技术领域
本发明属于分子生物学及遗传育种技术领域。更具体涉及一种油菜含油量性状主效基 因位点及主效基因位点紧密连锁的分子标记，同时还涉及分子标记在油菜含油量育种中的应 用。
背景技术
作为世界四大油料作物之一，油菜生产对保障我国食用植物油脂和饲用蛋白质的有效 供给，对改善食物结构，促进养殖业和加工业发展等诸方面均有重要影响。虽然我国油菜种 植面积和产量均居世界第一，但远不能满足国内的消费需求，63%左右的食用植物油依赖进 口。随着人口数量的增长和人民生活水平的提高，预计到2010年我国食用植物油消费量将 增加到2,500万吨，按目前的生产规模，缺口将更加巨大。尽管油料市场需求如此，农民种 植油菜的积极性却不高。造成这种局面的主要原因之一是我国的油菜籽比主要出口国加拿大 生产的油菜籽含油量5个百分点左右，且成本高，市场竞争力相对较弱。因此，从保障食物 油供给安全和增加农民收入的角度考虑，较大幅度增加单位面积菜籽油的产出量是解决目前 状况的对策之一。
我国油菜研究和育种工作具有较深厚的基础,一些领域处于世界领先地位。油菜高油分 育种的途径主要有多世代的单株选择、种间杂交、黄籽油菜育种和诱变选育。
近年来，随着基因组学研究取得一系列突破，以分子标记选择、转基因和品种分子设计 为代表的分子育种技术的成功应用，大大提高了作物遗传育种水平。与常规育种相比，该技 术可以通过分析与目标性状基因紧密连锁的分子标记判断目的基因的存在与否，并进行精细 定位。同时，利用分子标记进行辅助选择育种，减少了盲目性，缩短育种年限，大大提高了 选择效率。分子标记辅助选择育种技术的关键是与重要农艺性状紧密连锁的DNA分子标记 的鉴定。美国、日本、西欧各国等国家近年都投入巨资开展这方面的工作。伴随着水稻，小 麦、玉米、棉花、大豆等重要作物的一些农艺性状的分子标记的开发，利用鉴定到的分子标 记进行辅助选择育种主要包括种质资源的鉴定、基因定位、基因累加或聚合、异源目的基因 的筛选和鉴定以及遗传图谱的构建等，育种目标包括抗病、抗虫、抗旱、高产、品质改良等 各个方面。随着生物技术的发展，油菜分子标记的研究日渐受到关注，研究的领域涉及遗传 图谱的构建、基因标记和基因定位、亲缘关系分析、品种纯度鉴定、标记辅助选择等多方面， 并取得了重要进展。但与发达国家相比，我国的油菜分子育种研究工作还有较大差距，主要 体现在：不能有效地发掘和利用种质资源中的有利基因，缺乏有自主知识产权及育种价值的 基因和标记等。
Grodzicker等（1974）创立了限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)标记技术。Botstein等(1980)首先提出用限制性片段长度多态性 (restriction fragment length polymorphism,简称RFLP)作为遗传标记构建遗传图谱的设想,从 而开创了利用分子标记作为遗传标记的新时期。随后几十种基于Southern杂交或聚合酶链 式反应(polymerase chain reaction,PCR)的DNA分子标记技术陆续建立,这些DNA分子标 记所检测的多态性在基因组的位置大多为随机分布，因此可以通称为随机DNA分子标记 (random DNA markers，RDMs)。RDMs的发展大大提高了人们对基因组多样性、遗传作图 等的研究效率，并广泛的应用于植物科学的研究中。传统的RFLP、SSR标记辅助选择方法 利用起来费用高，效率低，时间长，SNP作为基因组多态性最丰富的DNA分子标记，其数 量多，分布较其它标记均匀。随着测序技术的发展，SNP芯片的开发和利用大大加快了QTL 鉴定和克隆的速度。
大多数重要的农艺性状均表现数量性状的遗传特点，如产量性状、成熟期、品质、抗旱 性等。数量性状易受环境条件的影响，因此选择效果不好。传统育种方法周期长，主要是由 数量性状造成的。由于分子标记技术的发展，人们已可将复杂的数量性状进行分解，象研究 质量性状基因一样对控制数量性状的多个基因进行研究。QTL是在高密度的遗传图谱基础 上，通过一定实验设计，获得分子标记，借助Mapmarker软件分析确定控制某一性状的基 因在染色体上的位置。当目标性状由少数几个基因控制时用标记选择，对发掘遗传潜力非常 有效。
目前对油菜种子含油量的QTL定位研究也有一些报道，通常检测出的QTL数目较多， 但效应值较小，较难在油菜育种中应用。本研究通过遗传分析及QTL定位，旨在筛选对种 子含油量具有正向效应的QTL，用于油菜含油量的标记辅助选择。
发明内容
本发明目的是在于提供了一种油菜含油量性状的一个主效基因位点61616A8OC。该主 效基因位点不但有助于深入了解61616品系中含油量QTL位点的作用和分布，同时为今后 含油量主效基因的克隆提供了一定的基础。
本发明的另一个目的是在于提供了一种与油菜含油量性状主效基因位点紧密连锁的两个 分子标记61616A8OC-1和61616A8OC-2。与含油量紧密连锁的分子标记对今后61616及其 衍生品系的含油量性状育种提供了极大的便利。
本发明的再一个目的是在于提供了一种油菜含油量性状的主效基因位点在油菜高含油量 性状育种中的应用。利用该标记能快速筛选到高油材料，从而在苗期就能进行高油材料筛选， 降低了育种成本，节省了人工费用。
为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：
一种油菜含油量性状主效基因位点的发掘方法，它包括如下步骤：
a)利用油菜高低含油量组合61616（50%）和Y817（35%）进行杂交，F1代自交产生F2 代分离群体；
b)提取亲本61616和Y817、F1代及F2代分离群体的叶片总DNA，过程中所用到的试 剂包括CTAB提取液（0.2M Tris－Cl，0.25NaCl，25mM EDTA，0.5%（质量比）SDS，pH 7.5）、氯仿、异戊醇、无水乙醇；
c)利用Illumina公司研制的60K油菜SNP芯片对油菜两亲本及F2分离群体DNA样品进 行分型。在亲本中筛选到有多态性的SNP位点后，获得多态性SNP位点在F2群体中的分 布；
d)通过在F2代分离群体中的分布构建遗传图谱，借助含油量数据进行QTL位点分析， 并得到与含油量性状主效基因紧密连锁的5个SNP标记，其中两个转化成方便检测的SNP 标记61616A8OC-1和61616A8OC-2。过程中所用到的主要软件包括Joinmap3.0、WinQTL cart4.0（商业途径获得）。
本研究中所用的亲本材料为含油量相差近15个百分点的61616（50%）和Y817（35%）， 均由中国农科院油料所生物技术育种课题组技术人员在王汉中研究员带领下育成。61616品 系是由以中双6号与油研7号杂交获得的F1为母体，以中双8号作父本进行复合杂交，获 得基础群体，选优良单株进行小孢子培养和染色体加倍，最终经高油定向选择得到（所有权 归本课题组所有）。Y817是杂交品种中油杂1号的保持系（中油杂一号制种技术研究与应用， 农村经济与科技，2001年第10期）。油菜两亲本、F1及F2分离群体单株含油量的测定由 近红外分析仪完成，植物叶片总DNA的提取、PCR及聚丙烯酰胺凝胶电泳均为常用的分子 生物学技术，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989），或Draper等人(Blackwell科学出版社,1988)所述的条 件进行。实验过程中涉及的所有试剂成分（具体实施方式中所列）均可从商业途径获得，并 按照实验手册中的条件或所用试剂制造厂商所建议的条件使用。
利用上述技术措施，申请人最终获得了含油量性状相关的一个主效基因位点，具体如下： 一种分离的油菜含油量性状的主效基因位点,该基因位点位于第A8染色体，该主效基因位 点的分子标记为61616A8OC-1和61616A8OC-2，其引物序列分别为：61616A8OC-1F： 5’-TGCAGTGTAGAATATAGAGG-3’; 61616A8OC-1R ： 5’-GGACTTAGGGCATCTCTAATG-3’ ； 61616A8OC-2F ： 5’-GAGAGATGCATAACCAAGTC-3’; 61616A8OC-2R: 5’-CTGGTAACCCGAGCTGGACG-3’。61616A8OC，该主效基因位点位于第A8染色体，由 61616A8OC-1和61616A8OC-2（自主开发SNP标记）定位，其引物序列为61616A8OC-1 和61616A8OC-2。利用Joinmap3.0软件分析测得与含油量性状（2010年、2011年和2012 年三年数据）不相关的概率P值为0.0001，三年的贡献率分别为15.12%，20.23%和17.78%；
所述的QTL是quantitative trait locus的缩写，中文可以翻译成数量性状座位或者数量性 状基因座，它指的是控制数量性状的基因在基因组中的位置。对QTL的定位必须使用遗传 标记，人们通过寻找遗传标记和感兴趣的数量性状之间的联系，将一个或多个QTL定位到 位于同一染色体的遗传标记旁，换句话说，标记和QTL是连锁的。近几年QTL定位应用的 较为广泛，在人类基因上与疾病有关的基因定位甚多；植物上，模式植物抗逆性基因的定位 较多。
一种油菜含油量性状的主效基因位点在油菜高含油量性状育种中的应用，其步骤是：
A、利用61616高油品系与另一高产但含油量仅为40%左右的品种中双6号杂交后种植 F2代，在F2代苗期利用主效位点的分子标记引物61616A8OC-1和61616A8OC-2进行分子 鉴定。
B、种子收获后的含油量测试结果表明，通过分子标记辅助选择得到的植株含油量超过43% 的占83%。
C、通过鉴定上述主效基因位点来预测油菜种子含油量，可迅速提高油菜高含油量品种的 育种进程。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：
本发明首次定位了油菜品系61616中的一个含油量性状主效基因位点，可解释含油量 20.23%的变化，使得油菜含油量性状主效基因位点的定位工作居于同领域前列。传统育种 方法中，表型鉴定要等到收获种子测定含油量，且受环境影响较大。因此含油量育种不仅费 时，而且难度大，成本高。通过检测含油量性状主效QTL位点，可以在苗期进行淘汰，不 仅节约生产成本而且大大提高选择效率。本发明中含油量主效基因位点位置明确，主效基因 位点的检测方便快速，不受环境影响。通过检测与含油量性状相关的分子标记，即可以预测 含油量的高低，进而可以快速筛选高含油量株系用于油菜含油量育种，辅助育种选择目标明 确，节约成本。
附图说明
图1为一种武汉阳逻F2群体、F2:3家系含油量分布图。
结果表明含油量表现分布呈连续性分布，变异分布呈正态分布，且变异范围很宽，证明 含油量属于数量性状。
图2为一种位于A8染色体上的QTL位点（三年群体数据）。
图3为一种根据2010F2含油量数据分析61616A8OC含油量性状主效基因位点。
图4为一种分子标记61616A8OC-1和61616A8OC-2在F2代株系中的筛选。
图中1、4、5、6、7、9、10号为高含油量株系。
具体实施方式
通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989），或Draper等人(Blackwell科学出版社,1988)所述的条件， 或按照所用试剂制造厂商所建议的条件。
实施例1：
高低含油量油菜品系组合F2分离群体的构建及F2、F2:3家系含油量的测定
本实施例中使用的群体为高低含油量亲本（含油量分别为50%的61616和35%的Y817）杂 交后代--F2代。亲本、F1及F2种子含油量由近红外分析仪测定。F2代分离群体含油量数据分 布结果表明含油量表现分布呈连续性分布，变异分布呈正态分布，且变异范围很宽，证明含 油量属于数量性状（图1）。
实施例2：
亲本、F1及F2分离群体叶片总DNA的提取
利用CTAB法提取叶片总DNA，具体步骤如下：
A.适量叶片样品取自超低温冰箱（-70℃），立即放入冰冻过的研钵中，加入液氮研磨成 粉状；快速装入50ml离心管中，加入在60℃的水浴锅中预热过的提取液（0.2M Tris－Cl， 0.25NaCl，25mM EDTA，0.5%（质量比）SDS，pH7.5），混合均匀，放入60℃的水浴锅 中水浴40min；
B.取出离心管，加入等体积氯仿：异戊醇（24：1，V/V），缓慢上下颠倒离心管30-50 次，使充分混匀，1300g离心10分钟；
C.取上清于另一离心管中，加入等体积氯仿：异戊醇（24：1，V/V），重新抽提一次。 取上清加入0.6倍体积冰冷异戊醇，缓慢颠倒离心管，直至有絮状沉淀集结为止。静止30min， 挑出沉淀，70%（体积比）酒精洗2-3次，无水乙醇洗一次，干燥后加无菌水65℃20min溶 解；
D.再次加入等体积氯仿：异戊醇（24：1，V/V），重新抽提。取上清，加入0.1倍NaAc （3mol/L，PH5.2），混匀后缓慢加入2倍体积的冰无水乙醇，静止5min后缓慢转动离心管 直至絮状沉淀出现，挑出沉淀转入1.5ml离心管中，70%（体积比）酒精洗2-3次，无水乙 醇洗一次，干燥后加无菌水溶解，于-20℃冰箱中保存备用。
实施例3：
SNP芯片分析61616、Y817两亲本及F2分离群体的基因型及连锁分析
利用Illumina公司研制的60K油菜SNP芯片对油菜两亲本及F2分离群体DNA样品进 行分型。在亲本中筛选到有多态性的SNP位点后，分析其在F2群体中的分布。通过在F2 代分离群体中的分布进行数据分析，根据连锁交换规律，利用群体基因型资料构建油菜的遗 传图谱，所用软件为Joinmap3.0，最小LOD值设为2.5，获得连锁图谱（图2为A8染色体 连锁群图谱）。将F2群体的105个单株的含油量数据及多态性引物的分布情况输入计算机， 运行WinQTL cart4.0软件对数据进行关联性分析，单向方差分析测得与含油量性状相关的 概率P值和位点对含油量性状的贡献率（表2，图3）。结果表明，P<0.0001的SNP分子标 记即与主效基因位点连锁。利用SNP位点差异及基因组序列开发出两对SNP标记引物，可 直接PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳分型用于标记辅助选择育种（表1）。PCR反应体系为：20ul 体系，DNA模板1ul（浓度为50ng/ul），上下游引物各1ul（浓度均为10umol），dNTP0.5ul， Taq酶0.5ul（5u/ul），MgCl22ul，ddH2O14ul。反应的时间和温度作如下：94℃3min，94℃ 45s，62℃45s，72℃30s，30cycles，72℃5min。PCR产物用2%（质量比）琼脂糖凝胶电 泳检测。
表1标记引物的序列
标记 上游引物 下游引物 61616A8OC-1 TGCAGTGTAGAATATAGAGG GGACTTAGGGCATCTCTAATG 61616A8OC-2 GAGAGATGCATAACCAAGTC CTGGTAACCCGAGCTGGACG
表261616品系含油量性状主效基因位点的单向方差分析
数据年份 主效基因位点 标记 P值 贡献率 2010F2 61616A8OC 61616A8OC-1、61616A8OC-2 0.0001 15.12% 2011F2:3 61616A8OC 61616A8OC-1、61616A8OC-2 0.0001 20.23% 2012F2:3 61616A8OC 61616A8OC-1、61616A8OC-2 0.0001 17.78%
实施例5：
分子标记61616A8OC-1和61616A8OC-2在含油量育种中的应用，其步骤是：
A、利用61616高油品系与另一高产但含油量仅为40%左右的品种中双6号杂交后种植 F2代，在F2代苗期进行分子鉴定。具体步骤包括F2分离群体叶片总DNA的提取（见实 施例2）、PCR鉴定（见实施例3）等。
B、结果如图4中61616A8OC-1引物所扩增的F2不同单株的条带所示，2号圆圈中的 条带在高含油量株系中不存在。因此，在F2代中1、4、5、6、7、9、10号油菜苗即可保 留下来。种子收获后的含油量测试结果表明，通过分子标记辅助选择得到的植株，多数单株 种子含油量超过43%（表3）。
C、通过检测与含油量性状相关的分子标记，即可以预测含油量的高低，在苗期进行淘 汰，不仅节约生产成本而且大大提高选择效率，进而可以快速筛选高含油量株系用于油菜含 油量育种。
表3
编号 含油量 编号 含油量 L11-1 43.15 L11-37 44.15 L11-4 44.03 L11-42 45.28 L11-5 43.68 L11-47 43.74 L11-6 45.84 L11-58 44.23 L11-7 44.22 L11-60 43.51 L11-9 43.19 L11-64 44.22 L11-10 43.75 L11-65 43.02 L11-15 45.04 L11-68 43.61 L11-18 43.78 L11-75 43.51 L11-23 44.20 L11-79 43.45 L11-29 43.19 L11-83 43.34 L11-30 45.25 L11-89 44.72 L11-36 43.88 L11-96 45.22
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院油料作物研究所
<120> 油菜品系61616中含油量性状主效基因位点及应用
<130> 油菜品系61616中含油量性状主效基因位点及应用
<160> 4
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
tgcagtgtag aatatagagg 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
ggacttaggg catctctaat g 21
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
gagagatgca taaccaagtc 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
ctggtaaccc gagctggacg 20