生物技术领域， 涉及一种骨骼肌 特异性 MYHC-IIa 启动子及其应用， 特别提供了一 种骨骼肌特异性表达基因 5调控区特异性启动 子及其在转基因猪中的应用， 该启动子只在骨骼 肌中具有启动特性， 而在除骨骼肌外的多种细胞 中均无启动活性， 可见该基因启动子只在骨骼肌 中特异性地启动下游基因的表达， 因此能够满足 目的基因在骨骼肌中特异性表达的要求， 为通过 转基因技术来提高猪肉的品质提供了一种重要的 元件。 (51)Int.。
3、Cl. (56)对比文件 审查员 安玉苹 权利要求书 1 页 说明书 7 页 序列表 3 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书7页 序列表3页 附图3页 (10)授权公告号 CN 102676528 B CN 102676528 B *CN102676528B* 1/1 页 2 1. 一种骨骼肌特异性 MYHC- a 启动子， 其特征在于 ： 该启动子的基因序列如 Seq ID No:1 所示。 权 利 要 求 书 CN 102676528 B 2 1/7 页 3 一种骨骼肌特异性 MYHC-IIa 启动子及其应用 技术领域 0001。
4、 本发明涉及分子遗传学领域， 具体涉及了一种骨骼肌特异性表达基因 5调控区 特异性 MYHC-Ha 启动子及其在转基因猪中的应用。 背景技术 0002 真核生物基因表达的时间和水平严格按照发育顺序进行。 某些特定基因表达模式 的调节能够引起转录因子与相关元件的特异性结合， 成为转录起始的关键步骤， 并最终导 致基因的时间和空间表达。 编码组织特异蛋白的系列家族基因严格按照组织特异性和发育 阶段性表达， 为基因表达调控机制提供了很好的研究模式。 在转基因动物中， 获得能广泛应 用的特异性启动子显得非常重要。但启动子的特异性由多个元件控制， 在不同种类和不同 发育时期起关键作用的调控元件并不相同，。
5、 调控元件和反式作用因子之间的相互作用也十 分复杂。因此要使外源基因能够在动物组织中特异高效地表达， 必须构建一个可以特异高 效表达的动物表达载体， 其中启动子的选择是重要的条件之一。 0003 肌球蛋白(myosin)是一组肌肉和非肌肉细胞收缩装置中的蛋白质， 具有ATP酶活 性。重链的大部分是 螺旋， 其头部具有 ATP 酶活性， 并与肌动蛋白结合， 而轻链具有激酶 活性。肌肉中的肌球蛋白是肌原纤维粗丝的组成单位。头部具有 ATP 酶活性， 属于可与肌 动蛋白丝相互作用的马达蛋白质 ； 肌球蛋白也是肌肉的主要组成蛋白质， 占肌原纤维总蛋 白质的 60。猪的骨骼肌肌球蛋白重链基因 MYHC-。
6、I、 MYHC-IIa、 MYHC-IIb、 MYHC-IIx 都位 于 12 号染色体。其中 MYHC-IIa 由 39 个外显子和 38 个内含子组成， 编码 1939 个氨基酸。 通过克隆该基因启动子区并在体外分析其启动特性， 利用相关序列构建骨骼肌特异性表达 载体是一种有效的方法， 但是上述的研究均还处在起步阶段， 对于转基因猪的培育和品质 提高均没有起到较好的促进作用。 发明内容 0004 基于上述的原因， 本发明的发明人经过研究发现猪骨骼肌肌球蛋白重链基因 MYHC-IIa 基因 5调控区具有骨骼肌特异性启动特性， 并利用这一特性设计了一种骨骼肌 特异性 MYHC-IIa 启动子载。
7、体， 该启动子可以在转基因猪的培育中应用。该启动子载体具有 骨骼肌特异性启动特性， 而在除骨骼肌外的多种细胞中均无启动活性， 可见该启动子在骨 骼肌中特异性地启动下游基因的表达， 能够满足目的基因在骨骼肌中特异性表达的要求， 为转基因载体提供了一种重要的元件。 0005 本发明所提供的骨骼肌特异性表达基因 5调控区特异性启动子， 其基因序列如 Seq IDNo ： 1 所示 ； 0006 除了上述的启动子之外， 还可以是该启动子变体或者片段， 但均具有如 Seq ID No ： 1 所示的基因序列。 0007 “变体” 是指对猪骨骼肌 MYHC-II a 启动子 Seq ID No ： 1 序。
8、列进行一个或者多个 碱基的任何取代、 变异、 修饰、 替换、 缺失或者添加所产生的序列， 该序列仍然表现出类似于 说 明 书 CN 102676528 B 3 2/7 页 4 Seq IDNo ： 1 DNA 序列的活性。 0008 “片段” 是指基本猪骨骼肌MYHC-II a启动子Seq ID No ： 1序列的一个或者多个区 域， 其仍然类似于基本 DNA 序列的活性。 0009 具有上述序列的启动子或其变体， 或者片段， 具有骨骼肌特异性启动特性， 而在骨 骼肌之外的多种细胞中均无启动活性， 可见该基因启动子在骨骼肌中特异性地启动下游基 因的表达， 能够满足目的基因在骨骼肌中特异性表达的。
9、要求， 并能应用于转基因猪的培育 中。 0010 应用上述的启动子时， 一般采用重组核酸序列， 该序列中含有上述的启动子或其 变体， 或者片段， 这样就可以使于启动子下游的目的基因在骨骼肌中特异性表达， 作为分 析、 开发、 改造骨骼肌特性的研究模型。 还可以利用已有的分子生物学操作技术获得包含目 的基因的重组核酸， 通过显微注射等基因导入技术获得转基因胚胎， 用于建立转基因动物。 重组核酸序列中的目的基因， 含有下列的至少一种功能基因， 主要包括提高肌肉品质基因， 加快生长速度基因， 抗病基因， 提高饲料报酬的基因以及生产特定药物的基因， 这样就可以 在获得骨骼肌特异性启动特性之外， 提高该。
10、重组核酸序列的性能， 为转基因猪的培养提供 更多的功能性方向， 增加其附加产值， 如将去饱和脂肪酸酶基因在该启动子指导下表达可 以特异性提高骨骼肌中不饱和脂肪酸的含量， 提高肉品营养价值。 0011 在获得了上述的重组核酸序列之后， 还可以用其建立特殊的表达系统， 以便更好 的应用于转基因猪的培育过程中。将目的基因重组至该启动子下游， 通过基因转入技术使 调控区与目的基因共同整合进染色体中， 获得转基因动物， 在该启动子作用下目的基因仅 在骨骼肌中表达， 在其他组织器官中不表达， 降低目的基因对动物的影响， 提高转基因的效 果。 0012 本发明主要通过报告基因分析确定该启动子的启动特征。 首。
11、先获得无启动子红色 荧光蛋白载体。然后通过 PCR 或者基因捕获等技术获得骨骼肌中特异性表达的猪骨骼肌肌 球蛋白重链II a型5调控区， 长度为2.07kb， 插入红色荧光蛋白上游， 得到启动子报告基 因分析载体， 将 CMV 启动子 (589bp) 连入空载体 DsRed 载体中作为阳性对照， 空载体 DsRed 载体为阴性对照。 质粒去内毒素后， 转染C2C12小鼠成肌细胞系， 同时转染H9c2大鼠心肌细 胞和猪肾上皮细胞系 PK15 为对照， 转染 24h 后更换含马血清的诱导培养基至成肌细胞， 诱 导细胞分化融合， 48h 后用倒置荧光显微镜观察红色荧光蛋白表达情况， 分析启动子特性。。
12、 其中之所以选择 CMV 连入的空载体中作为阳性对照， 主要是因为 CMV 为已知公认的强启动 子， 将强启动子连入无启动子的载体上游可以启动报告基因 RFP 的表达， 该载体转染如细 胞作为阳性对照， 可以证明实验中所用的细胞以及转染试剂、 转染技术等不存在问题， 证明 阴性对照无 RFP 表达是由于没有启动子的存在， 而不是其他因素造成。进而更有力的证明 连入实验启动子的载体转入细胞后启动 RFP 的表达是因为该启动子的作用。 0013 与现有技术相比， 本发明选用了独特的载体 DsRed 载体 ( 商业载体全称为 pDsRed-Express2-1vector)， 以适应本发明所采用的报。
13、告基因 RFP( 红色荧光蛋白 )， 同时 本发明为MYHC-II a特别设计了引物、 启动子序列以及酶切位点等供研究其使用， 均具有独 特的代表性， 因此与现有的骨骼肌特异性启动子， 相比， 本发明的技术具有明显的不同和显 著的进步和针对性。 0014 当上述的启动子， 或者重组核酸序列或者表达系统被应用到转基因猪的培育中 说 明 书 CN 102676528 B 4 3/7 页 5 后， 可以有效的提高培育的效果， 且通过添加各种功能性基因， 使得转基因猪可以获得更好 的肌肉品质， 更高的生长速度， 更好的抗病性以及降低饲养成本， 还可以在特定药物的生产 中得到更为广泛的应用， 对于该领域。
14、的研究有着很好的参考价值。 附图说明 0015 图 1 为 MYHC-II aF 和 MYHC-II aR 引物 PCR 扩增 MYHC-II a 启动子片段电泳图， 图中泳道 1 为 PCR 产物， M 为 MassRuler Maker ； 0016 图 2 为无启动子的 DsRed 载体图谱 ； 0017 图 3 为转染 MYHC-IIa promoter DsRed 48h 小鼠 C2C12 细胞照片灰度图， 0018 图中左侧为40倍光镜下照片， 细胞状态良好 ； 右侧为绿光激发下照片， 可见RFP表 达， MYHC-II a promoter 有启动活性 ； 0019 图 4 为转。
15、染 MYHC-II a promoter DsRed 48h 大鼠心肌 H9c2 细胞照片灰度图， 0020 图中左侧为 40 倍光镜下照片， 细胞状态良好 ； 右侧为绿光激发下照片， 无 RFP 表 达， MYHC-II a promoter 无启动活性 ； 0021 图 5 为转染 CMV Promoter DsRed 48h 猪心细胞照片灰度图， 0022 图中左侧为40倍光镜下照片， 细胞状态良好 ； 右侧为绿光激发下照片， 可见RFP表 达， 转染技术有效 ； 0023 图 6 为转染 MYHC-II a promoter DsRed 48hPK15 猪肾细胞照片灰度图， 0024 。
16、图中左侧为 40 倍光镜下照片， 细胞状态良好 ； 右侧为绿光激发下照片， 无 RFP 表 达， MYHC-II a promoter 无启动活性 ； 0025 图 7 为转染 CMV Promoter DsRed 48hPK15 猪肾细胞照片灰度图， 0026 图中左侧为40倍光镜下照片， 细胞状态良好 ； 右侧为绿光激发下照片， 可见RFP表 达， 转染技术有效。 具体实施方式 0027 在本说明书的上下文中， 除非特别指明否则本说明书所用的任何术语具有本领域 技术人员在本领域中通常理解的含义， 而未注明详细条件的实验方法是按照常规试验方法 或按照供应商所建议的操作说明书进行的。 0028。
17、 实施例 1 启动子报告基因载体的构建 0029 基因组提取 ： 取大约克夏猪耳组织， 按照 TIANamp genomic DNA( 天根 ) 试剂盒说 明书进行基因组 DNA 提取。 0030 无启动子的 DsRed 载体作为阴性对照 ； 以 DsRed 为骨架用 Sma I(Fermentas) 酶 切， 回收 4107bp 片段， 得到无启动子片段。将完整的 CMV 启动子正向连入该载体中， 得到该 载体的阳性对照载体。 0031 将包含阴性对照和阳性对照载体的菌液按照 1 ： 500 的比例分别接种至含卡那霉 素 100g/ml LB 培养基中， 200rpm 剧烈摇晃 14h。4 。
18、6000g 收集菌体至 50ml 离心管中， 用于无内毒素质粒提取， 具体操作按照EndoFree Plasmid Maxi(QIAGEN)说明书进行， 纯化 得到的质粒 A260/280 在 1.8-1.9 之间。 0032 根据 NCBI(Gene ID ： 397256) 设计如下引物， MYHC-II aF 基因序列如 Seq ID No ： 说 明 书 CN 102676528 B 5 4/7 页 6 2 所示， MYHC-II aR 基因序列如 Seq ID No ： 3 所示， 它包含了从转录起始位点下游 27bp 到 上游 2042bp 的范围。 0033 0034 按照如下体。
19、系配制 PCR 反应液 0035 0036 PCR 程序设定如下 0037 0038 将扩增后的产物与 6Loading buffer 混合上样至 0.8 TAE 琼脂糖凝胶， 5V/ cm 电泳 20min 后切胶回收， 按 Promega 琼脂糖凝胶纯化试剂盒纯化说明书操作得到纯 化产物， 同时用 T4Polynucleotide Kinase(Fermentas) 进行磷酸化处理， 无启动子的 DsRed 载体用 Sma I(Fermentas) 酶切， 同时加入 FastAPTM Thermosensitive Alkaline Phosphatase(Fermentas) 进 行 去。
20、 磷 酸 化 处 理，将 MYHC-II a 启 动 子 用 Rapid DNA Ligation(Fermentas) 与去磷酸化的载体连接， 并转化 DH5， 涂板后挑菌验证插入的正反 向并测序， 测序无误后获得MYHC-II a启动子DsRed质粒， 启动子序列如Seq ID No ： 1所示。 将包含测序正确的菌液按照 1 500 的比例接种至含卡那霉素 100g/ml LB 液体培养基 中， 200rpm 剧烈摇晃 14h。4 6000g 收集菌体至 50ml 离心管中， 用于无内毒素质粒提 取， 具体操作按照EndoFree Plasmid Maxi(QIAGEN)说明书进行， 纯。
21、化得到的质粒A260/280 在 1.8-1.9 之间。得到重组核酸 MYHC-IIa Promoter DsRed 载体， 并利用瞬时转染细胞的 方法在细胞水平上验证 MYHC-II a 启动子的启动特点。 0039 采用 MYHC-IIaF 和 MYHC-II aR 引物 PCR 扩增获得的 MYHC-II a 启动子片段电泳 图如图 1 所示。 0040 实施例 2 细胞培养与转染 0041 大鼠心肌细胞系 H9c2 培养在含 10vt胎牛血清 (Gibco) 的 DMEM(Gibco) 培养基 中， 培养条件为 37， 5 CO2， 保持细胞汇合度在 50。 0042 猪肾脏细胞系PK。
22、15培养在含10vt胎牛血清(Gibco)的DMEM(Gibco)培养基中， 培养条件为 37， 5 CO2。 说 明 书 CN 102676528 B 6 5/7 页 7 0043 小鼠成肌细胞系 C2C12 培养在含 10vt胎牛血清 (Gibco) 的 DMEM(Gibco) 培养 基中， 培养条件为 37， 5 CO2， 保持细胞汇合度在 50， 诱导培养基为含 2vt马血清 (Hyclone) 的 DMEM 培养基。 0044 将待转染的细胞用 1PBS(Gibco) 漂洗贴壁细胞两次， 加入 37预热的 0.05 胰酶 (Gibco)， 消化 5min， 加入无抗生素的完全培养基采。
23、用含 10vt胎牛血清 (Gibco) 的 DMEM(Gibco) 培养基重悬细胞， 细胞计数后每孔按 1104接种至 24 孔板， 12h 后用 37无 血清无抗生素DMEM(Gibco)培养基洗涤细胞一次， 每孔加入500l新鲜的无抗生素的完全 培养基， 12h 后进行转染， 此时细胞汇合度为 90 95。 0045 将阳性对照载体 CMV Promoter DsRed， 阴性对照载体无启动子的 DsRed， 实验 载体 MYHC-IIa Promoter DsRed 三种质粒同时转染小鼠成肌细胞系 C2C12， 大鼠心肌 细胞系 H9c2， 猪肾细胞系 PK15， 每孔将 750ng 质。
24、粒稀释至 100l opti-MEM 中， 加入 0.75l LipofectamineTMPLUS(Invitrogen)彻底混匀， 5min后加入3l LipofectamineTM LTX(Invitrogen) 转染试剂颠倒混匀， 25孵育， 30min 后轻轻加至每一孔中， 混匀。转染 12h后更换诱导培养基至C2C12细胞系中， 诱导细胞分化融合。 转染48h后与荧光倒置显微 镜下观察 RFP 表达情况 ： 阳性对照载载体的转染效率在 30 ( 如图 5 和图 7 所示 )， 阴性对 照载体转染后无红色荧光蛋白表达。转染 MYHC-II a Promoter DsRed 载体后， 。
25、只有经过诱 导分化的小鼠成肌细胞系C2C12有红色荧光蛋白表达(如图3所示)， 在大鼠心肌和猪肾细 胞系中均无红色荧光蛋白表达 ( 如图 4 和图 6 所示 )。 0046 转染结果表明只有在成熟的肌细胞中猪 MYHC-IIa 启动子才有启动活性， 在另一 种横纹肌心肌细胞中并没有启动活性， 在肾细胞中也无启动活性， 表明猪MYHC-II a启动子 具有骨骼肌特异性启动活性， 可以驱动目的基因在骨骼肌特异性表达。 0047 实施例 3 MYHC-II a 启动子变体功能 0048 根 据 制 造 商 的 说 明，利 用 Stratagene QuikChangeTM定 点 突 变 试 剂 盒 。
26、(Stratagene)， 设计突变引物构建该启动子变体， 包括核酸的缺失， 取代和插入。变更的启 动子通过序列测定验证突变。将突变后的启动子重组至目的基因上游， 驱动目的基因的表 达。 0049 实施例 4 串联 MYHC-IIa 启动子的应用 0050 根据 NCBI(Gene ID ： 397256) 设计如下引物， 上下游引物分别引入 XhoI、 KpnI 酶 切位点及保护碱基。MYHC-IIa2F 基因序列如 Seq ID No ： 4 所示， MYHC-II a2R 基因序列如 Seq IDNo ： 5 所示。 0051 0052 PCR 程序设定如下 0053 说 明 书 CN 。
27、102676528 B 7 6/7 页 8 0054 将扩增后的产物与 6Loading buffer 混合上样至 0.8 TAE 琼脂糖凝胶， 5V/cm 电泳 20min 后切胶回收 2.07kb 片段， 按 Promega 琼脂糖凝胶纯化试剂盒纯化说明书操作得 到纯化产物。用 XhoI、 KpnI(Fermentas) 酶切 PCR 纯化产物并回收酶切产物。 0055 将MYHC-II a Promoter DsRed载体用Xho I、 KpnI(Fermentas)酶切， 将酶切纯化 过的 MYHC-II a 调控区用 Rapid DNA Ligation(Fermentas) 与酶切。
28、后的载体连接， 并转化 DH5， 涂板后挑菌验证插入的正反向， 将包含正确插入方向的菌液按照 1 500 的比例接 种至含卡那霉素100g/ml LB液体培养基中， 200rpm剧烈摇晃14h。 4 6000g收集菌体 至50ml离心管中， 用于无内毒素质粒提取， 具体操作按照EndoFree Plasmid Maxi(QIAGEN) 说明书进行， 纯化得到的质粒 A260/280 在 1.8-1.9 之间。得到重组核酸 Double MYHC-IIa Promoter DsRed 载体， 并利用瞬时转染细胞的方法在细胞水平上验证双 MYHC-II a 启动子 的启动特点。 0056 将阳性对。
29、照载体 CMV Promoter DsRed， 阴性对照载体无启动子的 DsRed， 以及 上述的实验载体 Double MYHC-II a Promoter DsRed 三种质粒同时转染小鼠成肌细胞 系 C2C12， 大鼠心肌细胞系 H9c2， 猪肾细胞系 PK15， 每孔将 750ng 质粒稀释至 100l opti-MEM中， 加入0.75lLipofectamineTM PLUS(Invitrogen)彻底混匀， 5min后加入3l LipofectamineTM LTX(Invitrogen)转染试剂颠倒混匀， 25孵育， 30min后轻轻加至每一孔 中， 混匀。转染 12h 后更换。
30、诱导培养基至 C2C12 细胞系中， 诱导细胞分化融合。转染 48h 后 与荧光倒置显微镜下观察 RFP 表达情况 ： 阳性对照载载体的转染效率在 30， 阴性对照载 体转染后无红色荧光蛋白表达。转染 Double MYHC-II a Promoter DsRed 载体后， 只有经 过诱导分化的小鼠成肌细胞系 C2C12 有红色荧光蛋白表达， 在大鼠心肌和猪肾细胞系中均 无红色荧光蛋白表达。 0057 转染结果表明只有在成熟的肌细胞中猪 Double MYHC-II a 启动子才有启动活 性， 在另一种横纹肌心肌细胞中并没有启动活性， 在肾细胞中也无启动活性， 表明猪 Double MYHC-。
31、II a 启动子具有骨骼肌特异性启动活性， 可以驱动目的基因在骨骼肌特异性表达。 0058 实施例 5 MYHC-II a 启动子片段应用 0059 根据 NCBI(Gene ID ： 397256) 设计如下引物， 上下游引物分别引入 XhoI、 KpnI 酶 切位点及保护碱基。MYHC-II a3F 基因序列如 Seq ID No ： 6 所示， MYHC-IIa3R 基因序列如 Seq IDNo ： 7 所示。 0060 0061 PCR 程序设定如下 0062 说 明 书 CN 102676528 B 8 7/7 页 9 0063 将扩增后的产物与 6Loading buffer 混合。
32、上样至 1.5 TAE 琼脂糖凝胶， 5V/cm 电泳 10min 后切胶回收， 按 Promega 琼脂糖凝胶纯化试剂盒纯化说明书操作得 到纯化产物， 同时用 T4Polynucleotide Kinase(Fermentas) 进行磷酸化处理， 无启 动 子 的 DsRed 载 体 用 Sma I(Fermentas) 酶 切， 同 时 加 入 FastAPTM Thermosensitive Alkaline Phosphatase(Fermentas)进行去磷酸化处理， 将MYHC-II a启动子用Rapid DNA Ligation(Fermentas) 与去磷酸化的载体连接， 并转。
33、化 DH5， 涂板后挑菌验证插入的正反 向并测序， 测序无误后获得MYHC-IIa启动子DsRed质粒， 启动子序列如Seq ID No ： 8所示。 将包含测序正确的菌液按照 1 500 的比例接种至含卡那霉素 100g/ml LB 液体培养基 中， 200rpm剧烈摇晃14h。 46000g收集菌体至50ml离心管中， 用于无内毒素质粒提取， 具体操作按照EndoFree Plasmid Maxi(QIAGEN)说明书进行， 纯化得到的质粒A260/280在 1.8-1.9 之间。得到重组核酸 Segment MYHC-IIaPromoter DsRed 载体， 并利用瞬时转染细 胞的方法。
34、在细胞水平上验证 MYHC-II a 启动子的启动特点。 0064 将阳性对照载体 CMV Promoter DsRed， 阴性对照载体无启动子的 DsRed， 上述的 重组核酸实验载体 Segment MYHC-II a Promoter DsRed 三种质粒同时转染小鼠成肌细 胞系 C2C12， 大鼠心肌细胞系 H9c2， 猪肾细胞系 PK15， 每孔将 750ng 质粒稀释至 100l opti-MEM 中， 加入 0.75l LipofectamineTM PLUS(Invitrogen) 彻底混匀， 5min 后加入 3l LipofectamineTM LTX(Invitrogen。
35、) 转染试剂颠倒混匀， 25孵育， 30min 后轻轻加至 每一孔中， 混匀。转染 12h 后更换诱导培养基至 C2C12 细胞系中， 诱导细胞分化融合。转染 48h后与荧光倒置显微镜下观察RFP表达情况 ： 阳性对照载载体的转染效率在30， 阴性对 照载体转染后无红色荧光蛋白表达。转染 Segment MYHC-II a Promoter DsRed 载体后， 只 有经过诱导分化的小鼠成肌细胞系 C2C12 有红色荧光蛋白表达， 在大鼠心肌和猪肾细胞系 中均无红色荧光蛋白表达。 0065 转染结果表明只有在成熟的肌细胞中猪 Segment MYHC-II a 启动子才有启动 活性， 在另一种。
36、横纹肌心肌细胞中并没有启动活性， 在肾细胞中也无启动活性， 表明猪 Segment MYHC-II a 启动子具有骨骼肌特异性启动活性， 可以驱动目的基因在骨骼肌特异 性表达。 说 明 书 CN 102676528 B 9 1/3 页 10 0001 0002 序 列 表 CN 102676528 B 10 2/3 页 11 0003 序 列 表 CN 102676528 B 11 3/3 页 12 序 列 表 CN 102676528 B 12 1/3 页 13 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 102676528 B 13 2/3 页 14 图 4 图 5 说 明 书 附 图 CN 102676528 B 14 3/3 页 15 图 6 图 7 说 明 书 附 图 CN 102676528 B 15 。