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1、(10)申请公布号 CN 102618510 A (43)申请公布日 2012.08.01 CN 102618510 A *CN102618510A* (21)申请号 201210087951.8 (22)申请日 2012.03.29 C12N 9/02(2006.01) C12N 15/53(2006.01) C12N 15/63(2006.01) C12N 5/10(2006.01) C12N 1/21(2006.01) C12N 15/11(2006.01) C12N 15/82(2006.01) C12N 15/84(2006.01) A01H 5/00(2006.01) (71)申请。
2、人 南京农业大学 地址 210095 江苏省南京市玄武区卫岗 1 号 (72)发明人 万建民 赵志刚 江玲 张云辉 余晓文 刘喜 刘世家 陈亮明 (74)专利代理机构 南京天华专利代理有限责任 公司 32218 代理人 徐冬涛 (54) 发明名称 一种植物雄性育性相关蛋白及其编码基因与 应用 (57) 摘要 本发明公开了一种植物雄性育性相关蛋白及 其编码基因与应用。 本发明提供的蛋白质， 是如下 (a) 或 (b) 的蛋白质 ： (a) 由 SEQ ID NO.1 所示的 氨基酸序列组成的蛋白质 ； (b)将序列1的氨基酸 序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和 / 或缺 失和/或添加且与植物雄。
3、性育性相关的由SEQ ID NO.1 衍生的蛋白质。本发明的植物雄性育性相关 蛋白影响植物的花药开裂过程。抑制该蛋白编码 基因的表达可导致植物雄性育性降低， 并影响其 结实率， 从而可以培育雄性花药不开裂变异的转 基因植物和植物雄性不育系转基因植物。将所述 蛋白的编码基因导入雄性不育植物中， 可以培育 雄性可育转基因植物。所述蛋白及其编码基因可 以应用于植物遗传改良。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 9 页 序列表 7 页 附图 7 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 9 页 序列表 7 页 附图 7 页 1/1 页 。
4、2 1. 一种蛋白质， 具有如 (a) 或 (b) 所示的氨基酸残基序列 ： (a) 由 SEQ ID NO.1 所示的氨基酸序列组成的蛋白质 ； (b) 将 SEQ ID NO.1 所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和 / 或缺失 和 / 或添加衍生得到的与植物雄性育性相关的蛋白质。 2. 编码权利要求 1 所述蛋白的基因。 3. 根据权利要求 2 所述的基因， 其特征在于 ： 所述基因是如下 1) 或 2) 或 3) 或 4) 的 DNA 分子 ： 1)SEQ ID NO.2 所示的 DNA 分子 ； 2)SEQ ID NO. 所示的 DNA 分子 ； 3) 在严格条件下与 1。
5、) 或 2) 限定的 DNA 序列杂交且编码所述蛋白的 DNA 分子 ； 4) 与 1) 或 2) 或 3) 限定的 DNA 序列具有 90以上同源性， 且编码植物雄性育性相关 蛋白的 DNA 分子。 4. 含有权利要求 2 或 3 所述基因的重组表达载体、 表达盒、 转基因细胞系或重组菌。 5. 如权利要求 4 所述的重组表达载体， 其特征在于 ： 所述重组表达载体是在 pCAMBIA1305.1载体的EcoRI重组位点之间插入权利要求2或3所述基因得到的重组质粒。 6. 扩增权利要求 2 或 3 所述基因的全长及其任意片段的引物对， 优选 Primer1/ Primer2、 Primer3。
6、/Primer4 或 Primer5/Primer6。 7. 权利要求 1 所述蛋白， 权利要求 2 或 3 所述基因， 权利要求 4 所述重组表达载体、 表 达盒、 转基因细胞系或重组菌中的至少一种在植物育种中的应用。 8. 一种培育雄性可育转基因植物的方法， 是将权利要求 2 或 3 所述基因导入雄性不育 植物中， 得到雄性可育的转基因植物 ； 所述雄性不育植物为花粉育性低于 50的植物 ； 所 述雄性可育的转基因植物为花粉育性高于 90的转基因植物。 9.如权利要求7所述的方法， 其特征在于 ： 权利要求2或3所述基因通过权利要求4或 5 所述重组表达载体导入雄性不育植物中。 10.一种。
7、培育雄性不育系转基因植物的方法， 是抑制目的植物中权利要求2或3所述基 因的表达， 得到雄性不育系转基因植物 ； 所述目的植物为携带权利要求2或3所述基因的植 物。 权 利 要 求 书 CN 102618510 A 2 1/9 页 3 一种植物雄性育性相关蛋白及其编码基因与应用 技术领域 0001 本发明属于基因工程领域， 涉及一种植物雄性育性相关蛋白及其编码基因与应 用。 背景技术 0002 水稻花药的开裂特性是通过控制柱头上萌发的花粉量来影响植株的花粉育性， 是 影响水稻结实率的一个重要因素。在水稻籼粳杂种 F1 植株普遍存在较严重的花药不开裂 障碍， 主要表现为部分花药的一个或两个药室在。
8、开花时不开裂， 其花药表皮细胞形状不规 则， 膨大也不够充分。从解剖学方面分析， 花药不能正常开裂的原因有几方面， 一是亚种间 组合部分花药的 “药室间组织间隙” 未充分发育， 药隔维管束细胞结合紧密牢固， 开颖时药 室开裂困难造成部分花药的传粉障碍。二是发现花药的 “药室间组织间隙” 发育不够完善， 致使该杂种的成熟花药不能很好地开裂。此外， 还发现杂种花药中的核糖体状颗粒会引起 成熟花粉粒相互聚集， 使其不利散粉。 三是植株的裂药性受花粉不育基因互作控制， 不同杂 合座位内等位花粉不育基因互作导致杂种 F1 花药不开裂的程度不同， 不同杂合座位间非 等位花粉不育基因互作明显降低杂种 F1 。
9、的裂药程度， 杂种 F1 中含杂合花粉不育基因座位 数越多， 其裂药指数越小， 裂药程度越低。杂种 F1 花药不开裂的原因随其所含的杂合花粉 不育基因座位种类和数目不同而异， 总起来看主要包括 ： 药室退化、 花药缺乏裂腔或形成的 裂腔小、 药室严重畸形以及形成的 “弹簧” 弱等 ； 此外， 大量败育花粉的产生也可能是引起杂 种 F1 花药不开裂的原因之一。 0003 对于水稻这种自花授粉植物而言， 在花药发育后期必须经历一下三个时期才能顺 利完成开花授粉 ： 一是花药能够正常裂药， 使成熟的花粉粒释放在柱头上 ； 二是成熟的花 粉粒能和柱头亲和以及花粉粒在柱头上萌发 ； 最后是萌发的花粉管能。
10、伸长至胚囊中释放 2 个精细胞， 完成双受精的过程。 花药的正常开裂是开花植物受精的第一步， 在这个发育过程 中， 有许多的因素影响着花药的开裂。 其中植物激素就涉及到花药的裂药、 花粉的萌发和双 受精等过程。如植物激素生长素就是植物生长发育调控的核心激素， 生长素含量过高或过 低都会对植物的生长发育产生不利影响， 特别在花药的开裂以及花粉的萌发和生长。因此 在水稻花药合成的生长素的浓度必然要求有相应的机制严格控制它的含量。 否则将导致植 株的雄性不育出现。目前， 水稻花药开裂的机制并不清楚。 发明内容 0004 本发明的目的是提供一种植物雄性育性相关蛋白。 0005 本发明的另一目的是提供该。
11、蛋白的编码基因与应用。 0006 本发明提供的植物雄性育性相关蛋白 (OsRad1)， 来源于稻属水稻 (Oryza sativa var. 日本晴 )， 具有如 (a) 或 (b) 所示的氨基酸残基序列 ： 0007 (a) 由 SEQ ID NO.1 所示的氨基酸序列组成的蛋白质 ； 0008 (b) 将 SEQ ID NO.1 所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和 / 或 说 明 书 CN 102618510 A 3 2/9 页 4 缺失和 / 或添加衍生得到的与植物雄性育性相关的蛋白质。 0009 序列表中的序列1由300个氨基酸残基组成， 自第149至251位为2酮戊二酸。
12、-Fe2+ 加氧酶 (2OG-FeII Oxy) 结构域。 0010 为了使 (a) 中的 OsRad1 便于纯化， 可在由 SEQ ID NO.1 所示的氨基酸序列组成的 蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表 1 所示的标签。 0011 表 1 标签的序列 0012 标签 残基 序列 Poly-Arg 5-6( 通常为 5 个 ) RRRRR Poly-His 2-10( 通常为 6 个 ) HHHHHH FLAG 8 DYKDDDDK Strep-tag II 8 WSHPQFEK c-myc 10 EQKLISEEDL 0013 上述(b)中的OsRad1可人工合成， 也可先合成其编码基。
13、因， 再进行生物表达得到。 上述 (b) 中的 OsRad1 的编码基因可通过将 SEQ ID NO.2 所示的 DNA 序列中缺失一个或几 个氨基酸残基的密码子， 和 / 或进行一个或几个碱基对的错义突变， 和 / 或在其 5端和 / 或 3端连上表 1 所示的标签的编码序列得到。 0014 编码上述植物育性相关蛋白的基因 (OsRad1) 也属于本发明的保护范围。 0015 所述基因优选为如下 1) 或 2) 或 3) 所述的 DNA 分子 ： 0016 1)SEQ ID NO.2 所示的 DNA 分子 ； 0017 2)SEQ ID NO.3 所示的 DNA 分子 ； 0018 3) 在。
14、严格条件下与 1) 或 2) 限定的 DNA 序列杂交且编码所述蛋白的 DNA 分子 ； 0019 4) 与 1) 或 2) 或 3) 限定的 DNA 序列具有 90以上同源性， 且编码植物雄性育性 相关蛋白的 DNA 分子。 0020 含有以上任一所述基因的重组表达载体也属于本发明的保护范围。 0021 可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。 0022 所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。 所述植 物表达载体还可包含外源基因的 3 端非翻译区域， 即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与 mRNA 加工或基因表达的 DNA 片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺。
15、苷酸加入到 mRNA 前体的 3 端， 如农杆菌冠瘿瘤诱导 (Ti) 质粒基因 ( 如胭脂合成酶 Nos 基因 )、 植物基因 ( 如大豆 贮存蛋白基因 )3 端转录的非翻译区均具有类似功能。 0023 使用所述基因构建重组植物表达载体时， 在其转录起始核苷酸前可加上任何一种 增强型启动子或组成型启动子， 如花椰菜花叶病毒 (CAMV)35S 启动子、 玉米的泛素启动子 (Ubiquitin)， 它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用 ； 此外， 使用本发明的基因 构建植物表达载体时， 还可使用增强子， 包括翻译增强子或转录增强子， 这些增强子区域可 说 明 书 CN 102618510 。
16、A 4 3/9 页 5 以是 ATG 起始密码子或邻接区域起始密码子等， 但必需与编码序列的阅读框相同， 以保证 整个序列的正确翻译。 所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的， 可以是天然的， 也 可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。 0024 为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选， 可对所用植物表达载体进行 加工， 如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因 (GUS 基因、 萤光素酶基因等 )、 具有抗性的抗生素标记物 ( 庆大霉素标记物、 卡那霉素标记物等 ) 或是 抗化学试剂标记基因 ( 如抗除莠剂基因 ) 等。从转基因植物的安全性。
17、考虑， 可不加任何选 择性标记基因， 直接以逆境筛选转化植株。 0025 所 述 重 组 表 达 载 体 可 为 在 pCAMBIA1305.1 载 体 的 EcoRI 重 组 位 点 插 入 所 述 基 因 (OsRad1) 得 到 的 重 组 质 粒。 将 含 有 OsRad1 的 pCAMBIA1305.1 命 名 为 pCAMBIA1305.1-OsRad1。 0026 含有以上任一所述基因 (OsRad1) 的表达盒、 转基因细胞系及重组菌均属于本发 明的保护范围。 0027 扩增所述基因 (OsRad1) 全长或任一片段的引物对也属于本发明的保护范围， 所 述的引物对优选 Prim。
18、er1/Primer2、 Primer3/Primer4 或 Primer5/Primer6。 0028 有益效果 ： 0029 本发明的植物雄性育性相关蛋白影响植物的花药开裂过程。 抑制该蛋白编码基因 的表达可导致植物雄性育性(花粉育性和小穗育性)降低， 并影响其结实率， 从而可以培育 雄性花药不开裂变异的转基因植物和植物雄性不育系转基因植物。 将所述蛋白的编码基因 导入雄性不育植物中， 可以培育雄性可育转基因植物。所述蛋白及其编码基因可以应用于 植物遗传改良。 。 附图说明 0030 图 1 为野生型日本晴和突变体 Rad1 的开花期颖壳开裂比较。 0031 图 2 为野生型日本晴和突变体。
19、 Rad1 的开花期花药开裂比较。 0032 A、 C 为野生型日本晴的花药 ； B、 D 为 Rad1 为突变体的花药。 0033 图 3 为野生型日本晴和突变体 Rad1 的成熟花粉育性和花粉萌发比较。 0034 图4为野生型日本晴和突变体Rad1花粉管在柱头上的萌发和胚囊中的生长比较。 0035 a、 c 为野生型 ； b、 d 为突变体 Rad1。 0036 图 5 为野生型日本晴和突变体 Rad1 胚囊发育比较。 0037 a-d， i-l 为野生型的胚囊， e-h， m-p 为突变体的胚囊发育。 0038 图 6 为野生型日本晴和突变体 Rad1 种子发育过程和含糖量比较。 003。
20、9 图 7 为突变基因在第 4 染色体上的精细定位。 0040 图 8 为转基因植株进行 PCR 分子检测结果。 0041 泳道 18 为以 pCAMBIA1305.1-OsRad1 质粒为模板扩增作为正对照， 泳道 19 为未转 入 OsRad1 的突变体 DNA 为模板扩增作为负对照， 除了 10、 11、 12 外， 其余为转化获得的 14 株转 pCAMBIA1305.1-OsRad1 植株。 0042 图 9 为转 pCAMBIA1305.1-OsRad1 的 T0 代植株颖壳和花药的开裂。 0043 A 为颖壳， B 为花药。 说 明 书 CN 102618510 A 5 4/9 。
21、页 6 0044 图 10 载体 pCAMBIA1305.1 质粒图谱。 具体实施方式 0045 以下的实施例便于更好地理解本发明， 但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法， 如无特殊说明， 均为常规方法。 下述实施例中所用的试验材料， 如无特殊说明， 均为自 常规生化试剂商店购买得到的。 0046 实施例 1、 植物雄性育性相关蛋白及其编码基因的发现 0047 一、 水稻不育突变体 Rad1 的育性分析及其遗传分析 0048 在粳稻品种日本晴(水稻全基因组测序材料)的辐射诱变的大田中发现的一株颖 壳和花药不开裂的的水稻植株 Rad1， 该突变体表型能够稳定遗传， 其与野生型杂交在分离 后。
22、代出现了可育与不育两种类型的分离， 通过遗传分析为单隐性基因所控制。 此外， 利用外 源激素生长素处理日本晴能获得突变体的表型。 0049 与日本晴比较， 突变体的主要特征是 ： 营养生长和花器官发育基本正常， 具有 6 个 雄蕊和 1 个雌蕊。但在抽穗后， 突变体的小花不能张开， 不能使突变体的花丝伸张出来， 柱 头也不能外露出来 ( 见图 1)， 在体视镜下观察到突变体的花药不能正常开裂， 使花粉粒从 药室中散落出来， 用扫描电镜观察也得到一致的结果 ( 见图 2)。 0050 用 1的碘 - 碘化钾和 DAPI 染料对野生型和突变体的花粉进行染色， 结果表明野 生型和突变体的花粉粒的淀粉。
23、能够正常形成， 花粉粒后期的 3 核细胞也能够正常形成， 初 步表明野生型和突变体的花粉育性没有差异 ； 但在固体培养基上， 野生型的花粉能够正常 萌发和生长， 但突变体的花粉粒不能正常萌发和生长 ( 见图 3)， 该结果表明突变体的花粉 不能萌发是导致其败育的主要原因之一。 用激光共聚焦显微镜对野生型和突变体的花粉在 柱头上的萌发和生长进行观察， 野生型的花粉能在自身柱头上萌发和生长， 花粉管能生长 到胚珠， 分别与卵细胞和极核完成双受精的过程 ； 突变体的花粉不能在自身的柱头上萌发 和生长， 也就不能完成双受精 ( 见图 4)。 0051 另外， 利用激光扫描共聚焦显微技术对野生型和突变体。
24、的胚囊发育进行详细的观 察， 结果发现在胚囊成熟时期以前， 野生型和突变体的胚囊发育没有差异， 突变体的成熟的 胚囊具有 7 个细胞 8 个核的结构， 该结果表明突变体的胚囊是正常的。由于突变体的花药 不能正常开裂， 花粉不具备萌发能力， 导致突变体的胚囊不能正常授粉受精， 但突变体子房 能够发育膨大导致突变体的胚囊在后期单性结实 ( 见图 5)。随后， 对野生型和突变体籽粒 的蔗糖和淀粉含量进行了测定， 结果表明由于突变体的胚乳细胞器不能正常形成， 光合作 用的产物蔗糖不能转化成淀粉， 在突变体的籽粒中也就没有淀粉的积累和形成 ( 见图 6)。 0052 二、 突变基因定位 0053 1、 。
25、突变基因初步定位 0054 用突变体Rad1与广亲和品种Dular(来自中国农业科学院作物科学研究所种质资 源库 ) 杂交， 在 Rad1/Dular 的 F2分离群体中随机选取花粉半不育单株 20 株及可育单株 20 株， 分别将各株的叶片等量混合后提取 DNA， 构成 1 个半不育混合基因组池和 1 个可育混合 基因组池。用覆盖水稻全基因组的 565 对 SSR 引物对不育池和可育池及 Rad1 和 Dular 进 行多态性分析， 将花粉不育基因Rad1(rice anther dehiscence 1)定位在第4染色体上标 记 Z425 和 Z429 之间。 说 明 书 CN 10261。
26、8510 A 6 5/9 页 7 0055 上述 SSR 标记分析的方法如下所述 ： 0056 (1) 提取上述选取单株的总 DNA 作为模板， 具体方法如下 ： 0057 取 0.2 克左右的水稻幼嫩叶片， 置于 2.0ml Eppendorf 管中， 管中放置一粒钢 珠， 把装好样品的Eppendorf管在液氮中冷冻5min， 置于2000型GENO/GRINDER仪器上粉碎 样品 1min。 0058 加入 660l 提取液 ( 含 100mM Tris-Hcl(PH 8.0)， 20mM EDTA(PH 8.0)， 1.4M NaCl， 0.2g/ml CTAB 的溶液 )， 漩涡器上。
27、剧烈涡旋混匀， 冰浴 30min。 0059 加入 40l 20 SDS， 65温浴 10min， 每隔两分钟轻轻上下颠倒混匀。 0060 加入 100l 5M NaCl， 温和混匀。 0061 加入 100l 10CTAB， 65温浴 10min， 间断轻轻上下颠倒混匀。 0062 加入 900l 氯仿， 充分混匀， 12000rpm 离心 3min。 0063 转移上清液至1.5mL Eppendorf管中， 加入600l异丙醇， 混匀， 12000rpm离心 5min。 0064 弃上清液， 沉淀用 70 ( 体积百分含量 ) 乙醇漂洗一次， 室温凉干。 0065 加入 100l 1TE。
28、(121 克 Tris 溶于 1 升水中， 用盐酸调 PH 值至 8.0 得到的溶 液 ) 溶解 DNA。 0066 取 2l 电 泳 检 测 DNA 质 量， 并 用 DU800 分 光 光 度 仪 测 定 浓 度 (Beckman Instrument Inc.U.S.A)。 0067 (2) 将上述提取的 DNA 稀释成约 20ng/l， 作为模板进行 PCR 扩增 ； 0068 PCR 反 应 体 系 (10l) ： DNA(20ng/ul)1ul， 上 游 引 物 (2pmol/ul)1ul， 下 游 引 物 (2pmol/ul)1ul， 10 xBuffer(MgCl2 free)。
29、1ul， dNTP(10mM)0.2ul， MgCl2(25mM)0.6ul， rTaq(5u/ul)0.1ul， ddH2O 5.1ul， 共 10ul。 0069 PCR 反应程序 ： 94.0变性 5min ； 94.0变性 30s、 55退火 30s、 72延伸 1min， 共循环 35 次 ； 72延伸 7min ； 10保存。PCR 反应在 MJ Research PTC-225 热循环仪中进 行。 0070 (3)SSR 标记的 PCR 产物检测 0071 扩增产物用 8非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。以 50bp 的 DNA Ladder 为对照 比较扩增产物的分子量大小， 银染。
30、显色。 0072 2、 突变基因精细定位 0073 根据初步定位的结果， 在突变基因所在区域附近寻找公共图谱上的分子标记， 并 自行开发 SSR 标记。用 F2群体中的不育单株验证， 在该染色体的相关区段筛选更多标记进 一步定位突变体基因。从 Rad1/Dular 衍生的 18000 株 F2分离群体中挑出确认为隐性的单 株 2100 株 (F2群体中的突变株表型的水稻植株 ) 用于突变基因精细定位。利用公共图谱 上的分子标记和基于水稻基因组序列数据自行开发的 SSR、 Indel 分子标记对突变基因进 行了精细定位， 并根据定位结果初步确定突变基因， 具体方法如下 ： 0074 (1)SSR。
31、 标记开发 0075 将公共图谱的 SSR 标记与水稻基因组序列进行整合， 下载突变位点附近的 BAC/ PAC 克隆序列。用 SSRHunter( 李强等， 遗传， 2005， 27(5) ： 808-810) 或 SSRIT 软件搜索克隆 中潜在的 SSR 序列 ( 重复次数 6) ； 将这些 SSR 及其邻近 400 500bp 的序列在 NCBI 通 说 明 书 CN 102618510 A 7 6/9 页 8 过BLAST程序在线与相应的籼稻序列进行比较， 如果两者的SSR重复次数有差异， 初步推断 该 SSR 引物的 PCR 产物在籼、 粳间存在多态性 ； 再利用 Primer P。
32、remier 5.0 软件设计 SSR 引物， 并由上海英俊生物技术有限公司合成。将自行设计的 SSR 成对引物等比例混合， 检测 其在 Rad1 和 Dular 之间的多态性， 表现多态者用作精细定位 pss1 基因的分子标记。用于 精细定位的分子标记见表 2。 0076 表 2 用于精细定位的分子标记 0077 0078 (2)InDel 标记开发 0079 InDel 引物设计 ： 对 Dular 在 Rad1 基因所在位置附近的部分区段进行测序， 并与 日本晴相对应的序列进行比对， 发现两者之间存在的 SNPs， 以这些 SNPs 为基础用软件设计 InDel 标记， 同时运用 Pri。
33、mer Premier 5.0 软件设计对应的另一条引物， 见表 2。 0080 InDel 标 记 分 析 的 PCR 反 应 体 系 ： DNA(20ng/ul)2ul， Primer1(10pmol/ ul)2ul， Primer2(10pmol/ul)2ul， 10 xBuffer(MgCl2 free)2ul， dNTP(10mM)0.4ul， MgCl2(25mM)1.2ul， rTaq(5u/ul)0.4ul， ddH2O 10ul， 总体积 20ul。 0081 扩增反应在 PTC-200(MJ Research Inc.)PCR 仪上进行 ： 94 3min ； 94 30s。
34、ec， 55 ( 引物不同， 有所调整 )45sec， 72 2.5min， 35 个循环 ； 72 5min。 0082 PCR 产物纯化回收， 按试剂盒 ( 北京 Tiangen 公司 ) 步骤进行。PCR 产物酶切消化 过夜后， 用 1-4的琼脂糖凝胶中电泳分离， 经 EB 染色后于紫外灯下观察拍照。dCAPS 用 说 明 书 CN 102618510 A 8 7/9 页 9 8的非变性 PAGE 胶分离， 银染。 0083 根据 F2群体中抽穗期单株的分子数据和表型数据， 按照 Zhang 等报道的 “隐性极 端个体基因作图” 方法计算基因位点与标记位点之间的重组率 c， 即 c (N。
35、1+N2/2)/N， 其中 N 表示被调查不育个体总数， N1表示出现显性基因携带亲本纯合带型的单株个体数， N2表示 出现两亲本杂合带型的单株个体数。最终把 Rad1 基因精细定位在标记 Z425 和 Z429 之间， Rad1 基因距标记 Z425 和 Z429 的物理距离约为 52kb( 图 7)。 0084 (3) 突变基因的获得 0085 根据定位的位点设计引物， 序列如下所述 ： 0086 primer1( 下划线所示的序列为 EcoRI 重组位点 ) ： 0087 5 -CCATGATTACGAATTCCCTTTTCATAATCAGACAGAGA-3 (SEQ ID NO.4) 。
36、0088 primer2( 下划线所示的序列为 EcoRI 重组位点 ) ： 0089 5 -TACCGAGCTCGAATTCCGTAGAGTAGCATAGTGGCATC-3 (SEQ ID NO.5) 0090 以 primer1 和 primer2 为引物， 以日本晴的基因组 DNA 为模板， 进行 PCR 扩增获得 目的基因。 该对引物位于SEQ ID NO.2上游3.2kb和下游1.6kb， 扩增产物包含了该基因的 启动子部分。 0091 扩增反应用 KOD 酶扩增 ( 购自 TOYOBO 公司 )， 在 PTC-200(MJ Research Inc.)PCR 仪上进行 ： 94 2。
37、min ； 98 10sec， 60 30sec， 68 10min， 35 个循环 ； 68 20min。将 PCR 产物回收纯化后重组 (In-HD Cloning Kit 重组试剂盒， Takara 公司 ) 克隆到载 体pCAMBIA1305.1载体上(CAMBIA是一个独立的、 非营利的国际研究组织)， 转化大肠杆菌 DH5 感受态细胞 ( 北京全式金公司 Trans10)， 挑选阳性克隆后， 进行测序。 0092 序列测定结果表明， PCR 反应获得的片段包含 SEQ ID NO.2 所示的核苷酸序列， 编 码 300 个氨基酸残基组成的蛋白质 ( 见 SEQ ID NO.1)。将。
38、 SEQ ID NO.1 所示的蛋白命名为 OsRad1， 将编码 SEQ ID NO.1 所示的蛋白的基因命名为 OsRad1。 0093 实施例 2、 转基因植物的获得和鉴定 0094 一、 重组表达载体构建 0095 以日本晴 ( 购自中国农业科学院作物科学研究所种质资源库 ) 的基因组 DNA 为模 板， 进行 PCR 扩增获得 OsRad1 基因， PCR 引物序列如下 ： 0096 primer1( 下划线所示的序列为 EcoRI 重组位点 ) ： 0097 5 -CCATGATTACGAATTCCCTTTTCATAATCAGACAGAGA-3 (SEQ ID NO.4) 0098。
39、 primer2( 下划线所示的序列为 EcoRI 重组位点 ) ： 0099 5 -TACCGAGCTCGAATTCCGTAGAGTAGCATAGTGGCATC-3 (SEQ ID NO.5) 0100 上述引物位于SEQ ID NO.2所示基因的上游3.2kb和下游1.6kb， 扩增产物包含了 该基因的启动子部分， 将 PCR 产物回收纯化。采用 In-HD Cloning Kit 重组试剂 盒 (Takara 公司 ) 将 PCR 产物克隆到载体 pCAMBIA1305.1( 图 10) 中。 0101 采用 In-HD Cloning Kit 重组试剂盒 (Takara 公司 ) 将 。
40、PCR 产物克隆到 载体 pCAMBIA1305.1 中。 0102 In-Fusion 重 组 反 应 体 系 (10L) ： PCR 产 物 10-200ng， 经 EcoRI 酶 切 回 收 pCAMBIA1305.1 载体 50-200ng， 5In-Fusion HD Enzyme Premix 2L， Deionized water to 10L。 枪头吹打混匀后将混合体系50反应15min后置于冰上， 取2L反应体系用热 说 明 书 CN 102618510 A 9 8/9 页 10 激法转化大肠杆菌 DH5 感受态细胞 ( 北京全式金公司 ； Trans10)。将全部转化细胞均。
41、匀 涂布在含 100mg/L 卡那霉素的 LB 固体培养基上。37培养 12-16h， 挑取克隆阳性克隆， 进 行测序。测序结果表明， 得到了含有 SEQ ID NO.3 所示 OsRad1 基因的重组表达载体， 将含 有 OsRad1 的 pCAMBIA1305.1 命名为 pCAMBIA1305.1-OsRad1。 0103 二、 重组农杆菌的获得 0104 用电击法将 pCAMBIA1305.1-OsRad1 转化农杆菌 EHA105 菌株 ( 购自美国英俊公 司 )， 得到重组菌株， 提取质粒进行 PCR 及酶切鉴定。将 PCR 及酶切鉴定正确的重组菌株命 名为 EH-pCAMBIA1。
42、305.1-OsRad1。 0105 三、 转基因植物的获得 0106 将 EH-pGD625-OsRad1 转化水稻育性突变体 Rad1， 具体方法为 ： 0107 (1)28培养EH-pGD625-OsRad1 16小时， 收集菌体， 并稀释到含有100mol/L的 N6 液体培养基 (Sigma 公司， C1416) 中至浓度为 OD600 0.5， 获得菌液 ； 0108 (2) 将培养至一个月的 Rad1 水稻 ( 利用外源激素生长素 IAA(10-2mol) 处理日本 晴， 也能得到突变体的表型 ) 成熟胚胚性愈伤组织与步骤 (1) 的菌液混合侵染 30min， 滤纸 吸干菌液后转。
43、入共培养培养基 (N6 固体共培养培养基， Sigma 公司 ) 中， 24共培养 3 天 ； 0109 (3) 将 步 骤 (2) 的 愈 伤 接 种 在 含 有 100mg/L 巴 龙 霉 素 (Phyto Technology Laboratories 公司 ) 的 N6 固体筛选培养基上第一次筛选 (16 天 ) ； 0110 (4) 挑取健康愈伤转入含有 100mg/L 巴龙霉素的 N6 固体筛选培养基上第二次筛 选， 每 15 天继代一次 ； 0111 (5)挑取健康愈伤转入含有50mg/L巴龙霉素的N6固体筛选培养基上第三次筛选， 每 15 天继代一次 ； 0112 (6) 挑取。
44、抗性愈伤转入分化培养基上分化 ； 0113 得到分化成苗的 T0代阳性植株。以转 pCAMBIA1305.1 空载体的突变体 Rad1 为阴 性对照。 0114 四、 转基因植株的鉴定 0115 1、 PCR 分子鉴定 0116 将步骤三获得的 T0代阳性植株提取基因组 DNA， 以基因组 DNA 为模板， 利用 pCAMBIA1305.1 上 SEQ ID NO.3 插入位点左边界附近的引物 Primer3 和 SEQ ID NO.3 上 的引物 Primer4 作为引物对进行扩增 (Primer3 ： 5 -TTAGGCACCCCAGGCTTTAC-3 (SEQ ID NO.6) 和 Pr。
45、imer4 ： 5 -ACAAATAGGGATAACTTAGCACA-3 (SEQ ID NO.7)， 扩增长度 882bp。 同时利用序列 3 上的引物 Primer5 和 pCAMBIA1305.1 上序列 3 插入位点右边界附近的引物 Primer6 作为引物对进行扩增 (Primer5 ： 5 GAGAAGAGCAGCGGACTACAGA 3 (SEQ ID NO.8) 和 Primer6 ： 5 -CAGGGTTTTCCCAGTCACGA-3 (SEQ ID NO.9)， 扩增长度1077bp。 PCR反应体系 ： DNA(20ng/ul)2ul， Primer1(10pmol/ul。
46、)2ul， Primer2(10pmol/ul)2ul， 10 xBuffer(MgCl2 free)2ul， dNTP(10mM)0.4ul， MgCl2(25mM)1.2ul， rTaq(5u/ul)0.4ul， ddH2O 10ul， 总体积 20ul。扩增反应在 PTC-200(MJ Research Inc.)PCR 仪上进行 ： 94 3min ； 94 30sec， 55 45sec， 72 1min， 35 个循环 ； 72 5min。 0117 用试剂盒 ( 北京 Tiangen 公司 ) 纯化回收 PCR 产物。PCR 产物用 1的琼 脂糖电泳检测。结果表明获得 14 株 。
47、PCR 检测阳性的植株。见图 8， 图 8 中泳道 18 为 说 明 书 CN 102618510 A 10 9/9 页 11 以 pCAMBIA1305.1-OsRad1 质粒为模板扩增作为正对照， 泳道 19 为未转入 OsRad1 的 突变体 DNA 为模板扩增作为负对照， 除了 10、 11、 12 外， 其余为转化获得的 14 株转 pCAMBIA1305.1-OsRad1 植株。 0118 2、 表型鉴定 0119 分别将 T0代转 pCAMBIA1305.1-OsRad1 植株、 Rad1 突变体和日本晴种植在南京农 业大学水稻试验站， 水稻植株在开花时， 观察野生型和突变体和转。
48、基因植株的颖壳开裂以 及花药的开裂情况， 见图 9。 0120 日本晴的花药开裂为 98， 小穗育性为 95。14 株转 pGD625-Rad1 植株中， 7 株 的花粉开裂正常， 对应的小穗育性达到85以上， 与日本晴的结实率相当。 转空载体对照的 突变体Rad1花粉不开裂， 小穗育性为0， 仍然表现为不育。 验证了转基因前的雄性不育性状 是由 Rad1 基因控制的， 即该 Rad1 基因为雄性育性相关基因。 说 明 书 CN 102618510 A 11 1/7 页 12 0001 序 列 表 CN 102618510 A 12 2/7 页 13 0002 0003 序 列 表 CN 10。
49、2618510 A 13 3/7 页 14 0004 序 列 表 CN 102618510 A 14 4/7 页 15 0005 序 列 表 CN 102618510 A 15 5/7 页 16 0006 序 列 表 CN 102618510 A 16 6/7 页 17 0007 序 列 表 CN 102618510 A 17 7/7 页 18 序 列 表 CN 102618510 A 18 1/7 页 19 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102618510 A 19 2/7 页 20 图 3 说 明 书 附 图 CN 102618510 A 20 3/7 页 21 图 4 说 明 书 附 图 CN 102618510 A 21 4/7 页 22 图 5 说 明 书 附 图 CN 102618510 A 22 5/7 页 23 图 6 图 7 说 明 书 附 图 CN 102618510 A 23 6/7 页 24 图 8 图 9 说 明 书 附 图 CN 102618510 A 24 7/7 页 25 图 10 说 明 书 附 图 CN 102618510 A 25 。