旋毛虫副肌球蛋白H-2d限制性Th表位P2、其组合物及应用.pdf

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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201510012293.X (22)申请日 2015.01.09 C07K 14/435(2006.01) C12N 15/12(2006.01) C07K 19/00(2006.01) A61K 39/00(2006.01) A61K 47/48(2006.01) A61P 33/10(2006.01) A01N 47/44(2006.01) A01P 5/00(2006.01) C07K 16/18(2006.01) A61K 39/395(2006.01) (71)申请人 首都医科大学 地址 100069 北京市丰台区右安门外西头。

2、条 10 号 (72)发明人 诸欣平 顾园 杨静 黄京京 (74)专利代理机构 中国国际贸易促进委员会专 利商标事务所 11038 代理人 刘海罗 (54) 发明名称 旋毛虫副肌球蛋白 H-2d 限制性 Th 表位 P2、 其组合物及应用 (57) 摘要 本发明属于免疫生物学领域， 涉及旋毛虫副 肌球蛋白 H-2d 限制性 Th 表位 P2、 其组合物及应 用。具体地旋毛虫副肌球蛋白 Th2 表位， 所述为 或者包含 SEQ ID NO ： 2 5 中任一项所示的氨基 酸序列。本发明的表位能够刺激 / 促进脾淋巴细 胞显著增殖， 刺激 / 促进小鼠脾细胞 CD4+T 细胞增 高， 刺激 / 促。

3、进 Th0 细胞向 Th2 分化， 刺激 / 促进 Th1 型细胞因子 IFN-、 IL-2 以及 Th2 型细胞因 子IL-4、 IL-5升高 ； 刺激/促进Th0细胞向Th2细 胞分化， 免疫小鼠后均可诱导产生 Th2 免疫反应， 具有应用于制备疫苗例如多表位疫苗的潜力。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书9页 序列表5页 附图6页 CN 105820228 A 2016.08.03 CN 105820228 A 1/1 页 2 1.一种分离的多肽， 其为或者包含 SEQ ID NO ： 2 5 中任一项所示的氨基酸序。

4、列。 2.一种分离的多核苷酸， 其编码权利要求 1 所述的多肽。 3.一种抗原表位偶联物， 包括抗原表位和偶联部分， 其中， 所述抗原表位为权利要求 1 所述的任一多肽， 所述偶联部分为选自放射性核素、 药物、 毒素、 细胞因子、 酶、 荧光素、 载体 蛋白和生物素中的一种或多种 ； 具体地， 所述偶联部分为载体蛋白 BSA 或 KLH。 4.一种组合物， 其包含一种或多种权利要求 1 所述的多肽位， 和 / 或一种或多种权利 要求 3 所述的抗原表位偶联物， 以及任选的药学上可接受的辅料例如佐剂 ； 具体地， 所述组 合物为疫苗制剂 ； 具体地， 所述疫苗制剂为表位疫苗制剂 ； 更具体地， 。

5、所述表位疫苗制剂还 包含一个或多个 Ts-Pmy 的 B 细胞表位 ； 特别具体地， 所述 Ts-Pmy 的 B 细胞表位为选自 SEQ ID NO ： 13 17 中任一项所示的氨基酸序列。 5.任意一种或者几种权利要求1所述的多肽或者权利要求3所述的抗原表位偶联物在 制备治疗和 / 或预防旋毛虫感染的药物中的用途。 6.一种在体外抗旋毛虫的方法， 包括使用有效量的任意一种或者几种权利要求 1 所述 的多肽或者权利要求 3 所述的抗原表位偶联物的步骤。 7.任意一种或者几种权利要求1所述的多肽或者权利要求3所述的抗原表位偶联物在 制备促进或刺激脾淋巴细胞分泌 IL-4、 IL-5、 IFN-。

6、 和 / 或 IL-2 的药物或试剂， 或者在制 备刺激 / 促进 Th0 细胞向 Th2 细胞分化的药物或试剂中的用途。 8.一种抗体， 其能够特异性地结合权利要求 1 所述的多肽或者权利要求 3 所述的抗原 表位偶联物。 9.一种抗体偶联物， 包括抗体部分和偶联部分， 其中， 所述抗体部分为权利要求 8 所述 的抗体， 所述偶联部分为选自放射性核素、 药物、 毒素、 细胞因子、 酶、 荧光素、 载体蛋白和生 物素中的一种或多种。 10.一种药物组合物， 其包含权利要求 8 所述的抗体或者权利要求 9 所述的抗体偶联 物 ； 可选地， 所述药物组合物还包含药学上可接受的载体或辅料。 权 利 。

7、要 求 书 CN 105820228 A 2 1/9 页 3 旋毛虫副肌球蛋白 H-2d 限制性 Th 表位 P2、 其组合物及应 用 技术领域 0001 本发明属于免疫生物学领域， 涉及旋毛虫副肌球蛋白 Th2 表位例如旋毛虫副肌球 蛋白 H-2d 限制性 Th 表位 P2。本发明还涉及其组合物及应用。 背景技术 0002 旋毛虫病是一种呈全球性分布的人兽共患寄生虫病。人的感染主要来源于高致 病性的旋毛形线虫 (Pozio E.World distribution of Trichinella spp.infections in animals and humans.J.Vet Parasi。

8、tol,2007,149(1-2):3-21.)。由于旋毛虫病临床症 状复杂， 包括腹泻， 发热， 肌痛， 水肿等， 令其难以正确诊断， 对及时的药物治疗造成了一定 困难且药物治疗不能解决该虫的反复感染问题 (Gottstein B,Pozio E,Nockler K.Epide miology,diagnosis,treatment,and control of trichinellosis.J.Clin Microbiol Rev,2009,22(1):127-145.)。 旋毛虫病的流行， 不仅直接威胁着人类的身体健康， 而且对畜 牧业、 肉食品业以及外贸出口等造成重大经济损失， 是我国。

9、 “十一五” 期间重点攻克的食源 性寄生虫病之一。 0003 副肌球蛋白 (paramyosin， Pmy) 是多种无脊椎动物主要的结构蛋白， 在寄生 性蠕虫的不同发育阶段呈持续性表达， 是参与肌肉收缩的粗肌丝的主要成分 (Epstein H F,Miller D R,Ortiz I,et al.Myosin and paramyosin are organized about a newly identified core structureJ.J Cell Biol,1985,100(3):904-915.)。在 某些寄生蠕虫的非肌肉部位， 如体表、 消化道和生殖道也有副肌球蛋白的分布 (。

10、Zhao Q P,Moon S U,Na B K,et al.Paragonimus westermani:biochemical and immunological characterizations of paramyosin.J.Exp Parasitol,2007,115(1):9-18.Matsumoto Y,Perry G,Levine R J,et al.Paramyosin and actin in schistosomal tegumentsJ. Nature,1988,333(6168):76-78.)。副肌球蛋白同时也是免疫调节分子， 在寄生性蠕虫与 宿主的相互作用中发挥。

11、重要功能 (Loukas A,Jones M K,King L T,et al.Receptor for Fc on the surfaces of schistosomes.J.Infect Immun,2001,69(6):3646-3651.Deng J,Gold D,Loverde P T,et al.Inhibition of the complement membrane attack complex by Schistosoma mansoni paramyosin.J.Infect Immun,2003,71(11):6402-6410.)。 旋 毛虫的副肌球蛋白基因 (Ts-。

12、Pmy GenBank accession No. ： EF429310) 全长为 2996bp， 其开 放读码框架 (ORF)2655bp， 编码 885 个氨基酸， 理论分子量为 102kDa。 0004 近年来免疫学的进展使人们认识到蛋白质抗原并非通过其完整分子发挥功能， 而 是由抗原分子中具有特异性的特殊化学基团， 即表位 (epitope) 来完成的。 0005 此外， 一种新型疫苗， 即表位疫苗的出现为病原体疫苗研制提供了新的思路。 现代 免疫理论认为， 有效的保护性免疫源于一组表位的合理组合与搭配(吴玉章,免疫识别、 分 子设计与抗原工程 . 第三军医大学学报 ,2000(10)。

13、:917-918)。理想的疫苗分子中应同时 包含目的抗原 B 细胞表位和自身或外源 T 细胞表位， 可诱导出高度特异性的体液或细胞免 说 明 书 CN 105820228 A 3 2/9 页 4 疫反应， 并由此赋予较广的保护性。表位疫苗恰好可以满足这些条件。它不仅能够组合具 有高度抗原性的表位， 避开天然蛋白的空间位阻， 而且可选择能够被大多数个体识别的保 守区， 从而增加了疫苗的安全性 (Rosa,D.S.,S.P.Ribeiro and E.Cunha-Neto,CD4+T cell epitope discovery and rational vaccine design.Arch I。

14、mmunol Ther Exp(Warsz),201 0.58(2):p.121-130)。 0006 现有研究证实， 表位疫苗能够诱导产生与全蛋白相当或者更强的免疫反应。表位 疫苗最常用的组合方式是优势 B 表位、 Th 表位和 CTL 表位基因或者表位肽串联连接。在 构建表位疫苗时， 考虑到 CD4+T 细胞在适应性免疫功能中所起的作用， 含有适合的 Th 细胞 表位对于疫苗的有效性是十分必要的 (Rosa,D.S.,S.P.Ribeiro and E.Cunha-Neto,CD4+T cell epitope discovery and rational vaccine design.A。

15、rch Immunol Ther Exp(Wars z),2010.58(2):p.121-130)。在体液免疫中， CD4+T 细胞中的 Th2 细胞可促进 B 细胞分化成 浆细胞产生中和抗体， 以及促使辅助记忆性 B 细胞对再感染迅速唤起回忆反应。研究表明， 在构建表位疫苗时加入适合的 CD4+T 细胞表位， 有助于提高疫苗的保护效果。 0007 Th 细胞即辅助性 T 细胞 (helper T cell,Th)。Th 细胞主要分为 Th1 细胞与 Th2 细胞两种， 其中， Th1细胞参与细胞免疫和迟发性超敏性炎症反应 ； Th2可辅助B细胞分化为 抗体分泌细胞， 参与体液免疫应答。 0。

16、008 Th 细胞是根据功能分类的一个 T 细胞亚群。据其分泌的细胞因子的不同可分为 Th0、 Th1、 Th2 和 Th3 四个亚型。Th1 细胞主要分泌白细胞介素 (interleukin， IL)-2， 干扰 素 (interferon， IFN)-， IFN-a， 肿瘤坏死因子 (tumor necrosis factor， TNF)- 等， 主 要介导细胞毒和局部炎症有关的免疫应答， 辅助抗体生成， 参与细胞免疫及迟发型超敏性 炎症的发生。Th2 细胞主要分泌 IL-4,IL-5,IL-6 和 IL-10 等， 主要功能为刺激 B 细胞增殖 并产生免疫球蛋白 G(immunoglob。

17、ulinG， IgG)1 和免疫球蛋白 E(immunoglobulinE， IgE) 抗 体， 与体液免疫有关。TH2 辅助细胞主要为对抗细胞外多细胞寄生虫的免疫反应， 其主要为 白介素 4(IL-4) 所驱动诱发， 其主要的执行的细胞因子是 IL-4,IL-5&IL-13， 其最重要的执 行细胞为肥大细胞 (Mast cell) 嗜酸细胞 (Eosinophil) 及嗜碱细胞 (Basophil) 另外还有 产生 IgE 的 B 细胞以及分泌 IL-4/IL-5 的 CD4T 细胞等、 其主要的转录因子为 STAT6 另外还 有 GATA 等等。CD4T 细胞分泌的 IL-5 会活化嗜酸细。

18、胞， 使其能够攻击细胞外寄生虫， 另外 IL-4&IgE会活化肥大细胞而放出组织胺(histamine)血清素(serotonin)等造成气管收缩 腹泻及肠蠕动而排出寄生虫。 0009 目前一般认为 ： 在旋毛虫感染过程中， 宿主的免疫保护作用主要基于 Th2 细胞介 导的体液免疫反应。研究发现， 排虫数目较多的小鼠， 其 Th2 细胞因子占优势， 特异性抗体 IgG1 呈高水平 ； 而排虫数目较少的小鼠， 其 Th1 细胞因子占优势， 抗体 IgG2a 升高。如果寻 找到 Ts-Pmy 的 Th2 表位， 并将其与保护性 B 细胞表位构建成表位肽嵌合疫苗， 诱导机体向 Th2型免疫应答定向发。

19、展。 不仅可以避免全蛋白分子中那些不利表位的影响， 而且应该能够 增强 B 细胞表位的免疫保护效果。 0010 故此， 需要筛选获得 Ts-Pmy 的 Th2 表位， 并可将其与前期筛选获得的具有保护性 的Ts-Pmy的B细胞表位构建成表位肽嵌合疫苗， 以期对旋毛虫感染及其所致疾病进行有效 地防治。 说 明 书 CN 105820228 A 4 3/9 页 5 发明内容 0011 本发明人经过深入的研究和创造性的劳动， 得到了一种分离的多肽。所述多肽为 Ts-Pmy的抗原表位， 特别是Ts-Pmy的Th2表位。 本发明人惊奇地发现， 该多肽能够刺激Th0 细胞向Th2细胞分化， 免疫小鼠后均可。

20、诱导产生Th2免疫反应， 具有应用于制备疫苗例如表 位疫苗特别是多表位疫苗的潜力。由此提供了下述发明 ： 0012 本发明的一个方面涉及一种分离的多肽， 其为或者包含 SEQ ID NO ： 2 5 中任一 项所示的氨基酸序列。SEQ ID NO ： 2 5 依次命名为 P2、 P3、 P4 以及 P5。 0013 P2 ： Q F E I D R L A A A L A D A E (SEQ ID NO ： 2) 0014 P3 ： K K Q A D Q L R A L Q S S F E (SEQ ID NO ： 3) 0015 P4 ： E A T Q R E L R A T Q A 。

21、E L Q (SEQ ID NO ： 4) 0016 P5 ： A I A Q R K L S A L S A E L E (SEQ ID NO ： 5) 0017 所述多肽为 Ts-Pmy 的抗原表位， 特别是 Ts-Pmy 的 Th 表位， 具体为 Ts-Pmy 的 Th2 表位。 0018 本发明的另一方面涉及一种分离的多核苷酸， 其编码本发明任一项所述的多肽。 0019 本发明的再一方面涉及一种抗原表位偶联物， 包括抗原表位和偶联部分， 其中， 所 述抗原表位为本发明任一项所述的任一多肽， 所述偶联部分为选自放射性核素、 药物、 毒 素、 细胞因子、 酶、 荧光素、 载体蛋白和生物素中。

22、的一种或多种 ； 具体地， 所述偶联部分为载 体蛋白 BSA 或 KLH。 0020 本发明的再一方面涉及一种组合物， 其包含一种或多种 ( 例如选自 SEQ ID NO ： 2、 3、 4和/或5所示的多肽)本发明任一项所述的多肽， 和/或一种或多种本发明所述的抗原 表位偶联物， 以及任选的药学上可接受的辅料例如佐剂 ； 具体地， 所述组合物为疫苗制剂 ； 具体地， 所述疫苗制剂为表位疫苗制剂 ； 更具体地， 所述表位疫苗制剂还包含一个或多个 “Ts-Pmy 的 B 细胞表位” ； 特别具体地， 所述 Ts-Pmy 的 B 细胞表位为选自 SEQ ID NO ： 13 17 中任一项所示的氨。

23、基酸序列。 0021 ALSTPTFSTLPA (SEQ ID NO ： 13) 0022 LPWHFKSRHRYQ (SEQ ID NO ： 14) 0023 SHWNSHSTPARA (SEQ ID NO ： 15) 0024 LSTPYSKSQAST (SEQ ID NO ： 16)。 0025 上 述 Ts-Pmy 的 B 细 胞 表 位 SEQ ID NO ： 13 16 可 以 参 考 中 国 专 利 ZL 201110448420.2( 公开号为 CN 102558306A)。 0026 EEAEGTTDAQIDANRKRESE(SEQ ID NO ： 17) 0027 上述 T。

24、s-Pmy 的 B 细胞表位 SEQ ID NO ： 17 可以参考 Junfei Wei,Yuan Gu,Jing Yang,Yaping Yang,Shaohua Wang,Shijuan Cui,Xinping Zhu,Identification and characterization of protective epitope of Trichinella spiralis paramyosin,Vaccine 29(2011)31623168。 0028 本发明的再一方面涉及任意一种或者几种本发明所述的多肽或者本发明所述的 抗原表位偶联物在制备治疗和 / 或预防旋毛虫感染的药物中。

25、的用途。 0029 本发明的再一方面涉及一种在体外抗旋毛虫的方法， 包括使用有效量的任意一种 或者几种本发明任一项所述的多肽或者本发明所述的抗原表位偶联物的步骤。 在本发明的 说 明 书 CN 105820228 A 5 4/9 页 6 一个实施方案中， 所述方法是非治疗目的的。 0030 本发明的再一方面涉及任意一种或者几种本发明所述的多肽或者本发明所述的 抗原表位偶联物在制备促进或刺激脾淋巴细胞分泌 IL-4、 IL-5、 IFN- 和 / 或 IL-2 的药物 或试剂， 或者在制备刺激 / 促进 Th0 细胞向 Th2 细胞分化的药物或试剂中的用途。 0031 本发明的再一方面涉及一种抗。

26、体， 其能够特异性地结合本发明任一项所述的多肽 或者本发明所述的抗原表位偶联物。 0032 在本发明中， 术语 “特异性结合” 具有免疫学的一般含义， 例如抗原抗体间的结合。 0033 本发明的再一方面涉及一种抗体偶联物， 包括抗体部分和偶联部分， 其中， 所述抗 体部分为本发明任一项所述的抗体， 所述偶联部分为选自放射性核素、 药物、 毒素、 细胞因 子、 酶、 荧光素、 载体蛋白和生物素中的一种或多种。 0034 本发明的再一方面涉及一种药物组合物， 其包含本发明任一项所述的抗体或者本 发明所述的抗体偶联物 ； 可选地， 所述药物组合物还包含药学上可接受的载体或辅料。 0035 本发明中，。

27、 术语 “Th2 免疫反应” ， 如果没有特别说明， 是指 ： 即体液免疫 (humoral immunity)， 即以B细胞产生抗体来达到保护目的的免疫机制。 指B细胞在T细胞辅助下， 接 受抗原刺激后形成效应 B 细胞和记忆细胞。效应 B 细胞产生的具有专一性的抗体与相应抗 原特异性结合后完成的免疫反应。体液免疫的关键过程是产生高效而短命的效应 B 细胞， 由效应 B 细胞分泌抗体清除抗原。产生寿命长的记忆细胞， 在血液和淋巴中循环， 随时 “监 察” ， 如有同样抗原再度入侵， 立即发生免疫反应以消灭之 ( 二次反应 )。 0036 术语 “Th0 细胞” ， 如果没有特别说明， 是指 。

28、： 未接触抗原的 T 细胞被称为 Th 细胞前 体(Thcell precursor)通过接触天然免疫细胞摄取的抗原而分化成一种不确定的状态， 称 为 Th0 细胞。Th1,Th2 细胞均由前体细胞 Th0 分化而来。Th0 细胞既分泌 Th1 型细胞因子 IL-2 和 IFN-， 又分泌 Th2 型细胞因子 IL-4， 可在不同信号的刺激下分化为 Th1 或 Th2 细 胞。 0037 发明的有益效果 0038 本发明的多肽 ( 抗原表位 ) 能够刺激 / 促进脾淋巴细胞显著增殖， 刺激 / 促进小 鼠脾细胞 CD4+T 细胞增高， 刺激 / 促进 Th0 细胞向 Th2 分化， 刺激 / 。

29、促进 Th1 型细胞因子 IFN-、 IL-2 以及 Th2 型细胞因子 IL-4、 IL-5 升高 ； 刺激 / 促进 Th0 细胞向 Th2 细胞分化， 免疫小鼠后均可诱导产生 Th2 免疫反应， 具有应用于制备疫苗例如多表位疫苗的潜力。 附图说明 0039 图 1 ： 脾淋巴细胞增殖实验 ( 表位肽体外鉴定 )。小鼠脾淋巴细胞分别以候选表位 肽及 rTs-Pmy 进行刺激， 结果显示候选 Th 表位肽 P2、 P3、 P4、 P5 及 P12 可刺激脾淋巴细胞 显著增殖 (SI2)。 0040 图 2 ： ELISPOT IL-4( 表位肽体外鉴定 )。 0041 图 3 ： ELISP。

30、OT IL-5( 表位肽体外鉴定 )。 0042 图 4 ： ELISPOT IFN-( 表位肽体外鉴定 )。 0043 图 5 ： ELISPOT IL-2( 表位肽体外鉴定 )。 0044 ELISPOT结果显示 ： 与培养基阴性对照孔相比， 候选Th表位肽P2、 P3、 P4、 P5及P12 均可刺激脾淋巴细胞分泌 Th2 型细胞因子 IL-4 及 IL-5 增高 ( 图 2， 3)， 而 Th1 型细胞因子 说 明 书 CN 105820228 A 6 5/9 页 7 IFN- 及 IL-2 分泌水平接近培养基阴性对照孔 ( 图 4， 5)。 0045 图 6 ： 脾淋巴细胞增殖实验 。

31、( 表位肽体内鉴定 )。候选 Th 表位肽 P2、 P3、 P4、 P5 及 P12 免疫小鼠的脾淋巴细胞分别以各自免疫原候选表位肽进行刺激， 结果显示， 除 P12 外， 其余表位肽均可刺激脾淋巴细胞显著增殖 (SI2)。 0046 图 7 ： 流式细胞仪检测表位肽免疫小鼠 CD4+T 细胞的相对数量变化 ( 表位肽体内 鉴定 )。与 PBS 对照组相比， Th 表位肽 P2、 P3、 P4、 P5、 P12 均刺激小鼠脾细胞 CD4+T 细胞增 高。 0047 图 8 ： ELISPOT 检测 IL-4( 表位肽体内鉴定 )。 0048 图 9 ： ELISPOT 检测 IL-5( 表位肽。

32、体内鉴定 )。 0049 图 10 ： ELISPOT 检测 IFN-( 表位肽体内鉴定 )。 0050 图 11 ： ELISPOT 检测 IL-2( 表位肽体内鉴定 )。 0051 ELISPOT结果显示 ： 与培养基阴性对照孔相比， 候选Th表位肽P2、 P3、 P4、 P5及P12 均可刺激脾淋巴细胞分泌 Th2 型细胞因子 IL-4( 图 8)， P2、 P3、 P4 及 P5 可刺激 Th2 型细胞 因子 IL-5( 图 9) 及 Th1 型细胞因子 IFN-( 图 10) 及 IL-2 增高 ( 图 11)。 具体实施方式 0052 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。

33、。本领域技术人员将会理 解， 下面的实施例仅用于说明本发明， 而不应视为限定本发明的范围。 实施例中未注明具体 技术或条件者， 按照本领域内的文献所描述的技术或条件 ( 例如参考 J. 萨姆布鲁克等著， 黄培堂等译的 分子克隆实验指南 ， 第三版， 科学出版社 ) 或者按照产品说明书进行。所用 试剂或仪器未注明生产厂商者， 均为可以通过市购获得的常规产品。 0053 实施例 1 ： rTs-Pmy 蛋白的制备 0054 Ts-Pmy 质粒菌液为转化有含有副肌球蛋白基因 (Ts-Pmy GenBank accession No. ： EF429310) 读码框全长质粒的大肠杆菌， 等同于公开号为。

34、 CN100999737A( 申请号为 200710000018.1) 的专利申请中实施例 2 制备的转化有副肌球蛋白基因 (Ts86cDNA) 的大 肠杆菌 BL21， 其制备方法亦可以参考该专利申请。参考该专利申请制得重组 Ts-Pmy 蛋白 (rTs-Pmy 蛋白 )。 0055 实施例 2 ： 多肽序列的合成 0056 根据重组 Ts-Pmy 蛋白 (rTs-Pmy 蛋白 ) 的氨基酸序列合成 12 条多肽序列， 如下面 的表 1。其中位置是指在 rTs-Pmy 蛋白上的氨基酸位置。 0057 委托北京奥维亚生物技术有限公司合成。 0058 表 1 ： 多肽序列 0059 说 明 书 。

35、CN 105820228 A 7 6/9 页 8 0060 实施例 3 ： 多肽的体外实验鉴定 0061 1. 实验样品 ： 0062 实施例 1 制备的重组 Ts-Pmy 蛋白 (rTs-Pmy)。 0063 实施例 2 合成的多肽 P1 P12。 0064 2. 实验动物及分组 ： 0065 68周龄BALB/c雌性小鼠随机分为2组， 分别为重组蛋白组和PBS对照组， 每组 6 只。 0066 3. 实验方法 0067 (1) 免疫动物 ： 以每只小鼠 rTs-Pmy 50g( 溶于 50l PBS) 或 PBS 50l 加等 体积佐剂 MONTANIDETM ISA 50V2(Seppi。

36、c 公司 )， 皮下多点免疫小鼠， 于 2 周及 4 周后以同 样剂量加强免疫两次。 0068 (2) 脾淋巴细胞增殖分离 ： 0069 末次免疫一周后， 处死小鼠并分离脾淋巴细胞 ( 按照达科为生物技术有限公司小 说 明 书 CN 105820228 A 8 7/9 页 9 鼠淋巴细胞分离液说明书操作 )。具体步骤如下 ： 0070 A. 断颈处死小鼠， 浸泡于 75的乙醇中 ； 0071 B. 在超净台中取出小鼠脾脏。注意无菌操作 ； 0072 C. 在 35mm 培养皿中放入 4 5mL EZ-SepTMMouse 1 淋巴细胞分离液 ( 取用前 恢复至室温并摇匀 ) ； 0073 D.。

37、 把悬有脾脏细胞的分离液立即转移到 15mL 离心管中， 覆盖 200 500L 的 1640 培养基 ( 保持液面分界明显 ) ； 0074 E.室温， 800g离心30min。 设置较慢的加速度和减速度， 如果有十档， 设为第三档。 离心结束后细胞分层 ； 0075 F. 吸出淋巴细胞层， 再加入 10mL 1640 培养基， 颠倒洗涤。室温， 250g 离心 10min 收集细胞 ； 0076 G. 倾倒上清液， 用无血清培养基或其他培养液重悬细胞， 细胞计数。 0077 (3) 脾淋巴细胞增殖实验 ： 0078 选用 CellTiterAqueous 单溶液细胞增殖检测试剂盒 (Pro。

38、mega) 测试。 0079 A.计数完毕后， 用含有细胞刺激剂的完全培养基(1640培养基， 含10胎牛血清) 稀释脾淋巴细胞 ( 多肽工作浓度 2.5g/ml， rTs-Pmy 工作浓度 15g/ml)， 使细胞的终浓 度为5106个/ml。 每组同时设立阴性对照(不含有刺激物的完全培养基， 其余同实验组) 整块细胞培养板中还要设立 1 组空白对照 ( 不加细胞， 只加入培养基和所有检测试剂 ) ； 0080 B.37 5 CO2温箱孵育 48h ； 0081 C. 融化 CellTiterAQueous One Solution Reagent。室温静止 90 分钟或 37水浴 10 分。

39、钟 ； 0082 D. 在 96 孔板中， 每孔 100l 培养基加 20l CellTiterAQueous One Solution Reagent ； 0083 E. 在 37， 5 CO2的环境下孵育 1 4 个小时 ； 0084 F.490nm 读取吸光度值 ； 0085 G.刺激指数(Stimulation index,SI)计算 ： SI(实验组OD值-空白对照组OD 值 )/( 阴性对照组 OD 值 - 空白对照组 OD 值 )。 0086 (4)ELISPOT 检测小鼠脾细胞分泌的细胞因子 ： 0087 为分析筛选出的多肽诱导 CD4+T 淋巴细胞的极化方向， 首先检测 Th。

40、1 型细胞因子 IFN-及Th2型细胞因子IL-4。 筛选获得的Th2型表位肽进一步检测Th1型细胞因子IL-2 及 Th2 型细胞因子 IL-5。具体步骤如下 ： 0088 A. 包被抗体 ： 用无菌 PBS 将包被抗体按比例稀释 (IFN-1:250， IL-2,IL-4 和 IL-5 为 1:200)， 每孔 100l 加至 ELISPOT 板， 4包被过夜 ； 0089 B. 封闭 ： 弃去包被液， 用封闭液 (RPMI 1640， 含 1的 L- 谷氨酸盐、 10灭活胎牛 血清、 青霉素 104U/ml+ 链霉素 104g/ml)200l/ 孔洗涤一次， 加封闭液 200l/ 孔， 。

41、室温 孵育 2h ； 0090 C. 对照组的设立 ： 每组细胞因子的检测中都设立使用刀豆蛋白 A(Con A) 作为刺 激物的阳性对照， 每孔加 1g 的 Con A。同时还要设立 1 组阴性对照 ( 加细胞， 只加入完全 说 明 书 CN 105820228 A 9 8/9 页 10 培养基和所有检测试剂 ) ； 0091 D.准备脾淋巴细胞悬液 ： 用1640培养基稀释淋巴细胞， 100l/孔， 使每个孔中脾 细胞数量约为 1107个 /ml( 检测 IL-2,IL-4 和 IL-5) 或 510 6/ml( 检测 IFN-)。每个 样本设 2 个复孔 ； 0092 E. 盖上板盖， 3。

42、7 5 CO2温箱孵育 48h( 注意 ： 碰撞会引起细胞移位， 造成斑点模 糊、 拖尾。在整个培养过程中应避免移动、 碰撞培养板， 并尽量减少开关培养箱的次数 ) ； 0093 上述 5 步需在无菌状态下进行操作， 下面步骤不再需要无菌操作。可以在安全柜 外操作。 0094 A. 加检测抗体 ： 培养完毕后， 弃去细胞悬液， 加入 ddH2O， 200l/ 孔洗板， 孵育 5min/ 次， 洗 2 次。随后加入 PBST(PBS， 含 0.05 Tween-20pH 7.2) 洗板， 孵育 5min/ 次， 洗 3 次 ； 按 1:200 用稀释液 (PBS， 含 10灭活胎牛血清， pH 。

43、7.2) 稀释检测抗体， 100l/ 孔 ； 盖上板盖， 室温孵育 2h( 移液器吸取液体时应注意不要划伤膜 ) ； 0095 B. 加入酶标记物 Streptacidin-HRP ： 弃去检测抗体， 以洗涤液洗板 3 次， 2min/ 次 ； 按照说明书要求稀释酶标记物 StreptacidinHRP(1:100)， 100l/ 孔 ； 盖上板盖， 室 温孵育 1h ； 0096 C. 加入显色剂 ： 弃去酶标记物 Streptacidin-HRP， 用洗涤液洗板 4 次， 2min/ 次 ； 用洗涤液 (PBS， pH 7.2) 洗板 2 次， 2min/ 次。按照 AEC 显色试剂盒操作。

44、说明配制和 加入显色剂， 70l/ 孔。每块板需配制 7ml ； 0097 D. 终止反应 ： IFN- 和 IL-2 显色时间 10s 1min， IL-4,IL-6 和 IL-10 显色时间 2 3min。可根据实际显色情况灵活掌握时间， 不要过度显色。待斑点生长至适合的大小 之后， 用 ddH2O 洗涤 2 遍， 终止显色过程。将板倒扣在吸水纸上， 拍干细小的水珠， 室温静置 2 3h， 让 ELISPOT 板底部的结合膜自然风干。注意此处禁止将板放到烤箱内， 否则会导致 膜发脆、 破裂 ； 0098 E. 斑点计数 ： 将 ELISPOT 板置于 CTL ELISPOT 自动读板仪内，。

45、 调整适合的参数， 斑 点计数， 并记录斑点的各种参数， 做统计分析。 0099 4. 实验结果 0100 (1) 脾淋巴细胞增殖实验 ： 小鼠脾淋巴细胞分别以候选多肽及 rTs-Pmy 进行刺激， 结果显示， P2、 P3、 P4、 P5 及 P12 可刺激脾淋巴细胞显著增殖 (SI2， 图 1)。 0101 (2)ELISPOT检测细胞因子 ： ELISPOT结果显示 ： 与培养基阴性对照孔相比， 候选Th 表位肽 P2、 P3、 P4、 P5 及 P12 均可刺激脾淋巴细胞分泌 Th2 型细胞因子 IL-4 及 IL-5 增高 ( 图 2， 3)， 而 Th1 型细胞因子 IFN- 及 。

46、IL-2 分泌水平接近培养基阴性对照孔 ( 图 4， 5)。 此结果表明， P2、 P3、 P4、 P5 及 P12 能刺激 Th0 细胞向 Th2 分化， 为 Ts-Pmy 蛋白的 Th2 表位。 0102 实施例 4 ： 表位肽的体内实验鉴定 0103 1. 实验样品 ： 0104 单个 Th 表位肽 P2、 P3、 P4、 P5、 P12。 0105 2. 实验动物及分组 ： 0106 6 8 周龄 BALB/c 雌性小鼠随机分为 6 组， 分别为 Th 表位肽组和 PBS 对照组， 每 组 6 只。 0107 3. 实验方法 说 明 书 CN 105820228 A 10 9/9 页 。

47、11 0108 (1) 免疫动物 ： 0109 以每只小鼠 50g 单个 Th 表位肽 P2、 P3、 P4、 P5、 P12( 溶于 50l PBS) 或 PBS 50l 加等体积佐剂 MONTANIDETM ISA 50V2(Seppic 公司 )， 皮下多点免疫小鼠， 于 2 周及 4 周后以同样剂量加强免疫两次。 0110 (2) 脾淋巴细胞增殖实验 ： 末次免疫一周后， 处死小鼠并分离脾淋巴细胞， 分 别以候选表位肽进行刺激， 选用 CellTiterAqueous 单溶液细胞增殖检测试剂盒 (Promega) 测试， 计算淋巴细胞刺激指数 (Stimulation index,SI。

48、)。 0111 (3) 表位肽免疫小鼠 CD4+T 细胞的相对数量检测 ： 0112 末次免疫后 10 天， 分离小鼠脾细胞， 以 PBS 洗涤 2 遍， 调整细胞浓度为 1107个 / mL， 分别取 100L 细胞悬液置于两个 1.5ml EP 管中， 实验管加入 PE 标记的抗小鼠 CD4 抗 体、 FITC 标记的抗小鼠 CD3 抗体， 对照管加入 PE 及 FITC 标记的同型抗体， 冰上避光孵育 30min 染色， 洗涤 2 次， 最后用 500L PBS 重悬， 流式细胞仪检测表位肽免疫小鼠 CD4+T 细 胞的相对数量变化。 0113 (4)ELISPOT 检测脾细胞分泌细胞因。

49、子 ： 0114 为分析筛选出的表位肽免疫小鼠后诱导 CD4+T 淋巴细胞的极化方向， 末次免疫后 10 天， 取小鼠脾细胞， 以表位肽为刺激物， 检测 Th1 型细胞因子 IFN-、 IL-2 及 Th2 型细胞 因子 IL-4、 IL-5。 0115 4. 实验结果 0116 (1) 脾淋巴细胞增殖实验 ： Th 表位肽免疫小鼠脾淋巴细胞分别以各种免疫候选表 位肽进行刺激， 结果显示 P2、 P3、 P4 及 P5 可刺激脾淋巴细胞显著增殖 (SI2， 图 6)。 0117 (2) 表位肽免疫小鼠 CD4+T 细胞的相对数量检测 ： 0118 结果显示 ： Th 表位肽 P2、 P3、 P4、 P5、 P12 均刺激小鼠脾细胞 CD4+T 细胞增高， 提示 表位肽免疫后能激发 CD4+T 淋巴细胞应答 ( 图 7)。 0119 (3)ELISPOT 检测脾细胞分泌细胞因子 ： 经表位肽体内鉴定试验， 获得了 4 个可在 体内有效呈递的 Th2 表位肽 P2、 P3、 P4 及 P5。这 4 个肽均可刺激 Th2 型细胞因子 IL-4( 图 10)、 IL-5(图11)增高。 此外， 这4个肽还均可刺激Th。